李彩琳，呂 鴻，張鴻翰，王彥權，彭 芳

美洲大蠊多肽逆轉人肝癌HepG2/ADM細胞多藥耐藥性的作用及機制研究

李彩琳，呂 鴻，張鴻翰，王彥權，彭 芳*

大理大學藥學院，云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理 671000

探討美洲大蠊多肽（PAE2）逆轉人肝癌多藥耐藥細胞株HepG2/ADM的作用及機制。噻唑藍（MTT）法檢測HepG2/ADM細胞對不同化療藥物的耐藥性以及PAE2聯(lián)合化療藥物（5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、奧沙利鉑）對HepG2/ADM細胞增殖的影響；激光共聚焦觀察PAE2對HepG2/ADM細胞中藥物累積的影響；Western blotting法檢測PAE2對HepG2/ADM細胞凋亡相關蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9）、DNA修復酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）表達的影響；qRT-PCR法檢測PAE2對多藥耐藥蛋白1（multiple drug resistance 1，MDR1）、乳腺癌耐藥相關蛋白（breast cancer resistant protein，BCRP）和酶介導的多藥耐藥途徑中蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、拓撲異構酶Ⅱ（topoisomerase Ⅱ，Top Ⅱ）的mRNA表達。PAE2抑制HepG2/ADM細胞增殖，呈時間和劑量相關性。PAE2可逆轉HepG2/ADM對不同化療藥物的耐藥性；PAE2可上調HepG2/ADM細胞中阿霉素水平，呈劑量相關性。PAE2可顯著上調耐藥細胞中Bax、cleaved Caspase-9 p37蛋白表達水平（＜0.05、0.01），顯著下調Bcl-2蛋白表達水平（＜0.01），對cleaved PARP蛋白表達無顯著影響。PAE2均顯著下調HepG2/ADM細胞中、、、mRNA水平（＜0.01）。結論 PAE2可以通過減少藥物外排、促進細胞凋亡、下調耐藥蛋白表達等途徑逆轉HepG2/ADM細胞的多藥耐藥性。

美洲大蠊多肽；PAE2；肝癌；多藥耐藥；HepG2/ADM細胞

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率位于全球癌癥第3位[1]。臨床治療采用手術、放化療、生物療法以及多種方法的聯(lián)用。由于腫瘤細胞對化療藥物產生多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR），從而降低藥物療效，抗肝癌藥物的治療效果無法顯著提高。近48年來，多藥耐藥性成為生物學家重要的攻克目標[2-3]。研究表明，細胞產生多藥耐藥相關蛋白（multi-drug resistance-associated protein，MRP），增加P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）表達[4]，從而促進藥物外排[5-6]。臨床上使用P-gp抑制劑來減少腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥性，但由于化療藥物的毒性、藥物相互作用等因素療效并不顯著?；瘜W藥物逆轉多藥耐藥的作用機制單一、效果不佳，因此尋找高效低毒的藥物來逆轉肝癌細胞的耐藥性尤為重要。

美洲大蠊L. 是蜚蠊科動物體積最大的昆蟲，美洲大蠊多肽具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、減輕肝損傷、抗腫瘤等多種藥理作用[7-10]。課題組前期研究表明，美洲大蠊粗提物脫脂膏通過促進細胞凋亡、增加細胞內藥物聚集，抑制P-gp、MRP、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等表達，從而抑制腫瘤生長、逆轉肝癌細胞多藥耐藥等作用[11-16]。PAE2是從美洲大蠊中分離得到的具有明確氨基酸系列且效果最優(yōu)的多肽小分子。本研究采用人肝癌細胞HepG2、多藥耐藥細胞株HepG2/ADM，分別從細胞內藥物累積、細胞生長抑制、MRP和酶介導的MDR途徑相關蛋白幾個方面探討PAE2逆轉HepG2/ADM多藥耐藥性的作用及機制。

