李培勇 曾崎岡 戴勇 魏成功 老昌輝

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路在腫瘤細(xì)胞增殖分化、衰老凋亡等多樣生物學(xué)活性方面起著樞紐作用，可作為惡性腫瘤分子治療的前衛(wèi)靶點(diǎn)[1]。絲裂原活化蛋白激酶-7（mitogen-activated protein kinase kinase-7，MKK-7）參與細(xì)胞炎癥因子和應(yīng)激刺激等信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答，通過磷酸化JNK結(jié)構(gòu)域而特異性激活JNK活性[2]，MKK-7/JNK通路直接影響腫瘤細(xì)胞的功能狀態(tài)，但MKK-7作用復(fù)雜，其雙向調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡述[3]。中醫(yī)藥防治非小細(xì)胞肺癌，特別是在疾病的終末期，可起到明顯改善臨床癥狀、緩解并發(fā)癥等作用[4]。本課題組前期研究顯示補(bǔ)腎培元膠囊臨床治療多種惡性腫瘤性疾病療效顯著，其藥效機(jī)制與JNK信號通路有關(guān)[5]。本研究旨在從血清藥理學(xué)維度探索補(bǔ)腎培元膠囊對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞抗增殖特性調(diào)控機(jī)制，為藥物進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)結(jié)論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞株，由廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院細(xì)胞庫惠贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級SD雄性大鼠，（200±20）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證編號：No44007200048391。

1.2 藥品試劑 補(bǔ)腎培元膠囊（簡稱BSPY，廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室，批號：粵Z20070308）。5-氟尿嘧啶（5-FU，上海麥克林公司）；GlutaMAX?培 養(yǎng) 基、0.25% Trypsin-EDTA、胎牛血清（美國賽默飛公司）；JNK、MKK-7 Rabbit Polyclonal antidody（美國Proteintech公司）；JNK、MKK-7 Primer均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 主要儀器 Leica DMi8高速成像平臺(tái)[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司]；SmartSpec plus核酸蛋白測定儀、IQTM5型熒光定量PCR儀、電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司）；低溫離心機(jī)（美國IEC公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州中亞凈化設(shè)備有限公司）；GUIGO-99-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（上海桂戈科學(xué)儀器有限公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法顯微鏡下計(jì)數(shù)，加入含有10%胎牛血清和1%鏈霉素的GlutaMAX? 培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)后于5%CO2、37 ℃、100%濕度下培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 含藥血清的制備 含藥血清制備方法參照課題組已完成的補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法[5-6]：健康大鼠10只，每天禁食10～12 h后，依據(jù)人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表方法，人與大鼠等效轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.018，補(bǔ)腎培元膠囊每日口服劑量3.6 g計(jì)算，3.6 g×0.018=0.064 8 g/d，根據(jù)每只大鼠每天灌胃2 mL，得出藥物濃度為0.032 4 g/mL。藥物于每日灌胃前配制，連續(xù)給藥14 d，灌胃2次/d，第14天晚上開始禁食不禁水，最后一次給藥1 h后，予采用20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉，無菌條件下從腹主動(dòng)脈采血，分離除菌后血清-20 ℃保存?zhèn)溆?。另取健康大?0只，按上述給藥操作方法給予等量生理鹽水灌胃，余處理方法同上。

1.6 CCK8法檢測補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞采用GlutaMAX?培養(yǎng)基于96孔板中調(diào)整終濃度至5×105/mL，采取190 μL細(xì)胞/孔，分為空白對照組、陽性對照組和補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清組，均培養(yǎng)24 h?？瞻讓φ战M加普通血清10 μL，陽性對照組加入50 μmol/L的5-FU 10 μL。補(bǔ)腎培元膠囊血清組分別加入10%、20%、30%的含藥血清（均為10 μL），各組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃溫育1 h后于酶標(biāo)儀450 nm單波長處測定各孔吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞生長的抑制率（IR）。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞JNK、MKK-7核酸表達(dá)影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，取胰酶消化后A549細(xì)胞，采用Trizol一步法試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，采用圖像分析儀分析數(shù)據(jù)，運(yùn)用公式2-△△Ct計(jì)算基因相對表達(dá)量。見表1。

