肖紹堅 王志汕 陳詩雅 林友寧 鐘佳男

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)其特征性的病理變化是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的變性死亡和路易小體(其主要成分是錯誤折疊的a-synuclein)的出現(xiàn)[1]。而a-synuclein是糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)的下游蛋白，二者與PD的發(fā)病密切相關(guān)。GSK-3β作為一種多功能的絲氨酸/酪氨酸，其活化與神經(jīng)元凋亡的增加直接相關(guān)[2-3]。近年的研究表明[4-5]，GSK-3β活性增加會導(dǎo)致DA含量顯著的減少、凋亡，而抑制GSK-3β的活性，能阻斷DA的的減少、變性、凋亡，改善和治療PD模型大鼠的癥狀。

PD屬于中醫(yī)“顫證”范疇?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈吩疲骸澳凶悠甙?，肝氣衰，筋不能動，天癸竭，精少，腎藏衰，形體皆極?！惫逝两鹕〉牟∥浑m在筋骨，但是病性是本虛標(biāo)實。肝腎陰虛、腦髓不足是PD最根本病機。所以，臨床治療PD應(yīng)以補肝腎，益腦髓為基礎(chǔ)。臨床試驗均表明以補腎中藥為主的方藥對PD的治療有一定作用。肉蓯蓉中主要有效成分松果菊苷可以影響大鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白的表達，對PD有一定的治療作用[6]。淫羊藿提取物淫羊藿苷可能通過PI3K/Akt信號通路來抑制GSK-3β的活性，減少tau蛋白過度磷酸化，從而保護細(xì)胞調(diào)亡[7]。同時，肉蓯蓉、淫羊藿都有抑制GSK-3β活性，減少α-syn的聚集，從而減輕多巴胺神經(jīng)元的凋亡[8]的作用。本實驗通過觀察復(fù)方蓯蓉精水提液對PD大鼠行為學(xué)和中腦GSK-3β表達的影響，繼而探討復(fù)方蓯蓉精水提液治療PD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗取50只SD健康雄性大鼠，每只大鼠的體重為(180±20)g，年齡為6周齡，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)條件：福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中SPF級動物飼養(yǎng)室，室溫(20～22)℃，自動光暗控制，光暗各12小時，覓食、飲水自由。

1.2 藥物與試劑

復(fù)方蓯蓉精水提液的藥物組成為：肉蓯蓉30 g、淫羊藿30 g、制黃精54 g。由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房提供，將上述藥物粉碎，取蒸餾水(約為藥材體積10倍)，浸泡1小時，加熱回流2小時，過濾收集水提液。重復(fù)上述操作，合并兩次水提液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，最終得到濃度分別為25、50、100 mg/mL的復(fù)方蓯蓉精水提液。

葵花油乳液(美國Sigma公司)，魚藤酮(批號：R8875)，GSK-3β蛋白(美國Cell Sign-alingTeehnolegy公司)，粉末型磷酸鹽緩沖液(福建福州邁新)，粉末型抗原修復(fù)液(檸檬酸法)，乙醇、二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 實驗儀器

光學(xué)顯微鏡(型號：MDL)，倒置顯微鏡(型號：TS100，日本尼康公司)，石蠟切片機(型號：C6，德國LEICA公司)。

1.4 動物分組及模型制備

將50只大鼠隨機分為2組，其中正常組10只，造模組40只。本試驗使用頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳液來建立大鼠的PD模型。每天按比例給大鼠注射1.5 mg/mL的魚藤酮葵花油乳液0.1 mL/100 g，注射前給大鼠稱重，連續(xù)給藥14天。正常組不予處理。造模過程中由于大鼠的個體差異，共8只大鼠死亡，剩下32只大鼠造模成功。把造模成功的大鼠隨機分為4組，即模型組、復(fù)方蓯蓉精水提液高、中、低劑量組，每組各8只。然后，按PD患者每日復(fù)方蓯蓉精水提液的常用劑量為47 g來計算，以人和大鼠的體表面積比公式進行換算，則大鼠每天用藥的低、中、高劑量分別為40、80、160 mg/kg，其中人的臨床等效劑量為中劑量。故復(fù)方蓯蓉精水提液低、中、高劑量組分別用濃度為25、50、100 mg/mL的復(fù)方蓯蓉精水提液，以10 mL/(kg·d)給大鼠灌胃，連續(xù)14天。正常組及模型組給予10 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃，頻次同復(fù)方蓯蓉精水提液組。

