譚健鋒 溫 威 黃華聰△ 高卓維,2*

（1 南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院，廣東 佛山 528308；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院，廣東 佛山 528300）

心臟通過(guò)一系列反應(yīng)來(lái)響應(yīng)環(huán)境刺激，包括腔室容積，收縮壓收縮，舒張期舒張，心率和肌肉質(zhì)量的變化。生理性肥大通常發(fā)生在對(duì)健康運(yùn)動(dòng)或懷孕的正常反應(yīng)期間[1]。病理性肥大通常由壓力刺激或由疾病引起，如高血壓，心臟瓣膜病，心肌梗死和神經(jīng)激素。病理性心臟肥大通過(guò)在早期階段增加心臟超負(fù)荷起到補(bǔ)償作用。然而，持續(xù)的病理性肥厚反應(yīng)最終導(dǎo)致收縮功能障礙和心力衰竭[2]。病理性心臟肥大最要由心肌細(xì)胞適應(yīng)不良性肥大、心肌細(xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞外基質(zhì)纖維化[3]。作為治療選擇，抑制病理性心肌細(xì)胞肥大已成為許多心血管疾病潛在的治療靶點(diǎn)[4]。TGF-β1/Smad信號(hào)通路在心臟重構(gòu)以及心力衰竭的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，參與了包括心肌細(xì)胞肥大，心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化等進(jìn)程，并調(diào)節(jié)壓力超負(fù)荷心臟中的基質(zhì)代謝[5]。由于其在心臟重構(gòu)中的關(guān)鍵作用，TGF-β信號(hào)通路可能是心力衰竭患者新的治療靶點(diǎn)[6]。人參養(yǎng)榮湯出自于《太平惠明和劑局方》，是益氣補(bǔ)血的代表方，被廣泛地應(yīng)用于心血管疾病的防治當(dāng)中[7]。但其作用機(jī)制仍未明確，本研究對(duì)人參養(yǎng)榮湯抗血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大作用進(jìn)行探討，并明確TGF-β1/Smad信號(hào)通路在人參養(yǎng)榮湯抑制心肌細(xì)胞病理性肥大中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Wistar大鼠購(gòu)買自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK粵4402102064）。于南方醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，提供清潔的飼料、飲用水以及晝夜各 12 h的規(guī)律光照。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：實(shí)驗(yàn)所用中藥黃芪、當(dāng)歸、桂枝、炙甘草、陳皮、白術(shù)、人參、白芍、熟地黃、五味子、茯苓、遠(yuǎn)志、大棗均購(gòu)買自致信藥業(yè)或康美藥業(yè)。TGF-β1、Smad2，Smad3和 GAPDH的抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶與磷酸酶抑制劑、RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)買自碧云天生物科技有限公司。PVDF膜、ECL發(fā)光液購(gòu)買自Millipore公司。MTT購(gòu)買自美國(guó)SIGMA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材：BIO-RAD電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購(gòu)買自美國(guó)伯樂(lè)太平洋有限公司，曝光機(jī)為KODAK 全光譜多功能活體成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀購(gòu)買自美國(guó)SIGMA公司，電子天平購(gòu)買自梅特勒一托利多儀器有限公司，MICROMAX高速離心機(jī)購(gòu)買自賽默飛世爾科技公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)：H9C2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）。H9C2細(xì)胞在使用含有10%FBS（美國(guó)Gibco公司）的DMEM中培養(yǎng)（美國(guó)Gibco公司）并置于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前，H9C2采用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)24 h，隨后根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)分組加入AngⅡ和含藥血清。

1.5 含藥血清制備：SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，讓后隨機(jī)為空白對(duì)照組和人參養(yǎng)榮湯給藥組，每組12只。人參養(yǎng)榮湯給藥組按大鼠與人體積等效劑量系數(shù)折算給藥（劑量為7.5 g/kg）；空白對(duì)照組給與等體積理鹽水進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃3 d，每天2次；第4天清晨給藥1 h后腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min后離心（1500 rpm，10 min），取上層血清并置于56 ℃恒溫水浴鍋中滅活30 min，并用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力：通過(guò)MTT法檢測(cè)AngⅡ和人參養(yǎng)榮湯含藥血清對(duì)H9C2心肌細(xì)胞活力的影響。將收集的細(xì)胞按（5×103/mL）加入在96孔板中，并加入不同濃度的AngⅡ和人參養(yǎng)榮湯含藥血清培養(yǎng)24 h。然后棄培養(yǎng)基，加入10 μL MTT溶液（0.5 mg/mL，PBS溶解）到每個(gè)孔中。在37 ℃孵育4 h后，棄MTT加入200 μL DMSO，避光孵育10 min后通過(guò)酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)量OD值。

