胥愛麗，鐘惠嫻，楊小龍，畢曉黎，肖觀林，陳昭，江潔怡

(1. 廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院，廣東 廣州 510095； 2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095； 3.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244； 4.廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405)

玉屏風顆粒由黃芪、炒白術、防風3味藥組成，作為經(jīng)典的中藥免疫調節(jié)劑，主治“表虛不固，自汗惡風，面色?儯&白，或體虛易感風邪者”，臨床上廣泛應用于機體免疫力的提高以及免疫功能失衡/低下引起的反復感冒、過敏性鼻炎、哮喘等各種疾病[1-7]。方中黃芪補肺益氣、固表止汗，是為君藥。黃芪主要含有多糖、黃酮及皂苷類成分，其中黃芪皂苷具有多種藥理活性。研究表明，黃芪皂苷能提高小鼠血清IL-2、IL-4含量，恢復低下的細胞免疫；降低IL-6含量，保護化療引起的骨髓造血功能損傷，促進正常造血功能的恢復，還可升高不同證型小鼠人免疫球蛋白G(IgG1)、IgG2水平，調節(jié)小鼠IL-2/IL-4平衡，即提高IL-2水平，降低IL-4水平，以提高機體免疫力，提示黃芪皂苷在免疫系統(tǒng)疾病的治療方面發(fā)揮著重要的作用，與玉屏風顆粒的功效密切相關[8-10]。

目前，對玉屏風顆粒的質量控制以黃芪甲苷、黃酮類的單一成分指標含量為主，也有UPLC-DAD指紋圖譜及UPLC-MS多成分含量測定的報道，但其皂苷類成分的多指標成分同時測定方法卻尚未有報道[11-15]。本研究采用UPLC-MS法同時測定方中黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ共6個皂苷類成分的含量，為全面評價玉屏風顆粒的質量提供有效、快速的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters UPLC- Xevo TQ-S micro三重四極桿液質聯(lián)用儀(美國沃特斯公司)；XS205DU梅特勒電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ700-DE型數(shù)控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

黃芪甲苷(批號：H-013-170614)、黃芪皂苷Ⅰ(批號：H-038-160905)、黃芪皂苷Ⅱ(批號：H-037-161216)、黃芪皂苷Ⅲ(批號：H-036-160908)的質量分數(shù)均為98%，均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；異黃芪皂苷Ⅰ(批號：AF-8051838)、異黃芪皂苷Ⅱ(批號：AF-8051839)的質量分數(shù)均為98%，均購自成都埃法生物科技有限公司；乙腈、甲酸(色譜純，德國Merck)，水為超純水；甲醇(分析純，廣州化學試劑廠)；10批玉屏風顆粒由國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司提供，批號分別為170329、170521、170703、170818、171012、171102、171203、180113、180317、180411。

2 方法與結果

2.1 LC-MS檢測條件

2.1.1 質譜條件 ESI離子源，噴霧電壓2 300 V，汽化室溫度500 ℃，鞘氣(N2)流速：900 L/h，碰撞氣(Ar)流速：1 L/h，離子傳輸管溫度150 ℃；各待測組分及內標質譜參數(shù)見表1。

2.1.2 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相：乙腈(A)-水溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～27%A；5～11 min，27%～35%A；11～16 min，35%～50%A；16～20 min，50%～100%A)；流量：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的離子流圖分別見圖1～2。