1 材料

1.1 細胞

人肝癌HepG2、HepG2/ADM細胞購自齊氏生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

PAE2（白色粉末，批號P18267，質量分數(shù)98.071%）由大理大學藥學院張成桂博士提供，以DMEM培養(yǎng)基配制成相應質量濃度用于后續(xù)實驗；5-氟尿嘧啶（批號WXBC6532V，質量分數(shù)＞99%）、青霉素鏈霉素混合液（批號20190909），購自Sigma公司；阿霉素（批號131102，質量分數(shù)98.0%），購自浙江海正藥業(yè)有限公司；長春新堿（批號SV8300，質量分數(shù)≥98.0%）、索拉非尼（批號720N021，質量分數(shù)≥99.0%），購自索萊寶公司科技有限公司；奧沙利鉑（批號T0164，質量分數(shù)≥99.95%），購自TargetMol公司；環(huán)磷酰胺（批號0A355A），購自百特國際有限公司；胎牛血清（FBS，批號2166446），購自美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基（批號F909FA0001）、多藥耐藥蛋白1（multiple drugresistance 1，MDR1）、BCRP、蛋白激酶C（proteinkinase C，PKC）、拓撲異構酶Ⅱ（topoisomerase Ⅱ，Top Ⅱ）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物購自上海生工生物工程股份有限公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白抗體（批號ab6721），購自美國Abcam公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）兔抗多克隆抗體（批號00071452）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9）兔抗多克隆抗體（批號000744407）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl 2-associated X，Bax）兔抗多克隆抗體（批號00073304）、DNA修復酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）兔抗多克隆抗體（批號00055579），購自美國Proteintech公司；GAPDH兔抗多克隆抗體（批號072319191203）、cDNA第一鏈合成試劑盒（批號050720190702）、BCA蛋白測定試劑盒（批號P0010），購自碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為分析純或實驗室常用試劑。

1.3 儀器

3111型CO2培養(yǎng)箱、SN255939型酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；BB16UV/BB5060UV型垂直流超凈臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；BSA24S型電子分析天平（Sartorius公司）；TS100型倒置光學顯微鏡（Olymplus公司）；SN255939型酶標儀（Thermo公司）；785BR15145型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Bio-Rad）；TD3型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HepG2、HepG2/ADM細胞用含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，HepG2/ADM細胞另加入阿霉素（0.5 μg/L）以維持細胞的耐藥性，于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 PAE2對HepG2/ADM細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的HepG2/ADM細胞，胰酶消化后，以2.5×105個/mL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。分別加入不同質量濃度（0.1、1、10、100、1000、10 000 g/mL）PAE2，孵育48 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% MTT的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入100 μL DMSO，振蕩30 min，待紫色結晶完全溶解后，用全自動酶標儀于570 nm處測定吸光度（）。采用SPSS軟件計算PAE2對HepG2/ADM細胞的5%抑制濃度（5% inhibitory concentration，IC5）、10%抑制濃度（10% inhibitory concentration，IC10）、20%抑制濃度（20% inhibitory concentration，IC20），分別作為逆轉多藥耐藥實驗的低、中、高劑量。

2.3 HepG2/ADM細胞的多藥耐藥性以及PAE2對HepG2/ADM細胞耐藥性的逆轉作用

實驗分為對照組、模型組、PAE2（IC20＝183.19 μg/mL）組。對照組取對數(shù)生長期的HepG2細胞，其余2組取對數(shù)生長期的HepG2/ADM細胞，以2.5×105個/mL接種于96孔板，培養(yǎng)至細胞融合度為70%。各組加入以DMEM培養(yǎng)基配制成相應質量濃度的化療藥物，PAE2組另加入PAE2溶液，同時設試劑對照組和細胞空白對照組。其中化療藥物質量濃度分別為5-氟尿嘧啶（10、20、40、80、160 μg/mL）、阿霉素（0.31、0.63、1.25、2.50、5.00 μg/mL）、環(huán)磷酰胺（40、80、160、320、640 μg/mL）、長春新堿（5、10、20、40、80 μg/mL）、奧沙利鉑（10、20、40、80、160 μg/mL）。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL DMSO，振蕩30 min，待紫色結晶完全溶解，采用全自動酶標儀于570 nm處測定值，計算細胞的生長抑制率、耐藥倍數(shù)和逆轉倍數(shù)[17]。

