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        復(fù)方蓯蓉精水提液對帕金森病模型大鼠中腦GSK-3β表達的影響

        2021-01-05 13:35:58肖紹堅王志汕陳詩雅林友寧鐘佳男
        環(huán)球中醫(yī)藥 2020年11期
        關(guān)鍵詞:蓯蓉提液光密度

        肖紹堅 王志汕 陳詩雅 林友寧 鐘佳男

        帕金森病(Parkinson’s disease,PD)其特征性的病理變化是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的變性死亡和路易小體(其主要成分是錯誤折疊的a-synuclein)的出現(xiàn)[1]。而a-synuclein是糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)的下游蛋白,二者與PD的發(fā)病密切相關(guān)。GSK-3β作為一種多功能的絲氨酸/酪氨酸,其活化與神經(jīng)元凋亡的增加直接相關(guān)[2-3]。近年的研究表明[4-5],GSK-3β活性增加會導(dǎo)致DA含量顯著的減少、凋亡,而抑制GSK-3β的活性,能阻斷DA的的減少、變性、凋亡,改善和治療PD模型大鼠的癥狀。

        PD屬于中醫(yī)“顫證”范疇?!端貑枴ぶ琳嬉笳撈吩疲骸澳凶悠甙?,肝氣衰,筋不能動,天癸竭,精少,腎藏衰,形體皆極?!惫逝两鹕〉牟∥浑m在筋骨,但是病性是本虛標(biāo)實。肝腎陰虛、腦髓不足是PD最根本病機。所以,臨床治療PD應(yīng)以補肝腎,益腦髓為基礎(chǔ)。臨床試驗均表明以補腎中藥為主的方藥對PD的治療有一定作用。肉蓯蓉中主要有效成分松果菊苷可以影響大鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白的表達,對PD有一定的治療作用[6]。淫羊藿提取物淫羊藿苷可能通過PI3K/Akt信號通路來抑制GSK-3β的活性,減少tau蛋白過度磷酸化,從而保護細(xì)胞調(diào)亡[7]。同時,肉蓯蓉、淫羊藿都有抑制GSK-3β活性,減少α-syn的聚集,從而減輕多巴胺神經(jīng)元的凋亡[8]的作用。本實驗通過觀察復(fù)方蓯蓉精水提液對PD大鼠行為學(xué)和中腦GSK-3β表達的影響,繼而探討復(fù)方蓯蓉精水提液治療PD的可能機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        本實驗取50只SD健康雄性大鼠,每只大鼠的體重為(180±20)g,年齡為6周齡,由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)條件:福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中SPF級動物飼養(yǎng)室,室溫(20~22)℃,自動光暗控制,光暗各12小時,覓食、飲水自由。

        1.2 藥物與試劑

        復(fù)方蓯蓉精水提液的藥物組成為:肉蓯蓉30 g、淫羊藿30 g、制黃精54 g。由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房提供,將上述藥物粉碎,取蒸餾水(約為藥材體積10倍),浸泡1小時,加熱回流2小時,過濾收集水提液。重復(fù)上述操作,合并兩次水提液,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮,最終得到濃度分別為25、50、100 mg/mL的復(fù)方蓯蓉精水提液。

        葵花油乳液(美國Sigma公司),魚藤酮(批號:R8875),GSK-3β蛋白(美國Cell Sign-alingTeehnolegy公司),粉末型磷酸鹽緩沖液(福建福州邁新),粉末型抗原修復(fù)液(檸檬酸法),乙醇、二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

        1.3 實驗儀器

        光學(xué)顯微鏡(型號:MDL),倒置顯微鏡(型號:TS100,日本尼康公司),石蠟切片機(型號:C6,德國LEICA公司)。

        1.4 動物分組及模型制備

        將50只大鼠隨機分為2組,其中正常組10只,造模組40只。本試驗使用頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳液來建立大鼠的PD模型。每天按比例給大鼠注射1.5 mg/mL的魚藤酮葵花油乳液0.1 mL/100 g,注射前給大鼠稱重,連續(xù)給藥14天。正常組不予處理。造模過程中由于大鼠的個體差異,共8只大鼠死亡,剩下32只大鼠造模成功。把造模成功的大鼠隨機分為4組,即模型組、復(fù)方蓯蓉精水提液高、中、低劑量組,每組各8只。然后,按PD患者每日復(fù)方蓯蓉精水提液的常用劑量為47 g來計算,以人和大鼠的體表面積比公式進行換算,則大鼠每天用藥的低、中、高劑量分別為40、80、160 mg/kg,其中人的臨床等效劑量為中劑量。故復(fù)方蓯蓉精水提液低、中、高劑量組分別用濃度為25、50、100 mg/mL的復(fù)方蓯蓉精水提液,以10 mL/(kg·d)給大鼠灌胃,連續(xù)14天。正常組及模型組給予10 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃,頻次同復(fù)方蓯蓉精水提液組。

