陶曉賽，龔海燕, 2，謝彩俠, 2*，張 娟, 2*，李雅靜，耿曉桐，劉慶普, 2，雷敬衛(wèi), 2

基于UPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)評價不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材質(zhì)量

陶曉賽1，龔海燕1, 2，謝彩俠1, 2*，張 娟1, 2*，李雅靜1，耿曉桐1，劉慶普1, 2，雷敬衛(wèi)1, 2

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046 2. 河南省中藥質(zhì)量控制與評價工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046

建立盾葉薯蕷的UPLC指紋圖譜，分析不同產(chǎn)地盾葉薯蕷質(zhì)量特征的共有性和差異性，為盾葉薯蕷藥材的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。采用色譜柱InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（150 mm×2.1 mm，2.7 μm），以乙腈（B）-水（A）為流動相梯度洗脫，體積流量0.3 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30 ℃，建立65批不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材的UPLC指紋圖譜；利用SPSS19.0和SIMCA14.1軟件對不同產(chǎn)地的盾葉薯蕷藥材進行質(zhì)量評價及差異性分析。盾葉薯蕷藥材UPLC指紋圖譜共標(biāo)定31個共有峰，指認出的5種皂苷類成分和其他未知成分均作為主要信息參與了盾葉薯蕷的質(zhì)量表達，主成分載荷值的綜合得分表明不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材的綜合質(zhì)量差異較大，主成分分析（PCA）結(jié)果顯示不同產(chǎn)地盾葉薯蕷的化學(xué)質(zhì)量特征存在差異，且各自聚為一類，其中湖北丹江口地區(qū)盾葉薯蕷與其他產(chǎn)地樣品均存在較大差異；偏最小二乘法分析（PLS-DA）模型篩選出的5、28、11、12、29、18、16、31、13號色譜峰所代表的成分是造成盾葉薯蕷樣品間差異的主要標(biāo)志性物質(zhì)，其中28、29號峰分別為盾葉新苷和三角葉薯蕷皂苷。本研究建立的盾葉薯蕷UPLC指紋圖譜可以較為全面地表征其化學(xué)質(zhì)量特征，指紋圖譜的化學(xué)計量學(xué)分析結(jié)果為盾葉薯蕷質(zhì)量標(biāo)志物的篩選及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

盾葉薯蕷；UPLC指紋圖譜；主成分分析；質(zhì)量評價；化學(xué)計量學(xué)；原薯蕷皂苷；偽原薯蕷皂苷；盾葉新苷；三角葉薯蕷皂苷；薯蕷皂苷

盾葉薯蕷C. H. Wright為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬多年生草本植物，俗稱黃姜、火頭根，主要在秦巴?武當(dāng)區(qū)與西南?中南區(qū)，分布于河南南部、湖南、湖北、陜西、甘肅、四川等地，是中國特有的野生藥用資源[1]。盾葉薯蕷以根狀莖入藥，其性味甘、苦、涼，具有清肺止咳、利濕通淋、解毒消腫和通經(jīng)絡(luò)等功效?，F(xiàn)代研究表明，皂苷類成分是盾葉薯蕷藥材主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抗血小板聚集、抗心肌缺血、調(diào)血脂、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2]，目前廣泛應(yīng)用于地奧心血康[3]、心腦舒通膠囊等治療心血管疾病的臨床用藥[4]，其中地奧心血康已于2012年獲得歐盟藥品注冊上市認可[5]。盾葉薯蕷是世界上薯蕷皂苷元含量最高的植物，可達1.1%～16.15%，比墨西哥菊花薯蕷L.的皂苷元含量高，是提取薯蕷皂苷元重要的藥源植物。

