林旭東，鞠少卿

(1.南通大學(xué)，江蘇 南通 2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 南通 )

與傳統(tǒng)的線性RNA分子不同，環(huán)狀RNA circRNA(Circular RNAs,circRNA)是一類以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，不同于其他ncRNA，其缺少5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，并且其表達(dá)更穩(wěn)定，不易被Rnase降解。1976年研究者首次在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)circRNA[1]，并發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于真核細(xì)胞生物中。近年來尤其是2012年之后隨著高通量核酸測序技術(shù)的廣泛運(yùn)用，許多原來未知的circRNA分子序列漸漸浮出水面。近些年來，對circRNA的研究呈現(xiàn)出了井噴的模式。雖然人們對于其功能并未得到真正的了解，但多項(xiàng)研究表明了circRNA在人類疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1 circRNA的特征

circRNA廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并由已知的蛋白質(zhì)基因編碼表達(dá)，circRNA主要分為三類，分別是外顯子circRNA、內(nèi)含子circRNA、以及外顯子-內(nèi)含子circRNA，其主要由多個(gè)或單個(gè)外顯子組成[2]，You[3]等發(fā)現(xiàn)了circRNA尤其在哺乳動(dòng)物大腦中含量較為豐富，其缺乏多聚腺苷酸[poly(A)]尾巴和帽子(capping)結(jié)構(gòu)，circRNA定位于細(xì)胞質(zhì)中并廣泛存在，與形成一般外顯子的線性和開放的5'-3'結(jié)構(gòu)的傳統(tǒng)線性剪接不同，circRNAs包含共價(jià)閉合和末端缺失的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。近些年來隨著研究的不斷深入，circRNA在疾病中的作用被逐漸揭開了面紗。

2 circRNA的主要功能

circRNA大量存在于真核細(xì)胞生物體內(nèi)，雖然近些年來有大量報(bào)道，但其研究一般都只停留在表面，還未真正弄清其具體機(jī)制。以下主要從充當(dāng)“miRNA海綿”、與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)結(jié)合、調(diào)節(jié)基因表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)功能、以及編碼蛋白質(zhì)這4個(gè)主要方面進(jìn)行闡述。

2.1circRNAs作為miRNA“海綿”:miRNA“海綿”是circRNA研究最多的一種功能。circRNA通過競爭結(jié)合相關(guān)的miRNA，影響該miRNA對靶mRNA的作用[4]。許多circRNA具有多個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)并同時(shí)調(diào)節(jié)它們，這些進(jìn)化上保守的結(jié)合位點(diǎn)可確保與靶miRNA結(jié)合的效率。Wei[5]的研究中發(fā)現(xiàn)CircCDYL在肝癌患者血漿中高表達(dá)，其機(jī)制是通過海綿化MiR-892a以及MiR873-3p。

2.2circRNA通過調(diào)節(jié)基因發(fā)揮生物學(xué)功能:位于細(xì)胞核的一些circRNA存在U1 snRNA結(jié)合位點(diǎn)，可以形成RNA-蛋白復(fù)合物，并與啟動(dòng)子區(qū)域的RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，順勢調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄。Zhang[6]等研究發(fā)現(xiàn)ci-ankrd52在細(xì)胞核中含量豐富而對microRNA靶位點(diǎn)的富集很少，其可以通過結(jié)合ankrd52基因轉(zhuǎn)錄的Pol Ⅱ直接調(diào)控ankrd52基因的表達(dá)，敲除該基因后可以下調(diào)其親本基因的表達(dá)。

2.3circRNA與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合:circRNA可以和RNA結(jié)合蛋白結(jié)合來參與調(diào)控多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、調(diào)亡和衰老等。Circ_ZKSCAN1通過競爭性結(jié)合FMRP蛋白發(fā)揮其抑制肝細(xì)胞性肝癌組織的增值。Memczak[7]等研究證明了人類circRNA-ciRS-7轉(zhuǎn)錄物能與AGO蛋白(argonaute,AGO)密集結(jié)合，并形成了一大類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。