        1.5 行為學(xué)檢測

        對各組大鼠的精神狀態(tài)、覓食飲水、行為表現(xiàn)、活動狀況等進行觀察,記錄。各組大鼠在實驗干預(yù)第14天灌胃后的6小時,分別進行懸掛實驗[9]:將大鼠的前爪懸掛在水平放置的金屬絲上,金屬絲距離地面約30 cm,記錄大鼠從開始懸掛到落地之間的時間。根據(jù)記錄時間進行評分:持續(xù)0~5秒為0分,6~10秒為1分,11~15秒為2分,16~20秒為3分,21~25秒為4分,26~30秒為5分,超過30秒為6分。每次間隔約2分鐘測一次,共測3次,取其平均值。

        1.6 實驗取材

        最后一次給藥12小時后,從各組大鼠中隨機抽取6只,并用乙醚麻醉,隨后斷頭處理,在冰盤上提取大鼠中腦黑質(zhì),用冰0.9%氯化鈉溶液來反復(fù)沖洗腦組織表面的血液,待其干凈后,拿濾紙吸干腦組織表面的殘余液體,包埋腦組織,制備成石蠟切片,置于4℃冰箱保存。

        1.7 免疫熒光檢測中腦GSK-3β的表達情況

        1.7.1 免疫熒光染色 將石蠟包埋好的大鼠大腦組織連續(xù)冠狀切片,切片的厚度約為5 μm,載玻片附貼組織切片,于4℃冰箱長期保存。將石蠟切片取出,置于60℃恒溫箱1小時,此后依次置于二甲苯和不同濃度的無水乙醇浸泡,最后放入蒸餾水中(通風(fēng)櫥中進行)。之后,將石蠟切片用檸檬酸抗原修復(fù)液和PBS漂洗,再用50 μL山羊封閉血清,向每個腦組織滴加50 μL GSK-3β抗體(抗體原液提前用1%BSA配置并稀釋,抗體與抗體稀釋液比例為1∶1000,于-20℃長期保存),4℃孵育過夜至少20小時。次日,PBS漂洗后,向每個大腦組織切片滴加50 μL免疫熒光二抗(用1%牛血清白蛋白稀釋,抗體原液:抗體稀釋液為1∶500),37℃保濕盒孵育2小時,注意操作時避光,取出置于洗片盒,再次PBS漂洗,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色劑。用抗熒光淬滅封片劑對其封片,若不及時拍片可4℃避光保存,3天內(nèi)進行熒光拍片。

        1.7.2 鏡檢拍照及數(shù)據(jù)分析 熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(異硫氰酸熒光素綠光激發(fā)波長465~495 nm,發(fā)射波長515~555 nm;藍光發(fā)射波長為435~490 nm),選擇3張切片,選取海馬及黑質(zhì)視野下分別采集圖像,每張圖像隨機選取三個等大正方形區(qū)域,采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析,記錄各組大鼠視野內(nèi)的平均光密度,并對此進行統(tǒng)計分析。拍攝時藍光顯色為DAPI;綠光顯色為GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)指標(biāo);Merge為綠光藍光疊加態(tài)。

        1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 一般情況比較

        造模前各組大鼠的體型大小、毛發(fā)色澤、活動情況均無明顯差異。模型組大鼠在造模第7天開始逐漸出現(xiàn)活動減少、覓食行為減弱、躲避、弓背向上抬高、步履蹣跚等現(xiàn)象。復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)組的大鼠主動活動均較模型組大鼠有所增加,毛發(fā)的色澤較亮麗,行動有所改善,復(fù)方蓯蓉精水提液的低、中、高劑量各組之間,大鼠一般情況無明顯差異。正常組的大鼠毛色亮,飲食、活動均正常。

        2.2 行為學(xué)結(jié)果比較

        復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)后第14天,與正常組比較,模型組懸掛實驗評分減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);給藥第14天后,與模型組比較,復(fù)方蓯蓉精水提液的中劑量和高劑量組懸掛實驗行為學(xué)評分增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

        表1 復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)前后各組大鼠懸掛評分比較

        2.3 免疫熒光法檢測GSK-3β表達情況

        結(jié)果顯示,在大鼠黑質(zhì)部,正常組與模型組大鼠之間GSK-3β平均光密度存在差異,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組大鼠相比,模型組及治療組大鼠的GSK-3β平均光密度較高(P<0.05)。與模型組大鼠相比,復(fù)方蓯蓉精水提液的中、高劑量大鼠平均光密度較低(P<0.05);低劑量組大鼠平均光密度和模型組平均光密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果提示,經(jīng)魚藤酮造模后,大鼠黑質(zhì)部位GSK-3β表達顯著增多;經(jīng)復(fù)方蓯蓉精水提液治療14天后,GSK-3β表達較模型組降低,表明復(fù)方蓯蓉精水提液在黑質(zhì)部位具有一定的抑制GSK-3β表達的作用。見表2、圖1。