盾葉薯蕷是一種藥效成分明確的藥用植物，但由于其為多年生，產(chǎn)地多，生長環(huán)境復(fù)雜，質(zhì)量穩(wěn)定性差且難以控制，目前的文獻報道多以盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元和薯蕷皂苷作為指標(biāo)對其質(zhì)量進行評價[6-7]，而以HPLC指紋圖譜等多個指標(biāo)對其質(zhì)量進行評價的也主要是針對某一產(chǎn)地的盾葉薯蕷藥材[8]，并不能真實反映全國不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材的整體質(zhì)量特征，而且盾葉薯蕷中皂苷類成分多，含量差異大，部分皂苷類成分的性質(zhì)比較接近，利用常規(guī)的HPLC很難實現(xiàn)準(zhǔn)確、高效的分離與檢測。UPLC法具有更強大的分離能力、超快的分離速度及超高的靈敏度等優(yōu)點[9]，同時在縮短分析時間及減少試劑消耗方面也具有很大的應(yīng)用前景[10]。基于此，本實驗以河南、甘肅、陜西、湖北、湖南等全國8個不同產(chǎn)地的盾葉薯蕷為研究對象，建立其UPLC指紋圖譜，并利用化學(xué)計量學(xué)方法對其進行分析，挖掘不同產(chǎn)地盾葉薯蕷質(zhì)量特征的共有性與差異性，為盾葉薯蕷藥材資源評價及質(zhì)量評控提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent公司）；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；HQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；藥典篩（浙江上虞市五四儀器篩具廠）；BSA224S-CW型萬分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；CPA225D型十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；FW-100型高速多功能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試劑

色譜甲醇、色譜乙腈（Fisher公司）；娃哈哈飲用純凈水（濟南娃哈哈恒楓飲料有限公司）；無水乙醇（煙臺市雙雙化工有限公司，分析純）；三角葉薯蕷皂苷（批號CHB17051）、盾葉新苷（批號CHB170718）購自成都克洛瑪生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；薯蕷皂苷（批號MUST-17090203）、原薯蕷皂苷（批號MUST-17100901）、偽原薯蕷皂苷（批號MUST-17110504）購自成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.78%、98.53%、98.80%。

1.3 試藥

盾葉薯蕷藥材采自全國8個產(chǎn)地共65批樣品，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定為盾葉薯蕷C. H. Wright的根莖。去除泥沙等雜質(zhì)，切片，于鼓風(fēng)干燥箱中55 ℃烘干，粉碎后過65目篩，置于干燥器內(nèi)備用。樣品產(chǎn)地信息及編號見表1。

表1 不同產(chǎn)地盾葉薯蕷樣品信息

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

稱取盾葉薯蕷根莖樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密移取80%乙醇溶液30 mL，稱定質(zhì)量，85 ℃加熱回流40 min，冷卻至室溫，補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，精密移取續(xù)濾液20 mL于蒸發(fā)皿中蒸干，用色譜甲醇定容置5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷及薯蕷皂苷對照品適量，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.68、0.39、0.75、0.42、0.38 mg/mL的對照品儲備液，分別取適量配制成混合對照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（150 mm×2.1 mm，2.7 μm），流動相為乙腈（B）-水（A），梯度洗脫：0～2 min，15% B；2～40 min，15%～40% B；40～50 min，40%～53% B；50～57 min，53%～60% B；體積流量0.3 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30 ℃，進樣量1 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性試驗 取樣品（S7）按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3”色譜條件分別在樣品制備完成后0、2、4、8、12、24 h進樣，以28號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結(jié)果顯示各項RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.2 精密度試驗 取樣品（S7）按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3”色譜條件連續(xù)進樣6次，以28號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積，結(jié)果顯示各項RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 按“2.1”項下方法重復(fù)制備樣品（S7）6份，按照“2.3”色譜條件進樣，以28號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積，結(jié)果顯示各項RSD值均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 盾葉薯蕷藥材UPLC指紋圖譜共有模式的建立