生長抑制率＝1－(給藥－試劑對照)/(細胞空白對照－試劑對照)

耐藥倍數(shù)＝耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50

逆轉倍數(shù)＝耐藥細胞IC50/PAE2處理后耐藥細胞IC50

2.4 PAE2對HepG2/ADM細胞藥物累積的影響

實驗分為對照組、模型組、索拉非尼（2.40 μg/mL，以DMEM培養(yǎng)基配制成相應質量濃度）組、PAE2低劑量（IC5＝3.21 μg/mL）組、PAE2中劑量（IC10＝22.19 μg/mL）組、PAE2高劑量（IC20＝183.19 μg/mL）組。對照組取對數(shù)生長期的HepG2細胞，其余各組取HepG2/ADM細胞，以8×106個/mL接種于直徑3 cm、含細胞爬片的小皿中，培養(yǎng)24 h。除對照和模型組外，其余組分別加入對應藥物，培養(yǎng)48 h。PBS洗滌，加入含阿霉素（5 μg/mL）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h；用冷PBS洗滌3次，每次5 min，加入4%多聚甲醛避光固定30 min；用冷PBS洗滌2次，每次5 min，加入DAPI染色5 min；用冷PBS洗滌3次，每次5 min；用抗熒光淬滅封片劑封片，避光保存，次日于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。鏡下ADM陽性表達為紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。采用Image J 6.0軟件計算阿霉素陽性細胞的熒光強度值，熒光強度值越大表明藥物含量越高。

2.5 PAE2對HepG2/ADM細胞凋亡相關蛋白表達的影響

實驗分為對照組、模型組、索拉非尼（2.40 μg/mL）組、PAE2低劑量（3.21 μg/mL）組、PAE2中劑量（22.19 μg/mL）組、PAE2高劑量（183.19 μg/mL）組。對照組取對數(shù)生長期的HepG2細胞，其余各組取HepG2/ADM細胞，以7.5×105個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h。除對照和模型組外，其余組分別加入對應藥物，培養(yǎng)48 h。以PBS洗滌后加入50 μL含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上孵育30 min，16 100×，離心5 min，收集上清，采用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白的質量濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜，以5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入Bcl-2（1∶1500）、Caspase-9（1∶800）、Bax（1∶2000）、PARP（1∶500）、GAPDH（1∶5000）抗體，于4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白抗體（1∶500），室溫孵育2 h，于凝膠成像儀顯影。采用Image J 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.6 PAE2對HepG2/ADM細胞多藥耐藥和酶介導的MDR途徑相關蛋白mRNA水平的影響

實驗分為對照組、模型組、索拉非尼（2.40 μg/mL）組、PAE2低劑量（3.21 μg/mL）組、PAE2中劑量（22.19 μg/mL）組、PAE2高劑量（183.19 μg/mL）組。對照組取對數(shù)生長期的HepG2細胞，其余各組取HepG2/ADM細胞，以2.4×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。除對照和模型組外，其余組分別加入對應藥物，培養(yǎng)48 h。用Trizol試劑提取總RNA，測定其質量濃度和純度；按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作合成cDNA；以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，反應程序：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。引物序列：上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；上游引物5’-TATAGCTCAGATCATTGTCACAGTC-3’，下游引物5’-GTTGGTCGTCAGGAAGAAGAG-3’；上游引物5’-CCCAAACATTGACAAATCCTAACC-3’，下游引物5’-CAACCAAGGAGGGTACCAGATG-3’；上游引物5’-GAAACGGAATCCTTGGTCAGAT-3’，下游引物5’-TTTCGGCTGCTGCTCTCCTA-3’；上游引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 細胞形態(tài)