表1 玉屏風顆粒中6種待測化合物的質譜條件

1.黃芪甲苷； 2.黃芪皂苷Ⅲ； 3.黃芪皂苷Ⅱ； 4.異黃芪皂苷Ⅱ； 5.黃芪皂苷Ⅰ； 6.異黃芪皂苷Ⅰ。

圖2 各待測成分離子流圖

2.2 供試品溶液的制備

取本品顆粒約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液100 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別取黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成黃芪甲苷35.5 μg/mL、黃芪皂苷Ⅲ 125.0 μg/mL、黃芪皂苷Ⅱ74.5 μg/mL、異黃芪皂苷Ⅱ63.0 μg/mL、黃芪皂苷Ⅰ81.0 μg/mL、異黃芪皂苷Ⅰ58.0 μg/mL的對照品儲備液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系的考察 分別精密吸取不同體積各對照品儲備液適量，置10 mL量瓶內，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列質量濃度的混合對照品溶液，分別精密吸取2 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項檢測條件進行測定，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，求得對數(shù)回歸方程及線性范圍分別為：黃芪甲苷，y=2 564x+151.5，r=0.999 8，0.1775～3.55 μg/mL；黃芪皂苷Ⅲ，y=58 173x- 712.6，r=0.999 5，0.0625～1.25 μg/mL；黃芪皂苷Ⅱ，y=1 675x+114.7，r=0.999 7，0.298～5.96 μg/mL；異黃芪皂苷Ⅱ，y=1 565x+46.24，r=0.999 5，0.1575～3.15；黃芪皂苷Ⅰ，y=1 232x+8.630，r=0.999 6，0.202 5～4.05；異黃芪皂苷Ⅰ，y=1 125x+79.59，r=0.999 7，0.29～5.8 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗 取同一批供試品(171102)，按“2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項條件連續(xù)進樣6次，結果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ色譜峰峰面積的RSD值分別為1.28%、1.33%、0.99%、1.47%、1.50%、1.37%，表明方法精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批供試品(171102)，按“2.2”項方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件依次測定，結果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ質量分數(shù)的RSD值分別為2.58%、2.76%、2.12%、1.56%、1.43%、1.08%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品(171102)，按“2.2”項方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣測定，結果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ色譜峰峰面積的RSD分別為1.27%、1.26%、1.98%、1.82%、1.90%、1.82%，表明供試品溶液中的各成分在12 h內穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗 取同一批供試品(170329)約0.5 g，精密稱定6份，分別加入相應濃度的黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ對照品溶液各0.1 mL(此處對照品為另外配制，并非使用2.3項下的對照品來配制的)，揮干溶劑，再按“2.2”項方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件依次測定，計算加樣回收率，結果表明黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ分別為100.64%、97.66%、100.89%、104.57%、101.73%、98.19%，RSD分別為3.54%、1.93%、2.63%、2.42%、3.35%、2.57%，見表2。

2.4.6 樣品定量測定 取10批玉屏風顆粒樣品，按“2.2”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項條件進行測定，計算各樣品中黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ質量分數(shù)，結果見表3。

表2 玉屏風顆粒中6種成分的加樣回收率試驗結果

表2 (續(xù))

表3 10批玉屏風顆粒中6種成分質量分數(shù)測定結果

3 討論

采用UPLC-MS法測定制劑中成分的含量，由于是用待測組分的不同離子對來定性，因此方法對色譜條件的分離度要求不高，但玉屏風顆粒中的黃芪所含的皂苷類成分結構較相似，會出現(xiàn)質荷比和碎片離子均相同的情況，故在建立多個皂苷類成分同時測定的方法時對色譜分離度有一定的要求，還需結合出峰時間來對待測組份進行定性。皂苷類成分常采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)進行測定，但該檢測器重現(xiàn)性較差，影響因素較多，可被液質聯(lián)用法取代。

本研究先后考察了不同溶劑(甲醇和50%甲醇)、不同提取時間(15、30、60 min)，結果以甲醇提取效果較好，提取時間為30 min時可提取完全。對不同流動相系統(tǒng)(乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液)進行考察，結果顯示流動相中加入甲酸后各成分的分子離子峰響應較高，且峰形較好，在該方法確定的流動相梯度洗脫下，各峰均能較好地分離，能準確地對各成分進行定量。

本研究建立了同時測定玉屏風顆粒中6個皂苷類成分(黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ)的定量分析方法，結果表明該制劑10批樣品之間差異較小，批次之間質量較穩(wěn)定，說明玉屏風顆粒作為全國名優(yōu)中成藥，其工藝穩(wěn)定，原料質量控制嚴格，從而保證了制劑成品的質量穩(wěn)定。該方法快速、簡便、結果準確，對全面控制玉屏風顆粒的質量具有指導意義。