2.4circRNA參與蛋白質(zhì)的翻譯:由于circRNA缺少5′的帽子結(jié)構(gòu)和3′末端的poly(A)尾巴，所以一直被認(rèn)為是無翻譯功能的。近年，發(fā)現(xiàn)一些circRNA是可以編碼蛋白質(zhì)的，其原因可能是circRNA中富含甲基化修飾的腺嘌呤，而這種甲基化修飾，它可以發(fā)揮像內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列同樣的作用，促使circRNA翻譯合成蛋白質(zhì)[8]。CircPPP1R12A在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著增高，其原因可能是circPPP1R12A[15]攜帶一個(gè)開放閱讀框(ORF)，該ORF編碼一個(gè)功能蛋白circPPP1R12A-73aa。

3 circRNA在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究

近年來有關(guān)circRNA在人類疾病中的研究呈現(xiàn)出爆發(fā)式的增長，近年來研究發(fā)現(xiàn)circRNA分子與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸都有密切的關(guān)系，circRNA在消化系統(tǒng)腫瘤中能直接參與調(diào)節(jié)其病理的發(fā)生發(fā)展過程[9]，鑒于其特殊的結(jié)構(gòu)，在血清中的存在更加穩(wěn)定，因此也更有潛力作為疾病的診斷標(biāo)志物。消化系統(tǒng)分為消化道和消化腺，消化道包括口腔、咽、食道、胃、結(jié)直腸、肛門等部，其主要功能是進(jìn)行食物機(jī)械性的消化，是食物暫時(shí)儲(chǔ)存的場所，并在其中進(jìn)行消化和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。消化腺主要包括唾液腺、肝臟和胰臟，其參與食物的化學(xué)性消化，其中含有多種消化酶，幫助食物的消化。目前我國居民病死率最高的惡性腫瘤中[10]，消化系統(tǒng)腫瘤占據(jù)著4位，它們分別是肝細(xì)胞癌、胃癌、食管癌和結(jié)直腸癌。

3.1circRNA在消化腺體腫瘤中的研究進(jìn)展

3.1.1circRNA與肝細(xì)胞肝癌(HCC):肝細(xì)胞肝癌是我國十大腫瘤之一，發(fā)病率以及病死率都位居腫瘤疾病的前列。目前雖然隨著臨床技術(shù)的不斷提高，比如手術(shù)切除、移植等方法的改進(jìn)，早期肝癌的治愈率和生存率得到了較大的提高，5年生存率達(dá)到了40%～70%，但由于大部分肝癌發(fā)現(xiàn)都到晚期，導(dǎo)致了這部分患者的預(yù)后較差[11]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了circRNA在HCC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，可以作為潛在的診斷和治療靶點(diǎn)。通過高通量測序以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，越來越多的circRNA在肝細(xì)胞肝癌中的作用機(jī)制被廣泛研究。Zhang[12]等的研究發(fā)現(xiàn)由脂肪細(xì)胞攝取的外泌體circRNA可以促進(jìn)腫瘤的生長，其主要機(jī)制是通過抑制miR-34a并激活USP7/Cyclin A2信號(hào)通路。circRNA cSMARCA5在HCC組織中表達(dá)下調(diào)，并且與侵襲性特征顯著相關(guān)，是肝癌患者肝切除術(shù)后總生存率和無復(fù)發(fā)生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Yao[13]闡明了circ_0001955通過海綿化miR-516a-5p來釋放TRAF6和MAPK11的表達(dá)，促進(jìn)了HCC的腫瘤發(fā)生。Circ_RHOT1通過招募TIP60啟動(dòng)NR2F6的表達(dá)來抑制HCC的發(fā)展和進(jìn)展，提示circ_RHOT1可能成為HCC預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。Zhang[14]等研究又發(fā)現(xiàn)了circ_TRIM33-12在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)下調(diào)且與惡性特征顯著相關(guān)，是影響HCC患者術(shù)后總生存(OS)和無復(fù)發(fā)生存(RFS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近些年來circRNA在肝細(xì)胞肝癌中的研究日益增多，越來越多的circRNA在肝癌中的作用機(jī)制被逐漸闡述，也為尋找高敏感度和特異性的腫瘤標(biāo)志物提供了越來越多的證據(jù)。