如圖1所示，和HepG2細胞相比，HepG2/ADM細胞大小不等且有明顯觸角。

3.2 PAE2對HepG2/ADM細胞增殖的影響

如圖2所示，選取細胞倍增時間和較小抑制濃度作為后續(xù)實驗藥物劑量，采用藥物作用48 h的IC5（3.21 μg/mL）、IC10（22.19 μg/mL）、IC20（183.19 μg/mL）分別作為PAE2低、中、高劑量。

圖1 HepG2 (A) 和HepG2/ADM (B) 細胞形態(tài)(×200)

圖2 PAE2對HepG2/ADM細胞增殖的影響()

3.3 HepG2/ADM細胞的多藥耐藥性以及PAE2對HepG2/ADM細胞耐藥性的逆轉作用

如圖3所示，與對照組相比，化療藥物對HepG2/ADM細胞生長的抑制作用較弱，HepG2/ADM細胞對不同化療藥物均存在耐藥性；PAE2聯(lián)合化療藥物可增強對HepG2/ADM細胞生長的抑制作用，HepG2/ADM細胞對化療藥物的耐藥性降低。如表1所示，HepG2/ADM細胞對5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、奧沙利鉑的耐藥倍數(shù)分別為2.18、1.87、4.78、3.10、2.00，PAE2對5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、奧沙利鉑的逆轉倍數(shù)分別為1.15、1.16、1.25、1.94、1.39。表明PAE2可逆轉HepG2/ADM細胞對不同化療藥物的多藥耐藥性。

圖3 HepG2/ADM細胞對不同化療藥物的多藥耐藥性以及PAE2對HepG2/ADM細胞耐藥性的逆轉作用

表1 HepG2/ADM對不同化療藥物的耐藥倍數(shù)以及PAE2對HepG2/ADM細胞耐藥性的逆轉倍數(shù)()

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

3.4 PAE2對HepG2/ADM細胞藥物累積的影響

利用阿霉素自發(fā)熒光的特點，觀察阿霉素在細胞中的累積。為了維持細胞耐藥性，用含阿霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，因此HepG2/ADM細胞熒光強于HepG2。如圖4和表2所示，與對照組相比，其余各組細胞中阿霉素累積水平明顯增加（＜0.05、0.01）；與模型組相比，PAE2中、高劑量組細胞中阿霉素累積水平顯著增加（＜0.01）。表明PAE2可抑制HepG2/ADM細胞對藥物的外排作用，HepG2/ADM細胞耐藥性減弱。

圖4 PAE2對HepG2/ADM細胞藥物累積的影響(×400)

表2 PAE2對HepG2/ADM細胞藥物累積的影響()

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01

#< 0.05##< 0.01control group;**< 0.01model group

3.5 PAE2對HepG2/ADM細胞凋亡相關蛋白表達的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組Bcl-2、cleaved Capase-9 p37、cleaved PARP蛋白表達顯著升高（＜0.01），Bax蛋白表達無顯著變化；與模型組比較，PAE2可顯著升高Bax、cleaved Capase-9 p37蛋白表達（＜0.05、0.01），并降低Bcl-2蛋白表達（＜0.05），呈劑量相關性，但cleaved PARP蛋白表達無顯著變化。

3.6 PAE2對HepG2/ADM細胞多藥耐藥和酶介導的MDR途徑相關蛋白mRNA水平的影響

如表3所示，與對照比比較，模型組多藥耐藥相關蛋白、、mRNA水平顯著升高（＜0.01），mRNA水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，PAE2顯著下調、、mRNA水平（＜0.01），顯著升高mRNA水平（＜0.01），降低HepG2/ADM細胞的耐藥性。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與索拉非尼組比較：▲P＜0.05

