柳惠榮

[摘要] 目的 研究口腔扁平苔蘚（OLP）患者血清和唾液中IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α濃度變化及其臨床意義。 方法 選取2017年6月至2020年8月就診于菏澤市中醫(yī)醫(yī)院口腔科門診的31例患者，分為糜爛型（EOLP）和非糜爛型（NEOLP）兩組，健康志愿者30名（對照組）。采用流式微球分析方法（CBA）應(yīng)用流式細胞儀測定血清和唾液標(biāo)本IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α濃度。 結(jié)果 分別與健康對照組比較，治療前EOLP組、NEOLP組血清和唾液中IL-8細胞因子濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而EOLP組和NEOLP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;三組之間IL-1β、IL-5、IL-12和 IFN-α細胞因子濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。三組血清和唾液各細胞因子濃度之間呈正相關(guān)，但相關(guān)程度較低（P>0.05）。 結(jié)論 血清和唾液中IL-8增高是促進OLP病理變化的部分原因。

[關(guān)鍵詞] 扁平苔蘚;口腔;白介素-1β;白介素-5;白介素-8;白介素-12;干擾素-α;流式微球分析方法

[中圖分類號] R781.5? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）30-0034-05

[Abstract] Objective To study the concentrations changes of IL-1β，IL-5，IL-8，IL-12 and IFN-α in serum and saliva of patients with oral lichen planus （OLP） and their clinical significance. Methods A total of 31 patients who were admitted to the stomatology clinic in Heze Hospital of Traditional Chinese Medicine from June 2017 to August 2020 were selected and divided into two groups：the erosive oral lichen planus （EOLP） group and the non-erosive oral lichen planus （NEOLP） group. Another 30 healthy volunteers were selected as the control group. The concentrations of IL-1β，IL-5，IL-8，IL-12 and IFN-α in serum and saliva specimens were determined by cytometric bead array （CBA） using a flow cytometer. Results According to the separate comparison of the healthy control group with EOLP group or the NEOLP group before treatment，there were statistically significant differences in terms of IL-8 cytokine concentrations in serum and saliva （P<0.05），while the difference between the EOLP group and the NEOLP group was not statistically significant （P>0.05）. There were no statistically significant differences in terms of concentrations of IL-1β，IL-5，IL-12 and IFN-α among the three groups （P>0.05）. There was low positive correlation in terms of correlation with cytokine concentrations in serum and saliva among the three groups （P>0.05）. Conclusion The increase in concentration of IL-8 in serum and saliva is part of the reason that promotes the pathological changes of OLP.

[Key words] Lichen planus; Oral cavity; Interleukin-1β; Interleukin-5; Interleukin-8; Interleukin-12; Interferon-α; Cytometric bead array

口腔扁平苔蘚（Oral lichen planus，OLP）是一種常見的慢性口腔黏膜皮膚疾病，其發(fā)病與精神因素（如疲勞、焦慮、緊張）、免疫因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、微循環(huán)障礙等因素有關(guān)。一般根據(jù)病變黏膜的受損情況分為糜爛型（Erosive oral lichen planus，EOLP）和非糜爛型（Non-erosive oral lichen planus，NEOLP）。細胞因子主要包括一些小分子多肽，由多種免疫細胞分泌，在免疫應(yīng)答過程中，細胞因子對于細胞之間相互作用、細胞的分化有重要調(diào)節(jié)作用。最近研究表明，OLP患者的黏膜損害因素中有細胞因子參與[1-2]。本研究應(yīng)用流式細胞儀采用流式微球分析方法（Cytometric bead array，CBA）測定OLP患者血清和唾液中IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α細胞因子的水平，有利于更深入地了解OLP的發(fā)病機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2017年6月至2020年8月就診于菏澤市中醫(yī)醫(yī)院口腔科門診的OLP患者31例，其中NEOLP型16例，男7例，女9例，中位年齡39（17～64）歲; EOLP型15例，男6例，女9例，中位年齡38（17～62）歲。以我院健康志愿者30名作為正常對照，男14例，女16例，中位年齡39（17～64）歲。所有研究對象均簽署知情同意書。三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 實驗組納入標(biāo)準(zhǔn)? 經(jīng)詳細詢問患者病史，常規(guī)口腔檢查，根據(jù)臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)檢查，診斷為口腔扁平苔蘚患者，并符合：①3個月內(nèi)沒有服藥史;②無全身性疾病，如嚴(yán)重高血壓、2型糖尿病、惡性腫瘤;③無OLP外的其他口腔黏膜疾病。