        表2 復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)前后各組大鼠大腦黑質(zhì)GSK-3β平均光密度的比較

        圖1 各組大鼠大腦黑質(zhì)GSK-3β表達情況(×400)

        3 討論

        PD是一種進行性神經(jīng)退行性病變,有證據(jù)表明,GSK-3β活性表達,可引起tau蛋白磷酸化,a-synuclein聚集[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)后,大鼠中腦黑質(zhì)GSK-3β的表達減少,這也進一步驗證了相關(guān)實驗得出的結(jié)果:通過抑制GSK-3β的活性,進而抑制tau蛋白的過磷酸化,從而抑制黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡[10]。也說明了復(fù)方蓯蓉精水提液可以抑制GSK-3β的活性,繼而對神經(jīng)細(xì)胞起到了保護的作用。

        對于PD模型大鼠肢體運動協(xié)調(diào)情況的觀察,一般用懸掛實驗來作為行為學(xué)檢測方法[11],本實驗通過對造模組大鼠的活動能力與行為等方面進行觀察,結(jié)果表明,模型組出現(xiàn)活動減少、覓食、躲避行為減弱等情況,這與臨床帕金森患者活動障礙的癥狀相似,并且模型組的懸掛實驗評分較正常組明顯減少。同時,復(fù)方蓯蓉精水提液中劑量和高劑量組的懸掛實驗評分較模型組增加。這與課題組的前期的實驗結(jié)果相吻合,即將PD患者分組,其中對照組予卡左雙多巴控釋片治療,治療組在予卡左雙多巴控釋片治療的基礎(chǔ)上,再加上蓯蓉精(肉蓯蓉、淫羊藿、黃精組成),結(jié)果顯示蓯蓉精聯(lián)合卡左雙多巴控釋片的治療方案對于早期的PD人可明顯改善中醫(yī)證候評分[12]。這說明,復(fù)方蓯蓉精水提液對于PD模型大鼠的行為障礙能起到改善、治療的作用。

        中醫(yī)認(rèn)為,PD位在肝腎,病機在于髓??仗摚K腑之氣漸衰。因肝腎虧虛,故而筋脈失榮,癥見肢體震顫。本病屬虛實夾雜,本虛標(biāo)實,既往研究提出“肝—腎—腦軸”功能失調(diào)假說[13],認(rèn)為腎虛為其本,肝風(fēng)為其標(biāo),滋補腎精法是其基本治法,所謂乙葵同源,補腎填精,精足可化血,滋水以涵木,肝風(fēng)自息,而帕金森所表現(xiàn)的標(biāo)實,即震顫以及運動障礙等癥狀也得以改善。所以,在此理論指導(dǎo)下,復(fù)方蓯蓉精以此組方——肉蓯蓉為君,有溫補腎陽、補益精血之效;淫羊藿為臣,奏補腎溫陽、強筋壯骨之用;黃精為使,起補腎滋陰、填精益髓之效,三藥共奏補腎填精,健腦益髓之功效,該方已申請并獲得國家授權(quán)專利(專利號:201110302854.1)。因此,也有學(xué)者如滕龍等[14]人通過復(fù)方地黃方干預(yù)注射MPTP制成的PD大鼠模型的實驗,其結(jié)果表明GSK-3β蛋白的激活如果被緩解,β-catenin 磷酸化作用會減弱,可以減少a-synuclein異常聚集及錯誤折疊,影響細(xì)胞凋亡,從而緩解PD異動證。這與課題前期的研究發(fā)現(xiàn)相符,也發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉、淫羊藿等補腎中藥可改善PD模型動物腦內(nèi)DA的含量,減少Bax的表達,增加bcl-2的表達,降低caspase-3的活性,保護DA能神經(jīng)元的損傷[8],也就為中西醫(yī)結(jié)合臨床防治PD提供依據(jù)。

        綜上,復(fù)方蓯蓉精水提液能夠提高PD模型大鼠中腦黑質(zhì)DA的含量,改善其行為學(xué)障礙,其機制可能是通過抑制GSK-3β的激活,來降低tau蛋白的磷酸化,減少a-synuclein及Bax的表達,增加Bcl-2的表達來減輕DA能神經(jīng)元的損傷,從而對DA能神經(jīng)元起到保護作用。

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