表1 RT-qPCR檢測基因引物序列

1.8 Western blotting測定補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞JNK、MKK-7蛋白表達(dá)影響 常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)72 h，提取蛋白，BCA法調(diào)整蛋白濃度，取50 μg總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜取出經(jīng)封閉后一抗4 ℃過夜，二抗搖床恒溫孵育后，ECL暗室曝光，經(jīng)顯影定影后采用E-Gel Imager Software采集圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 空白對照組A549細(xì)胞體外生長情況

圖2 陽性對照組A549細(xì)胞體外生長情況

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制測定 補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞72 h后，隨著藥物血清濃度的增加，對A549細(xì)胞抗增殖作用呈現(xiàn)時(shí)間-濃度依賴改變，以30%BSPY組作用72 h時(shí)A549細(xì)胞形態(tài)變化最明顯，此時(shí)鏡下觀察腫瘤細(xì)胞受損明顯，細(xì)胞不規(guī)則樣聚集，細(xì)胞間隙增大，活細(xì)胞數(shù)量降低，懸浮細(xì)胞增多，見圖1～5。

圖3 10%BSPY組A549細(xì)胞體外生長情況（給藥72 h，100×）

圖4 20%BSPY組A549細(xì)胞體外生長情況（給藥72 h，100×）

圖5 30%BSPY組A549細(xì)胞體外生長情況（給藥72 h，100×）

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 單因素方差分析結(jié)果顯示，各給藥組24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中以給藥72 h后最為顯著。10%BSPY組24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率均低于陽性對照組（P<0.05）；20%BSPY組、30%BSPY組24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率均高于陽性對照組（P<0.05）。見表2。

表2 不同濃度補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對A549細(xì)胞體外生長不同時(shí)間細(xì)胞增殖抑制率的影響[%，（）]

表2 不同濃度補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對A549細(xì)胞體外生長不同時(shí)間細(xì)胞增殖抑制率的影響[%，（）]

*與空白對照組相比，P<0.05；△與陽性對照組相比，P<0.05。

2.3 JNK、MKK-7 mRNA表達(dá)測定 單因素方差分析結(jié)果顯示，各給藥組JNK mRNA表達(dá)與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與陽性對照組比較，各給藥組JNK mRNA表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對照組相比，除陽性對照組外，其余各給藥組MKK-7 mRNA表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與陽性對照組比較，各給藥組MKK-7 mRNA表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.4 JNK、MKK-7蛋白表達(dá)測定 單因素方差分析結(jié)果顯示，各給藥組JNK蛋白表達(dá)與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各給藥組JNK蛋白表達(dá)水平與陽性對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。除陽性對照組外，其余各給藥組MKK-7蛋白表達(dá)與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表3 不同濃度補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對A549細(xì)胞JNK、MKK-7 mRNA相對表達(dá)量的影響（）

表3 不同濃度補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對A549細(xì)胞JNK、MKK-7 mRNA相對表達(dá)量的影響（）

*與空白對照組相比，P<0.05；△與陽性對照組相比，P<0.05。

表4 不同濃度補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對A549細(xì)胞JNK、MKK-7蛋白表達(dá)的影響（）

表4 不同濃度補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對A549細(xì)胞JNK、MKK-7蛋白表達(dá)的影響（）