1.2.2 對照組納入標(biāo)準(zhǔn)? 同期至我院進行體檢且體檢結(jié)果顯示身體健康，既往無扁平苔癬等疾病病史。

1.3方法

1.3.1 主要試劑和儀器? FACSCalibur流式細胞儀（BD公司，美國），細胞因子檢測試劑盒（江西諾德醫(yī)療器械有限公司，中國）。

1.3.2 OLP組及健康組標(biāo)本收集? ①靜脈血采集：治療前患者及對照組（體檢者）早晨采血，空腹要求至少禁食8 h，離心（2500 g，15 min）后留取血清標(biāo)本2 mL。②唾液標(biāo)本采集：空腹于上午9：00收集非刺激性全唾液2 mL，立即進行離心（3500 g，15 min）后留取唾液標(biāo)本。血清及唾液標(biāo)本均貯存于-80℃待測。

1.3.3 IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α細胞因子濃度檢測? 在室溫下進行實驗，檢測前取出標(biāo)本置于室溫（22℃～24℃），應(yīng)用流式細胞儀分別檢測血清和唾液中IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α細胞因子濃度。加25 μL捕獲微球混合液于待測標(biāo)本試管中，加入微球緩沖液25 μL，暗盒內(nèi)放置30 min，之后加熒光檢測試劑和待測樣本各25 μL于試管中，旋渦振蕩后暗盒內(nèi)放置2.5 h。每個試管中加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液，離心（200 g，5 min），吸去上清，再加入0.3 mL磷酸鹽緩沖溶液檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 22.0版本統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組指標(biāo)間的差異應(yīng)用One-way ANOVA方法分析，各組間數(shù)據(jù)兩兩比較應(yīng)用Scheffe檢驗方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。唾液和血清中的IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α細胞因子濃度間的相關(guān)性采用皮爾森相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 OLP患者和健康對照組血清IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α濃度表達水平比較

NEOLP組和EOLP組血清IL-8濃度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），NEOLP組和EOLP組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;而三組IL-1β、IL-5、IL-12和 IFN-α濃度相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 OLP患者和健康對照組唾液IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α濃度表達水平比較

與健康對照組比較， EOLP組、NEOLP組唾液中IL-8濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），EOLP組和NEOLP組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;而三組之間IL-1β、IL-5、IL-12和IFN-α濃度相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 OLP患者與健康對照組唾液中和血清中的IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和IFN-α細胞因子濃度間的相關(guān)性

EOLP組、NEOLP組與健康對照組唾液和血清中的IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α細胞因子濃度呈正相關(guān)，但相關(guān)程度較低（P>0.05）。見表3。

3 討論

OLP發(fā)病機制包括多種因素，目前傾向于免疫學(xué)說，即細胞介導(dǎo)的局部免疫應(yīng)答紊亂在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。OLP患者多無自覺癥狀，常偶然發(fā)現(xiàn)。有些患者遇熱、酸、辛辣、咸味刺激時，局部敏感灼痛;或有木澀感、燒灼感，口干。臨床上主要包括非糜爛型和糜爛型，這兩種類型的發(fā)病機制是否不同，研究較少，本研究采用流式微球分析方法分別測定這兩種類型的細胞因子濃度，以觀察是否存在差異。CBA是集 ELISA 和細胞流式技術(shù)優(yōu)點為一身的液相蛋白檢測技術(shù)，其基本原理類似于ELISA的檢測，即利用微小分散的顆粒捕獲液體待測物，并利用流式細胞儀檢測類似"三明治"的顆粒-待測物復(fù)合體所散發(fā)的熒光，從而測定待測物的數(shù)量。其優(yōu)點為能夠同時對多種蛋白進行定量檢測，對樣本需求量更少，檢測更快速、更準(zhǔn)確[2-3]。IL-1β是機體重要的炎癥因子，主要由單核-巨噬細胞分泌，生物學(xué)作用包括兩個方面，局部低濃度情況下發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)，協(xié)同刺激抗原和T細胞活化，促進B細胞增殖和分泌抗體;高濃度產(chǎn)生發(fā)揮內(nèi)分泌效應(yīng)，誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白合成，引起發(fā)熱和惡病質(zhì)。IL-1β與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程關(guān)系密切。EMT通常發(fā)生在上皮細胞，表現(xiàn)為細胞連接與極性的喪失，獲得間質(zhì)細胞的表型特征。細胞表現(xiàn)為極性的喪失、黏附性降低、遷移能力增強，而這些正是腫瘤細胞的特征。通過EMT成像系統(tǒng)動態(tài)研究表明，在結(jié)直腸癌腫瘤細胞周圍的炎癥微環(huán)境中，巨噬細胞釋放TNF-α和IL-1β，與腫瘤的EMT過程及疾病進展有關(guān)[4]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤局部單核細胞釋放的IL-1β和IL-18能夠促進腫瘤的發(fā)展，小檗堿能夠逆轉(zhuǎn)EMT過程，抑制這些炎癥細胞因子的產(chǎn)生，抑制膠質(zhì)瘤細胞株U251和U87的遷移，導(dǎo)致細胞死亡[5]。本研究結(jié)果顯示，OLP患者血清及唾液中IL-1β水平均無變化，推測IL-1β在OLP患者的病變過程中尤其是EMT過程未發(fā)揮重要作用。