1.7 qPCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中ANF、α-SMA、GAPDH mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組：空白組、模型組（AngⅡ）、人參養(yǎng)榮湯低濃度組（AngⅡ+10%人參養(yǎng)榮湯含藥血清）、人參養(yǎng)榮湯高濃度組（AngⅡ+15%人參養(yǎng)榮湯含藥血清）。細(xì)胞經(jīng)上述處理24 h后，用TRIzol提取各組細(xì)胞的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（1～2 μg），用于各個(gè)基因的特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用相對(duì)定量方法比較轉(zhuǎn)錄物量，其中將檢測(cè)到的mRNA的量標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)源對(duì)照（GAPDH）。

表1 ANF、α-SMA、GAPDH引物堿基序列

1.8 Western blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞中TGF-β1、Smad2、Smad3信號(hào)通路表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分組：空白組、模型組（AngⅡ）、人參養(yǎng)榮湯低濃度組（AngⅡ+10%人參養(yǎng)榮湯含藥血清）、人參養(yǎng)榮湯高濃度組（AngⅡ+15%人參養(yǎng)榮湯含藥血清）。收集經(jīng)過(guò)不同處理的心肌細(xì)胞，計(jì)入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液提取培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)。裂解30 min后12000 rpm，4 ℃下離心15 min，取蛋白上清液。在10%SDS-PAGE凝膠上分離大約20 mg蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，接著用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h。然后把切割好的膜分別與相應(yīng)的一抗在4 ℃溫育過(guò)夜（TGF-β1、Smad2、Smad3、GAPDH，稀釋濃度1∶1000）。一抗孵育結(jié)束后用含有TBST洗滌三遍，并于4 ℃下孵育二抗2 h。通過(guò)ECL化學(xué)發(fā)光液曝光得到蛋白條帶，并使用ImageJ軟件分析條帶蛋白濃度。

1.9 數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如數(shù)據(jù)滿足方差齊性，所有指標(biāo)多組間比較分析均采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），如不滿足方差齊性，組間多重比較則采用Dunn's檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參養(yǎng)榮湯對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞活力的影響：MTT結(jié)果顯示，與空白組相比較，人參養(yǎng)榮湯在5%～20%含藥血清濃度范圍內(nèi)并未明顯促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞活力（圖1-A）。我們分別選擇10%和15%含藥血清作為人參養(yǎng)榮湯低、高濃度組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)圖1-B結(jié)果顯示，AngⅡ模型組能夠顯著促進(jìn)H9C2心肌細(xì)胞活力。人參養(yǎng)榮湯低、高劑量組能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的增高心肌細(xì)胞活力，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）并成濃度依賴性。結(jié)果提示AngⅡ能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，促進(jìn)細(xì)胞活力異常增高，人參養(yǎng)榮湯能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞病理性肥大。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 H9C2心肌細(xì)胞活力

2.2 各組心肌細(xì)胞中ANF、α-SMA mRNA表達(dá)水平：與空白組相比較，AngⅡ模型組顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞中ANF、α-SMA mRNA的表達(dá)。人參養(yǎng)榮湯低、高劑量組能夠AngⅡ誘導(dǎo)的ANF、α-SMA mRNA的表達(dá)，并呈濃度依賴性。見(jiàn)表2。

表2 心肌細(xì)胞中ANF、α-SMA mRNA表達(dá)水平（±s）

表2 心肌細(xì)胞中ANF、α-SMA mRNA表達(dá)水平（±s）

注：與模型組相比較，*P<0.05

2.3 各組心肌細(xì)胞中TGF-β1/Smad信號(hào)通路表達(dá)水平：與空白組相比較，AngⅡ處理H9C2心肌細(xì)胞24 h后顯著促進(jìn)TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白水平。與AngⅡ模型組相比較，人參養(yǎng)榮湯低、高劑量組顯著抑制TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示人參養(yǎng)榮湯能夠抑制心肌細(xì)胞中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá)水平。見(jiàn)圖2。