1.5 行為學(xué)檢測

對各組大鼠的精神狀態(tài)、覓食飲水、行為表現(xiàn)、活動狀況等進行觀察，記錄。各組大鼠在實驗干預(yù)第14天灌胃后的6小時，分別進行懸掛實驗[9]：將大鼠的前爪懸掛在水平放置的金屬絲上，金屬絲距離地面約30 cm，記錄大鼠從開始懸掛到落地之間的時間。根據(jù)記錄時間進行評分：持續(xù)0～5秒為0分，6～10秒為1分，11～15秒為2分，16～20秒為3分，21～25秒為4分，26～30秒為5分，超過30秒為6分。每次間隔約2分鐘測一次，共測3次，取其平均值。

1.6 實驗取材

最后一次給藥12小時后，從各組大鼠中隨機抽取6只，并用乙醚麻醉，隨后斷頭處理，在冰盤上提取大鼠中腦黑質(zhì)，用冰0.9%氯化鈉溶液來反復(fù)沖洗腦組織表面的血液，待其干凈后，拿濾紙吸干腦組織表面的殘余液體，包埋腦組織，制備成石蠟切片，置于4℃冰箱保存。

1.7 免疫熒光檢測中腦GSK-3β的表達情況

1.7.1 免疫熒光染色 將石蠟包埋好的大鼠大腦組織連續(xù)冠狀切片，切片的厚度約為5 μm，載玻片附貼組織切片，于4℃冰箱長期保存。將石蠟切片取出，置于60℃恒溫箱1小時，此后依次置于二甲苯和不同濃度的無水乙醇浸泡，最后放入蒸餾水中(通風(fēng)櫥中進行)。之后，將石蠟切片用檸檬酸抗原修復(fù)液和PBS漂洗，再用50 μL山羊封閉血清，向每個腦組織滴加50 μL GSK-3β抗體(抗體原液提前用1%BSA配置并稀釋，抗體與抗體稀釋液比例為1∶1000，于-20℃長期保存)，4℃孵育過夜至少20小時。次日，PBS漂洗后，向每個大腦組織切片滴加50 μL免疫熒光二抗(用1%牛血清白蛋白稀釋，抗體原液：抗體稀釋液為1∶500)，37℃保濕盒孵育2小時，注意操作時避光，取出置于洗片盒，再次PBS漂洗，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色劑。用抗熒光淬滅封片劑對其封片，若不及時拍片可4℃避光保存，3天內(nèi)進行熒光拍片。

1.7.2 鏡檢拍照及數(shù)據(jù)分析 熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(異硫氰酸熒光素綠光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm；藍光發(fā)射波長為435～490 nm)，選擇3張切片，選取海馬及黑質(zhì)視野下分別采集圖像，每張圖像隨機選取三個等大正方形區(qū)域，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，記錄各組大鼠視野內(nèi)的平均光密度，并對此進行統(tǒng)計分析。拍攝時藍光顯色為DAPI；綠光顯色為GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)指標(biāo)；Merge為綠光藍光疊加態(tài)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

造模前各組大鼠的體型大小、毛發(fā)色澤、活動情況均無明顯差異。模型組大鼠在造模第7天開始逐漸出現(xiàn)活動減少、覓食行為減弱、躲避、弓背向上抬高、步履蹣跚等現(xiàn)象。復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)組的大鼠主動活動均較模型組大鼠有所增加，毛發(fā)的色澤較亮麗，行動有所改善，復(fù)方蓯蓉精水提液的低、中、高劑量各組之間，大鼠一般情況無明顯差異。正常組的大鼠毛色亮，飲食、活動均正常。

2.2 行為學(xué)結(jié)果比較

復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)后第14天，與正常組比較，模型組懸掛實驗評分減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；給藥第14天后，與模型組比較，復(fù)方蓯蓉精水提液的中劑量和高劑量組懸掛實驗行為學(xué)評分增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)前后各組大鼠懸掛評分比較

2.3 免疫熒光法檢測GSK-3β表達情況

結(jié)果顯示，在大鼠黑質(zhì)部，正常組與模型組大鼠之間GSK-3β平均光密度存在差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常組大鼠相比，模型組及治療組大鼠的GSK-3β平均光密度較高(P<0.05)。與模型組大鼠相比，復(fù)方蓯蓉精水提液的中、高劑量大鼠平均光密度較低(P<0.05)；低劑量組大鼠平均光密度和模型組平均光密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果提示，經(jīng)魚藤酮造模后，大鼠黑質(zhì)部位GSK-3β表達顯著增多；經(jīng)復(fù)方蓯蓉精水提液治療14天后，GSK-3β表達較模型組降低，表明復(fù)方蓯蓉精水提液在黑質(zhì)部位具有一定的抑制GSK-3β表達的作用。見表2、圖1。