IL-8由單核巨噬細胞分泌，其受體分為兩類：趨化因子受體1和2（C-X-C chemokine receptor，CXCR1和CXCR2）。IL-8 是一種多功能因子，其生物學(xué)功能無種屬特異性，主要介導(dǎo)細胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答輔助抗體生成，參與細胞免疫及遲發(fā)型超敏型炎癥的發(fā)生。IL-8可以吸引和激活中性粒細胞，中性粒細胞與IL-8接觸后發(fā)生形態(tài)變化，定向游走到反應(yīng)部位并釋放一系列活性產(chǎn)物;這些作用可導(dǎo)致機體局部的炎癥反應(yīng)，達到殺菌和細胞損傷的目的。IL-8還可以招募嗜中性粒細胞，刺激血管生成和腫瘤細胞的增殖，較高的IL-8水平與腫瘤分級/分期更晚、腫瘤負荷更高有關(guān)。IL-8 還參與EMT變化，抑制腫瘤內(nèi)的 IL-8 信號傳導(dǎo)可延緩腫瘤進程并可增加多種實體瘤對臨床化療的敏感度[6]。部分OLP患者存在Akt/mTOR/pS6信號通路的活化，參與癌前病變的發(fā)生[7]。IL-8可通過自分泌和旁分泌方式，激活 AKT 信號通路，誘導(dǎo)EMT過程，IL-8不僅可以促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，更是預(yù)示癌癥患者不良預(yù)后的細胞因子。體外實驗表明，IL-8及其受體CXCR1 和 CXCR2與卵巢癌轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，IL-8通過激活Wnt/β-catenin信號通路，誘導(dǎo)EMT，促進卵巢癌細胞遷移。Reparixin是一種CXCR1/2抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)內(nèi)源和外源性IL-8的這種作用[8]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide，pg. LPS）刺激OLP患者的口腔成纖維母細胞（Myofibroblasts），其表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），可以分泌IL-6、IL-8和TNF-α等細胞因子[9]。

IL-5又稱嗜酸性粒細胞分化因子，由活化T細胞產(chǎn)生，小鼠IL-5促進抗原刺激的B細胞分化為抗體合成細胞，促進抗體合成，IL-5對嗜酸性粒細胞的影響主要表現(xiàn)在分化、遷移、活化和存活等4個方面，在過敏性疾病及寄生蟲感染后的病理損傷過程中，IL-5也發(fā)揮重要作用。IL-5還可以促使嗜酸粒細胞釋放毒性蛋白，導(dǎo)致過敏性哮喘患者的氣道反應(yīng)性增高[10]。IL-5在OLP患者的變化及其發(fā)病中的作用研究較少。Wang等[11]報道OLP患者血清IL-5水平降低。本研究結(jié)果顯示，OLP患者血清及唾液中IL-5水平均無變化，因此需要進一步研究。IL-12是一種具有多種生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)因子，促進Th0細胞向Th1細胞分化;能夠刺激T細胞及NK細胞的增殖，促進細胞毒T細胞和NK細胞的活性，并促進其分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，在抗腫瘤及抗感染中發(fā)揮重要作用。黃韻穎等[12]采用ELISA法測定OLP患者血清中IL-12與IL-27表達濃度均高于對照組，認為本病主要表現(xiàn)為細胞免疫功能受損為主，IL-12和IL-27濃度增高共同促進患者的炎癥狀態(tài)變化。本研究采用流式細胞術(shù)檢測OLP患者血清及唾液中IL-12水平均無變化，是否與測定方法有關(guān)，尚需進一步研究。IFN-α由白細胞產(chǎn)生，在病毒感染的先天性免疫方面發(fā)揮作用，影響細胞增殖并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，如腫瘤浸潤巨噬細胞中IFN-α的高表達可以導(dǎo)致樹突狀細胞活化增強、免疫效應(yīng)細胞毒作用增強。IFN-α參與扁平苔蘚的病理變化[13]，但在OLP患者中是否參與及如何參與黏膜病理變化尚不清楚。本研究表明OLP患者血清及唾液中IFN-α水平均無變化。