按“2.1”項下方法分別制備65批盾葉薯蕷樣品的供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣，分別記錄其UPLC色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地盾葉薯蕷UPLC指紋圖譜中色譜峰數(shù)目基本相同，但色譜峰面積差異較大，說明不同產(chǎn)地盾葉薯蕷質(zhì)量特征的差異主要表現(xiàn)在部分化學(xué)成分含量的高低上。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）對不同產(chǎn)地盾葉薯蕷的UPLC指紋圖譜進行擬合。設(shè)定時間窗寬度為0.3，以S1藥材UPLC圖譜作為參照圖譜進行匹配，按照中位數(shù)法生成盾葉薯蕷UPLC指紋圖譜的共有模式（圖2），共有模式中共標(biāo)定31個共有峰，指認出原薯蕷皂苷（19號峰）、偽原薯蕷皂苷（20號峰）、盾葉新苷（28號峰）、三角葉薯蕷皂苷（29號峰）、薯蕷皂苷（30號峰）5種皂苷類成分。

3.2 盾葉薯蕷藥材質(zhì)量的綜合評價

為綜合評價不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材質(zhì)量，本研究以65批不同樣品共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，利SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行主成分分析（PCA），計算相關(guān)矩陣的特征值及其方差貢獻，以特征值（VIP）＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到前8個主成分的累積方差貢獻率為80.323（＞80%）（表2，圖3），說明前8個主成分反映了盾葉薯蕷藥材中31個成分量80.323%的信息量，基本上可以表征盾葉薯蕷UPLC指紋圖譜特征。同時，對各主成分的權(quán)重比例與各共有峰對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（表3）進行分析，結(jié)果表明，指認出的5種皂苷類成分和其他未知成分均作為主要信息參與了盾葉薯蕷的質(zhì)量表達，第1主成分主要反映色譜峰1、2、5、6、8、9、10、17、20（偽原薯蕷皂苷）、29（三角葉薯蕷皂苷）的信息表達，第2主成分主要反映了色譜峰12、13的信息表達，第3主成分主要反映了色譜峰30（薯蕷皂苷）的信息表達，第4主成分主要反映了色譜峰31的信息表達，第5主成分主要反映了色譜峰25的信息表達，第6主成分主要反映了色譜峰7的信息表達，第7主成分主要反映了色譜峰28（盾葉新苷）的信息表達，第8主成分主要反映了色譜峰22的信息表達。為了綜合評價各產(chǎn)地盾葉薯蕷的整體質(zhì)量，對各主成分的載荷值進行計算，并根據(jù)其綜合得分的高低對不同產(chǎn)地盾葉薯蕷的質(zhì)量進行排序（表4）。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地之間及相同產(chǎn)地不同來源的盾葉薯蕷綜合得分差別較大，其中來源于甘肅隴南的S31～S35、湖北丹江口的S6～S10、陜西安康的S36、S39、S42、S45等14批盾葉薯蕷藥材的綜合質(zhì)量得分較高。