表3 PAE2對HepG2/ADM細胞多藥耐藥和酶介導的MDR途徑相關蛋白mRNA水平的影響()

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01；與索拉非尼組比較：▲＜0.05

##< 0.01control group;**< 0.01model group;▲< 0.05sorafenib group

4 討論

肝癌致死率極高，由于臨床診斷發(fā)現(xiàn)較晚，手術切除療效不佳[18]，且易對化療藥物產生多藥耐藥性。5-氟尿嘧啶、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、奧沙利鉑為臨床常用且易產生耐藥的化療藥物。5-氟尿嘧啶通過抑制胸腺核苷合成酶，從而抑制DNA合成，發(fā)揮抗腫瘤作用；阿霉素可抑制Top Ⅰ活性從而干擾轉錄、抑制RNA合成、干擾DNA復制，影響處于各個周期的細胞；長春新堿可以抑制微管蛋白的聚合從而影響紡錘微管的形成，使細胞終止于細胞中期，從而影響腫瘤細胞的生長；環(huán)磷酰胺是氮芥類抗腫瘤藥，經(jīng)過細胞內磷酸酶水解為氮芥后發(fā)揮細胞毒性，殺死腫瘤細胞；奧沙利鉑為鉑類抗腫瘤藥，可與DNA形成交叉連接，抑制DNA的復制和轉錄。雖然各種化療藥物的作用機制不同，但臨床應用表明腫瘤對各種化療藥物均存在耐藥性。肝癌的多藥耐藥一直是臨床治療的一大難題，肝癌的多藥耐藥是多機制、多因素作用的結果[19]。藥物產生多藥耐藥的機制主要包括耐藥蛋白介導的MDR（MRP、BCRP、LRP）、酶系統(tǒng)異常導致的MDR（Top II、PKC）、DNA修復機制、微管與微管蛋白異常導致的MDR、凋亡通路受阻等[20-22]?；熕幬锖蜕锼幠孓D肝癌多藥耐藥的作用機制單一，中藥具有多靶點、不良反應小等特點，研究前景廣闊。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊具有抗腫瘤活性，可逆轉腫瘤的多藥耐藥。本研究通過比較HepG2、耐藥細胞HepG2/ADM的形態(tài)差異以及HepG2/ADM細胞對5種臨床常用化療藥物的耐藥性，確定HepG2/ADM細胞的多藥耐藥作用。在逆轉MDR實驗中，選擇PAE2的安全劑量IC20與化療藥物聯(lián)用，確定PAE2具有逆轉HepG2/ADM細胞多藥耐藥的作用。由于HepG2/ADM細胞可增加藥物外排，本研究利用阿霉素自發(fā)紅色熒光的特點，采用激光共聚焦觀察HepG2/ADM細胞中阿霉素的累積，結果顯示，PAE2組細胞中紅色熒光明顯增多，表明PAE2減少了藥物外排。

細胞凋亡是受多基因控制的細胞自主、有序的死亡，包括抑癌基因p53、Caspase家族、Bcl-2家族等[7]。Bax是人體最主要的凋亡基因，屬于Bcl-2家族，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產生抑制作用。Bcl-2是細胞凋亡中重要的抑凋亡因子，可增強細胞對大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性，抑制大多數(shù)化療藥物引起的靶細胞凋亡，但對細胞損傷和DNA修復沒有影響。Caspase-9是Caspase家族的重要成員，受到凋亡刺激時可生成放大凋亡反應的p37亞基，裂解的Caspase-9進一步加工其他Caspase成員如Caspase-3、Caspase-7，啟動Caspase級聯(lián)，導致細胞凋亡。PARP是一類涉及DNA損傷反應的核蛋白酶家族，由PARP剪切的cleaved PARP被認為是細胞凋亡的一個重要指標[23-25]。本研究結果顯示，PAE2可顯著上調HepG2/ADM細胞Bax、cleaved Caspase-9 p37蛋白表達，顯著下調Bcl-2蛋白表達。表明PAE2可上調促凋亡蛋白、下調抗凋亡蛋白，加速細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)與HepG2細胞相比，HepG2/ADM細胞中促凋亡相關蛋白表達水平顯著增加，推測這可能是耐藥細胞的一種自我保護機制，耐藥細胞能量代謝快，通過促進部分細胞凋亡，以獲得更多能量，后續(xù)研究有待進一步驗證。