表2 復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)前后各組大鼠大腦黑質(zhì)GSK-3β平均光密度的比較

圖1 各組大鼠大腦黑質(zhì)GSK-3β表達情況(×400)

3 討論

PD是一種進行性神經(jīng)退行性病變，有證據(jù)表明，GSK-3β活性表達，可引起tau蛋白磷酸化，a-synuclein聚集[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)復(fù)方蓯蓉精水提液干預(yù)后，大鼠中腦黑質(zhì)GSK-3β的表達減少，這也進一步驗證了相關(guān)實驗得出的結(jié)果:通過抑制GSK-3β的活性，進而抑制tau蛋白的過磷酸化，從而抑制黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡[10]。也說明了復(fù)方蓯蓉精水提液可以抑制GSK-3β的活性，繼而對神經(jīng)細(xì)胞起到了保護的作用。

對于PD模型大鼠肢體運動協(xié)調(diào)情況的觀察，一般用懸掛實驗來作為行為學(xué)檢測方法[11]，本實驗通過對造模組大鼠的活動能力與行為等方面進行觀察，結(jié)果表明，模型組出現(xiàn)活動減少、覓食、躲避行為減弱等情況，這與臨床帕金森患者活動障礙的癥狀相似，并且模型組的懸掛實驗評分較正常組明顯減少。同時，復(fù)方蓯蓉精水提液中劑量和高劑量組的懸掛實驗評分較模型組增加。這與課題組的前期的實驗結(jié)果相吻合，即將PD患者分組，其中對照組予卡左雙多巴控釋片治療，治療組在予卡左雙多巴控釋片治療的基礎(chǔ)上，再加上蓯蓉精(肉蓯蓉、淫羊藿、黃精組成)，結(jié)果顯示蓯蓉精聯(lián)合卡左雙多巴控釋片的治療方案對于早期的PD人可明顯改善中醫(yī)證候評分[12]。這說明，復(fù)方蓯蓉精水提液對于PD模型大鼠的行為障礙能起到改善、治療的作用。

中醫(yī)認(rèn)為，PD位在肝腎，病機在于髓?？仗摚K腑之氣漸衰。因肝腎虧虛，故而筋脈失榮，癥見肢體震顫。本病屬虛實夾雜，本虛標(biāo)實，既往研究提出“肝—腎—腦軸”功能失調(diào)假說[13]，認(rèn)為腎虛為其本，肝風(fēng)為其標(biāo)，滋補腎精法是其基本治法，所謂乙葵同源，補腎填精，精足可化血，滋水以涵木，肝風(fēng)自息，而帕金森所表現(xiàn)的標(biāo)實，即震顫以及運動障礙等癥狀也得以改善。所以，在此理論指導(dǎo)下，復(fù)方蓯蓉精以此組方——肉蓯蓉為君，有溫補腎陽、補益精血之效；淫羊藿為臣，奏補腎溫陽、強筋壯骨之用；黃精為使，起補腎滋陰、填精益髓之效，三藥共奏補腎填精，健腦益髓之功效，該方已申請并獲得國家授權(quán)專利(專利號：201110302854.1)。因此，也有學(xué)者如滕龍等[14]人通過復(fù)方地黃方干預(yù)注射MPTP制成的PD大鼠模型的實驗，其結(jié)果表明GSK-3β蛋白的激活如果被緩解，β-catenin 磷酸化作用會減弱，可以減少a-synuclein異常聚集及錯誤折疊，影響細(xì)胞凋亡，從而緩解PD異動證。這與課題前期的研究發(fā)現(xiàn)相符，也發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉、淫羊藿等補腎中藥可改善PD模型動物腦內(nèi)DA的含量，減少Bax的表達，增加bcl-2的表達，降低caspase-3的活性，保護DA能神經(jīng)元的損傷[8]，也就為中西醫(yī)結(jié)合臨床防治PD提供依據(jù)。

綜上，復(fù)方蓯蓉精水提液能夠提高PD模型大鼠中腦黑質(zhì)DA的含量，改善其行為學(xué)障礙，其機制可能是通過抑制GSK-3β的激活，來降低tau蛋白的磷酸化，減少a-synuclein及Bax的表達，增加Bcl-2的表達來減輕DA能神經(jīng)元的損傷，從而對DA能神經(jīng)元起到保護作用。