*與空白對照組相比，P<0.05；△與陽性對照組相比，P<0.05。

3 討論

MKK-7在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用重要，但其機(jī)制極為復(fù)雜，經(jīng)原位雜交技術(shù)顯示MKK-7主要分布于腦、肺和消化系統(tǒng)中，尤以肺上皮部分表達(dá)最高[7-9]。MKK-7特異性靶標(biāo)JNK激酶而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，各種致癌因子往往通過MKK-7/JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移特性，致使細(xì)胞周期受阻，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞增殖分化功能受損[10]。目前研究認(rèn)為MKK-7在肺癌模型中扮演的主要是腫瘤抑制因子的角色，因而MKK-7是抗癌屏障中至關(guān)重要的感應(yīng)靶點(diǎn)之一[11]。MKK-7穩(wěn)定表達(dá)時(shí)，癌基因c-myc、血管生成素等腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)的癌性基因表達(dá)明顯下調(diào)，表明MKK-7負(fù)性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖[12-13]。盡管如此，仍有研究結(jié)果認(rèn)為MKK-7還同時(shí)具有致癌作用。在鱗癌患者肺組織中MKK-7的mRNA表達(dá)較正常肺組織上調(diào)顯著，抑制MKK-7的表達(dá)可顯著抑制腫瘤轉(zhuǎn)移改變，其機(jī)制可能與阻礙下游JNK的磷酸化有關(guān)[14]。以上研究結(jié)論的不一致性結(jié)果提示MKK-7復(fù)雜的生物反應(yīng)可能與JNK信號通路復(fù)雜性有關(guān)，其信號通路作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡述。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺癌屬于“肺積”“痞癖”“咯血”等范疇，“邪積胸中，阻塞氣道……邪既勝，正不得而制之，遂結(jié)成形而有塊”，《雜病源流犀燭》中的這段病因病機(jī)的描述，極佳地闡釋了肺癌的發(fā)生、發(fā)展與人身正氣虧耗、邪毒搏結(jié)有關(guān)[15-16]。肺癌初起邪毒瘀滯，實(shí)證蜂起，虛損之候可較隱晦，若至肺癌晚期，邪毒毀正，肺脾腎多臟虛損，遏邪乏權(quán)，此時(shí)虛證凸顯，耗氣傷血，陰陽俱損，假如患者采取手術(shù)方法切除腫瘤，則術(shù)后肺癌患者也可由于手術(shù)致陽氣虛弱，陽損及陰而陰陽俱損于后，肺脾腎三臟之氣陰兩虛、陰陽并損的見證則隨之而至。課題組針對肺癌的病因病機(jī)特點(diǎn)，認(rèn)為肺癌腎陽虛寒毒內(nèi)盛的主要特點(diǎn)，以“熱病屬陽，陽邪易散易治，不死；冷病屬陰，陰邪易伏，故令人不覺，久則變?yōu)樘摵?，侵蝕臟腑而死”為主要理論指導(dǎo)，創(chuàng)制了補(bǔ)腎培元膠囊治療肺癌等多種惡性腫瘤，臨床獲益顯著[17-18]。補(bǔ)腎培元膠囊由熟地、肉蓯蓉、核桃仁、冬蟲夏草、黨參、菟絲子六味藥組成，方小精簡而力專效宏，現(xiàn)代研究顯示方中單味藥物的有效成分均有抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用，因而補(bǔ)腎培元膠囊綜合其中藥味性用，溫而不燥，補(bǔ)而不滯，扶正固元而調(diào)整人身之陰陽平衡，從而形成補(bǔ)而不滯、溫而不燥、通補(bǔ)結(jié)合的藥物特點(diǎn)[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在陽性對照組的JNK與MKK-7表達(dá)上，MKK-7與JNK的mRNA、蛋白表達(dá)與MKK-7的mRNA、蛋白表達(dá)呈反向改變，當(dāng)肺癌A549細(xì)胞增殖抑制時(shí)，MKK-7表達(dá)升高，而JNK表達(dá)下降，表明MKK-7作為抑癌表達(dá)因子，可通過抑制JNK信號通路從而抑制A549細(xì)胞增殖。采用補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清干預(yù)肺癌A549細(xì)胞后，A549細(xì)胞增殖受到明顯抑制，其腫瘤細(xì)胞惡性細(xì)胞生長形態(tài)受到顯著抑制。與空白對照組、陽性對照組相比，30%BSPY組的JNK mRNA、蛋白表達(dá)量降低最顯著，其MKK-7 mRNA及蛋白表達(dá)量升高改變也最為顯著，表明補(bǔ)腎培元膠囊的藥效機(jī)制可能通過穩(wěn)定表達(dá)MKK-7，從而活化MKK-7/JNK信號通路表達(dá)，最終起到抑制肺癌A549細(xì)胞增殖作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了補(bǔ)腎培元膠囊含藥血清對肺癌A549細(xì)胞的抗增殖作用，其藥效機(jī)制與調(diào)控MKK-7/JNK信號通路有關(guān)，對今后進(jìn)一步開展補(bǔ)腎培元膠囊調(diào)控MKK-7/JNK信號途徑的深層次調(diào)控表達(dá)效應(yīng)機(jī)制具有重大的臨床意義。