PKC是一種磷脂依賴性的胞質絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與細胞內信號轉導[23]。研究表明，細胞的多藥耐藥與BCRP、Top Ⅱ聯(lián)系密切[24-25]。結果顯示，PAE2顯著降低HepG2/ADM細胞中多藥耐藥相關蛋白（）、酶介導的MDR途徑中相關因子（、）mRNA水平，降低HepG2/ADM細胞的多藥耐藥性。多藥耐藥阻礙現(xiàn)代醫(yī)學科學發(fā)展，且細胞耐藥機制復雜。PAE2成分明確、作用靶點多樣，本研究從逆轉多藥耐藥的角度為臨床克服多藥耐藥提供了一種新的可能，為其臨床研究奠定基礎。課題組后續(xù)將對多藥耐藥的體內研究、能量代謝等進一步探究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of polypeptide fromon reversing multi-drug resistance of hepatocellular carcinoma in HepG2/ADM cells

LI Cai-lin, LYU Hong, ZHANG Hong-han, WANG Yan-quan, PENG Fang

Yunnan Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,College of Pharmacy, Dali University, Dali 671000, China

To investigate the reverse effect of polypeptide from Meizhoudalian () (PAE2) on multi-drug resistance of HepG2/ADM cells.The drug resistance of HepG2/ADM cells to different chemotherapeutic drugs and effects of PAE2combined with chemotherapeutic drugs on proliferation of HepG2/ADM cells were detected by MTT; The influence of PAE2on drug accumulation was observed by Laser Scanning Confocal Microscopy; The expression of Bcl-2 associated X (Bax), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), cysteinyl aspartate specific proteinase 9 (Caspase-9) and poly ADP-ribose polymerase (PARP) were detected by Western blotting; qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of multiple drug resistance 1 (MDR1), breast cancer resistant protein (BCRP), protein kinase C (PKC) and topoisomerase Ⅱ (Top Ⅱ).Growth of HepG2/ADM cells was inhibited by PAE2with a time and dose dependent. PAE2reversed the multi-drug resistance of HepG2/ADM cells to different chemotherapeutic drugs; Level of doxorubicin in drug-resistant cells was increased by PAE2in a dose-dependent manner. Expressions of Bax, cleaved Caspase-9 p37 were significantly increased (< 0.05,0.01) and the expression of Bcl-2 was significantly decreased by PAE2in HepG2/ADM cells (< 0.01), the expression of cleaved PARP had no changed. Levels of,,andmRNA in HepG2/ADM cells were significantly reduced by PAE2.PAE2reversed the multidrug resistance of HepG2/ADM cells by reducing drug efflux, promoting cell apoptosis and reducing the expressions of drug-resistant protein.

Meizhoudalian () polypeptide; PAE2; hepatocellular carcinoma; multi-drug resistance; HepG2/ADM cells

R285.5

A

0253 - 2670(2021)01 - 0152 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.019

2020-07-10

國家自然科學基金資助項目（81560600）；云南省應用基礎研究重點項目（2017FH001-010）

李彩琳（1993—），云南曲靖人，碩士研究生，研究方向為抗腫瘤藥理學。E-mail: 253550890@qq.com

彭 芳，教授，碩士，研究方向為抗腫瘤藥理學。Tel: (0872)2257392 E-mail: pengfang6556@aliyun.com

[責任編輯 李亞楠]