圖2 心肌細(xì)胞中TGF-β1/Smad信號(hào)通路水平

3 討 論

心臟肥大被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)病率和病死率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。即使一些心腦血管藥物如今可以治療由心臟肥大引起的心力衰竭，但其病死率仍然很高[9]。因此，尋找防治心臟肥大和心力衰竭的新藥物具有重要的臨床意義。在細(xì)胞水平上，病理性心臟肥大的典型特征是增加的心肌細(xì)胞大小，肌節(jié)結(jié)構(gòu)的分離，增強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成以及胎兒基因重新表達(dá)（ANF和α-SMA）[10]。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的過(guò)度激活在啟動(dòng)心室重構(gòu)，以及由重構(gòu)發(fā)展到心衰的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[11]。針對(duì)這兩個(gè)系統(tǒng)開發(fā)的藥物如：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（Angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（Angiotensin Ⅱ receptor antagonist，ARB）等防治心室重構(gòu)和心力衰竭的療效已被大量循證醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，并寫入治療指南[12]。血管緊張素Ⅱ （AngⅡ）通過(guò)AT1依賴性相互作用促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大并刺激成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)[13]。AngⅡ是誘發(fā)心肌肥厚的主要因素之一，可導(dǎo)致心臟肥大并加重心力衰竭[14]。大量證據(jù)表明RAS系統(tǒng)與TGF-β之間存在直接聯(lián)系，表明TGF-β1作用于血管緊張素Ⅱ的下游[15-17]。血管緊張素Ⅱ刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)[18]。ACE抑制劑或AT1受體阻滯劑治療顯著降低肥大和梗死心臟中的TGF-β1水平，提示重塑心肌中TGF-β1的誘導(dǎo)至少部分是通過(guò)血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的[19]。研究表明，使用TGF-β1抑制劑通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá)與活化，顯著抑制Ang Ⅱ輸注小鼠的心臟肥大，纖維化和功能障礙[20]。本研究發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ作用與H9C2心肌細(xì)胞24 h后，可增加心肌細(xì)胞活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞病理性肥大，增加心肌細(xì)胞內(nèi)ANF和α-SMA mRNA和TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá)水平，與既往研究結(jié)果相一致。

心肌肥大作為一個(gè)從心梗到心衰之間的病理過(guò)程，在中醫(yī)古籍中并無(wú)具體的病名或病因病機(jī)的記載。但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，正氣不足乃其內(nèi)傷基礎(chǔ)，貫穿于發(fā)病的整個(gè)過(guò)程[21]。因此治療上當(dāng)以益氣補(bǔ)血為治療原則。臨床上采用益氣補(bǔ)血法防治心血管疾病常取得較好療效[22-23]。人參養(yǎng)榮湯出自宋代的《太平惠民和劑局方》，是益氣養(yǎng)血法的代表方，方中用人參、黃芪，陳皮、白術(shù)、茯苓健脾益氣，補(bǔ)元?dú)馐箽馔?，周流全身；熟地黃、白芍、當(dāng)歸養(yǎng)血行血；遠(yuǎn)志、五味子養(yǎng)心安神；桂心補(bǔ)陽(yáng)活血。諸藥相合，補(bǔ)氣養(yǎng)血，共奏補(bǔ)虛養(yǎng)心之功。林慧娟[24]等采用人參養(yǎng)榮湯治療心肌缺血，能夠改善活動(dòng)后胸悶，心慌。趙洪運(yùn)[25]等使用人參養(yǎng)榮湯治療急性病毒性心肌炎，發(fā)現(xiàn)與常規(guī)治療相比，加用人參養(yǎng)榮湯能夠更快地促進(jìn)癥狀消失，心電圖、心肌酶譜恢復(fù)正常?，F(xiàn)代藥理血研究表明，方中諸藥的多種有效成分具有防治心血管病作用[26-28]。人參中的有效成分人參皂苷Rd能夠通過(guò)抑制小鼠心肌內(nèi)AKT、TGF-β1的表達(dá)水平，顯著改善了壓力超負(fù)荷引起的小鼠收縮功能障礙，纖維化，心肌肥厚，炎癥和氧化應(yīng)激，同時(shí)抑制由苯腎上腺素誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞肥大，從而改善心室重構(gòu)和心力衰竭[29]。另外，有研究報(bào)道黃芪中的主要成分黃芪甲苷（ASIV）聯(lián)合電針干預(yù)對(duì)異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠，能夠顯著改善大鼠心肌肥厚以及抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活[30]。本研究對(duì)人參養(yǎng)榮湯抑制心肌細(xì)胞病理性肥大作用進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)人參養(yǎng)榮湯能夠顯著抑制由AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，降低心肌細(xì)胞內(nèi)ANF、BNF的mRNA水平，同時(shí)抑制心肌細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)人參養(yǎng)榮湯可能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的表達(dá)發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞病理性肥大，未人參養(yǎng)榮湯防治心臟肥大，改善心室重構(gòu)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。本研究?jī)H基于細(xì)胞水平進(jìn)行，后續(xù)仍需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察進(jìn)行一步探討。