圖1 不同產(chǎn)地盾葉薯蕷UPLC指紋圖譜疊加圖

19-原薯蕷皂苷 20-偽原薯蕷皂苷 28-盾葉新苷 29-三角葉薯蕷皂苷 30-薯蕷皂苷

表2 盾葉薯蕷UPLC指紋圖譜的主成分信息和方差貢獻率

圖3 碎石圖

3.3 盾葉薯蕷藥材質(zhì)量差異成分的篩選

為了分析盾葉薯蕷藥材質(zhì)量的差異性規(guī)律，利用SIMCA14.1軟件對65批不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材指紋圖譜的原始數(shù)據(jù)進行PCA-X分析。PCA-X得分圖（圖5）可以直觀看出各產(chǎn)地樣品特；征分布情況，8個產(chǎn)地的盾葉薯蕷樣品各自聚為一類，表明不同產(chǎn)地的盾葉薯蕷間存在一定的差異性。樣品分布距離越遠，表明差異性越大，河南南陽與陜西商洛樣品散點圖相互交叉，湖北宜昌與湖南懷化較為近鄰，而甘肅隴南、湖北丹江口、湖北宜昌與湖南懷化、陜西安康等產(chǎn)地的樣品分布距離較遠其中湖北丹江口與其余7個產(chǎn)地的盾葉薯蕷樣品明顯區(qū)分，表明丹江口地區(qū)盾葉薯蕷與其他產(chǎn)地樣品的質(zhì)量特征差異較大。主成分因子載荷量圖（圖6）中，橫縱坐標(biāo)分別表示在第1主成分及第2主成分中各個成分對模型的貢獻率，距離原點越遠表明該成分對樣品的差異貢獻率越大，可以看出5、6、8、10號峰對第1主成分差異貢獻較大，4、12、18、27號峰對第2主成分差異貢獻較大，是潛在影響各產(chǎn)地盾葉薯蕷差異的主要因素。

表3 主要因子載荷矩陣

表4 綜合得分排名

H、D、N、S、G、A、Y、L標(biāo)識8個產(chǎn)地見表1

圖6 不同產(chǎn)地盾葉薯蕷指紋圖譜因子載荷量圖

為了進一步篩選引起不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材質(zhì)量特征差異的標(biāo)志性成分，利用SIMCA14.1軟件對65批不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材UPLC指紋圖譜的原始數(shù)據(jù)進行偏最小二乘法分析（PLS-DA）分析，提取PLS-DA模型中31個變量的VIP值（圖7），以變量的VIP＞1作為評價標(biāo)準(zhǔn)，篩選引起盾葉薯蕷藥材質(zhì)量差異的潛在化學(xué)成分。篩選結(jié)果表明，色譜峰5、28、11、12、29、18、16、31、13的VIP值均大于1，說明這些峰所代表的成分是造成不同產(chǎn)地盾葉薯蕷差異的主要標(biāo)志性物質(zhì)，其中28、29號峰分別為盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷，其他7個成分還有待鑒別。

圖7 盾葉薯蕷藥材UPLC指紋圖譜色譜峰的PLS-DA VIP圖

4 討論

甾體皂苷作為盾葉薯蕷藥材的主要藥效物質(zhì)，其皂苷類成分種類的多少、含量的高低及比例直接影響其臨床及工業(yè)利用，但由于影響盾葉薯蕷質(zhì)量的因素較多[11]，藥材中皂苷類成分的含量變化較大，質(zhì)量的穩(wěn)定性較差，而關(guān)于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[12]多以某一產(chǎn)地的盾葉薯蕷為研究對象，質(zhì)量控制指標(biāo)也僅僅為1～2個皂苷類成分，并不能反映盾葉薯蕷的整體質(zhì)量特征。指紋圖譜可以在一定程度上反映樣品中大部分化學(xué)成分的種類及相對含量的高低，進而從整體上分析中藥的質(zhì)量特征[13]。UPLC指紋圖譜技術(shù)與常規(guī)的HPLC指紋圖譜相比，具有分析速度快，檢測靈敏度高，信息量豐富等優(yōu)點，可以較為全面地反映藥材的質(zhì)量信息。本研究建立了全國8個產(chǎn)地65批盾葉薯蕷藥材的UPLC指紋圖譜，指認出原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷和薯蕷皂苷5種甾體皂苷類成分，表明該指紋圖譜基本可以表征盾葉薯蕷皂苷類成分的質(zhì)量特征，指紋圖譜的主成分分析結(jié)果表明5種皂苷類成分和其他幾種未知成分均作為主要信息參與了盾葉薯蕷的質(zhì)量表達，因此皂苷類成分作為控制盾葉薯蕷藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)具有一定的合理性，但各主成分的載荷值綜合得分表明不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材的綜合化學(xué)質(zhì)量存在差異，而且無明顯的地域性規(guī)律，這進一步說明由于受環(huán)境、生長年限等多因素的影響，造成了盾葉薯蕷化學(xué)質(zhì)量的差異。