本研究采用流式細胞術(shù)OLP患者血清及唾液中IL-1β、IL-5、IL-8、IL-12和 IFN-α 5種細胞因子濃度變化，只有血清和唾液中IL-8濃度增高，因此推測IL-8是參與OLP疾病發(fā)生發(fā)展的部分原因。既往研究采用流式細胞術(shù)測定OLP患者IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α和 IFN-γ共7種細胞因子的水平，發(fā)現(xiàn)血清和唾液中IL-4、IL-6、IL-17A和TNF-α增高，推測這些細胞因子增高參與患者口腔局部病理變化（資料待發(fā)表）。OLP患者IL-8濃度水平在唾液中比在血清中增高明顯，與測定血清相比，唾液標(biāo)本采集更加方便，測定唾液中IL-8水平有助于疾病活動量化的可能，便于治療效果評價[14]。IL-8中和抗體，如ABX-IL8和HuMax-IL8治療腫瘤的研究較多。為探討抗IL-8在三陰乳腺癌的治療作用機制，在體內(nèi)和體外緊密連接蛋白低表達型（Claudin-low）乳腺癌模型中，IL-8中和抗體HuMax-IL8能夠抑制腫瘤部位中性粒細胞和髓源性抑制細胞的活化和浸潤，逆轉(zhuǎn)間充質(zhì)化（Mesenchymalization），阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在體外實驗中，HuMax-IL8還能夠增強NK和抗原特異性T細胞溶解腫瘤的敏感性[15]。HuMax-IL8治療已經(jīng)轉(zhuǎn)移惡性腫瘤的Ⅰ期臨床試驗中，HuMax-IL8的安全性和耐受性良好，可以降低血清中增高的IL8，穩(wěn)定治療效果[16]。本研究結(jié)果顯示，OLP患者血清和唾液中IL-8水平均增高，與國外報道一致[17]。國外研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，OLP患者血清和唾液中IL-8水平增高，血清IL-8水平增高程度與疾病嚴(yán)重性相關(guān)，隨訪發(fā)現(xiàn)血清IL-8水平持續(xù)增高與癌變進展相關(guān)，降低IL-8水平的措施可能改善病情，阻斷疾病進展，減少癌變可能，針對IL-8的中和抗體有可能為治療OLP患者提供新的途徑。地塞米松可以降低EOLP患者唾液中IL-8水平，部分揭示了地塞米松治療OLP的作用機制，但是否能夠降低血清中IL-8水平，以及對于NEOLP患者作用如何，尚不明確。慢性牙周炎血清IL-6、IL-8及TNF-α水平均增高，替硝唑聯(lián)合鹽酸米諾環(huán)素治療后血清IL-6、IL-8及TNF-α水平均顯著降低，表明這些藥物可以有效調(diào)節(jié)血清炎癥因子水平，降低炎癥反應(yīng)，改善牙周指標(biāo)水平，緩解患者癥狀[18]。對于OLP患者，這些藥物是否能夠同樣降低細胞因子水平，需進一步研究。中醫(yī)藥治療本病可分為局部治療和全身治療，局部治療對于糜爛潰瘍型可使用養(yǎng)陰生肌散等藥物;全身治療以辨證論治為治則，根據(jù)不同辨證分型用藥。如利濕健脾祛瘀湯可以有效改善OLP患者的臨床癥狀，降低血清IL-8和TNF-α等炎癥細胞因子水平，取得良好治療效果[19]。因此，采用中西醫(yī)結(jié)合的治療措施是提高OLP療效的有效途徑，對于IL-8升高的難治性O(shè)LP患者，采用抗IL-8治療是否能夠取得滿意治療效果，尚需進一步研究。

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（收稿日期：2020-12-09）