基于不同產(chǎn)地盾葉薯蕷綜合化學(xué)質(zhì)量的差異性，本研究利用PLS-DA模型從UPLC指紋圖譜的共有峰中篩選出引起盾葉薯蕷藥材質(zhì)量差異的9個標(biāo)志性成分，其中2個成分為盾葉新苷和三角葉薯蕷皂苷，表明不同產(chǎn)地盾葉薯蕷中這2種皂苷類成分的含量特征差異較大，但目前關(guān)于這2種皂苷在盾葉薯蕷植株內(nèi)的含量特征與盾葉薯蕷臨床療效之間的相關(guān)性也未見報道，另外7種成分的結(jié)構(gòu)信息還有待于進一步確認。后期可結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對其他7個未知成分的結(jié)構(gòu)進行確認，同時對不同產(chǎn)地盾葉薯蕷中標(biāo)志性成分的含量進行準(zhǔn)確測定，根據(jù)其化學(xué)質(zhì)量特征，結(jié)合藥效學(xué)實驗篩選可以真實反映盾葉薯蕷藥材臨床療效的指標(biāo)性成分，并確定其質(zhì)量分布特征，為盾葉薯蕷質(zhì)量標(biāo)志物的篩選及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation offrom different origins based on UPLC fingerprint and chemometrics

TAO Xiao-sai1, GONG Hai-yan1, 2, XIE Cai-xia1, 2, ZHANG Juan1, 2, LI Ya-jing1, GENG Xiao-tong1, LIU Qing-pu1, 2, LEI Jing-wei1, 2

1. Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Province Traditional Chinese Medicine Quality Control and Evaluation Engineering Technology Research Center, Zhengzhou 450046, China

To establish UPLC fingerprint of, analyze the common characteristics and differences of the quality characteristics ofin different habitats, so as to provide a scientific basis for the quality evaluation of.The chromatographic column was InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(150 mm × 2.1 mm, 2.7 μm). The mobile phase was composed of acetonitrile (B) and water (A) in gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min, the detection wavelength was set at 203 nm, and the column temperature was 30 ℃, which was used to establish the UPLC fingerprint of 65 batches offrom different producing areas; SPSS 19.0 and SIMCA 14.1 software were used to evaluate the quality and analyze the differences offrom different habitats.The UPLC fingerprint ofmedicinal material had marked 31 common peaks. The identified five saponin components and other unknown components all participated in the quality expression ofas the main information. The comprehensive score of the load value of the main components indicated that the comprehensive quality ofmedicinal material from different origins was quite different; The results of PCA showed that the chemical quality characteristics offrom different habitats were different, and each grouped into one category. Among them, there were significant differences betweenfrom Danjiangkou region of Hubei Province and samples from other habitats. The components represented by the peaks 5, 28, 11, 12, 29, 18, 16, 31 and 13 selected by the PLS-DA model were the main marker substances causing the difference between the samples of, among which No. 28 and No. 29 peaks were zingiberensis newsaponin and deltonin.The UPLC fingerprint ofestablished in this study can relatively characterize its chemical quality characteristics, and the chemometric analysis results of the fingerprint provide scientific basis for screening quality markers ofand establishing quality standard.

C. H. Wright; UPLC fingerprint; principal component analysis; quality evaluation; chemometrics; protodioscin; pseudoprotodioscin; zingiberensis newsaponin; deltonin; dioscin

R286.2

A

0253 - 2670(2021)01 - 0227 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.027

2020-08-09

國家重點研發(fā)計劃（2017YFC1700705）；河南省高等學(xué)校重點科研項目（20A360016）

陶曉賽，碩士，研究方向為中藥質(zhì)量控制。Tel: 15093166039 E-mail: 1255286351@qq.com

謝彩俠，博士，教授，從事中藥質(zhì)量控制研究。Tel: 13673651577 E-mail: nanyang.xcx@163.com

張 娟，博士，副教授，從事中藥分析方法研究。Tel: 13592653193 E-mail: 1210571736@qq.com

[責(zé)任編輯 時圣明]