3.1.2circRNA與胰腺癌:胰腺癌具有惡性程度高、早期診斷困難、預(yù)后較差等特點(diǎn)，并且其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比例較高，達(dá)到90%[15]。2015年我國胰腺癌發(fā)病率位居第9位，死亡率達(dá)到了第6位[16]。由于胰腺癌的早期癥狀并沒有特異性，導(dǎo)致了很多患者就診時(shí)已到晚期，從而失去了最佳的手術(shù)機(jī)會(huì)。在胰腺癌中最多見的類型是胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)。近年來，很多研究者設(shè)法從circRNA中尋找出較為敏感和特異的標(biāo)志物。在Zhu[17]的研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中hsa_circ_0006215顯著上調(diào)。Li[18]研究circ-IARS表達(dá)與胰腺癌的轉(zhuǎn)移關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了其與肝轉(zhuǎn)移、血管浸潤、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期呈正相關(guān)，與術(shù)后生存時(shí)間負(fù)相關(guān)。Yang[19]等又發(fā)現(xiàn)了circ-LDLRAD3在胰腺癌組織以及病人血清中的表達(dá)比健康對照者更高，同時(shí)與CA19-9聯(lián)合檢測，對于胰腺癌的診斷特異性以及敏感度將顯著提高，而circ-LDLRAD3的敲除也能抑制胰腺癌的轉(zhuǎn)移，其機(jī)制是通過miR-137-3p/PTN軸的調(diào)控。胰腺癌的惡性程度極高，這些circRNA的發(fā)現(xiàn)有助于給胰腺癌的診斷，能提靈敏度和特異性，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步闡明。

3.2circRNA在消化道腫瘤中的研究進(jìn)展。

3.2.1circRNA與食管癌:食管癌(ESCC)在腫瘤發(fā)病率中位居世界第八位，并且是腫瘤性疾病的第六大死因，最常見的病理類型是鱗狀細(xì)胞癌[20]。其五年生存率不足20%，也嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量，為此，人們設(shè)法尋找出具有敏感性和特異性較高的腫瘤標(biāo)志物。hsa_circ_0067934被發(fā)現(xiàn)在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，并且其腫瘤細(xì)胞分化越差，其表達(dá)也就越高。Hu[21]等證明了circGSK3表達(dá)上調(diào)與ESCC患者的晚期臨床和不良預(yù)后呈正相關(guān)。檢測血漿中circGSK3表達(dá)可用于ESCC和早期ESCC診斷，曲線下面積分別為0.782和0.793，具有較高的診斷效能，可能作用一種新型的腫瘤標(biāo)志物。Liu[22]的研究顯示circRNA_100367通過miR-217/Wnt3途徑增強(qiáng)KYSE-150R細(xì)胞的抗輻射能力。在體外，circRNA_100367沉默降低了輻射下KYSE-150R細(xì)胞的生長Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)在ESCC細(xì)胞、血漿和組織中circ-TTC17表達(dá)水平明顯升高，體外實(shí)驗(yàn)表明，circ-TTC17可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖和遷移。食管鱗狀細(xì)胞癌由于其惡性程度較高，病人有進(jìn)行性吞咽困難等癥狀，對病人生活質(zhì)量有較大的影響，而只依靠臨床常規(guī)檢查，較難在早期發(fā)現(xiàn)，因此尋找具有高靈敏度和特異性的標(biāo)志物顯得尤為緊迫，circRNA由于其特殊的結(jié)構(gòu)和廣泛的存在而得到關(guān)注，為尋找新型食管癌標(biāo)志物提供了可能。

3.2.2circRNA與胃癌:胃癌(GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，其腫瘤的發(fā)病率和死亡率分別排名第五位以及第三位[24]。胃癌的發(fā)生是一種多種因素、多細(xì)胞、多階段的過程，諸如不良的飲食習(xí)慣、幽門螺桿菌感染都是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的因素。近年來，研究主要集中在胃癌的診斷和預(yù)后中，一些致癌或抑癌的circRNA在胃癌中被逐步證實(shí)，其主要機(jī)制是通過海綿化microRNA(miRNA)。不同的circRNA在胃癌細(xì)胞和組織中表達(dá)有差異。CIRS-7是研究較為深入的circRNA之一，通過拮抗miR-7介導(dǎo)的PTEN/PI3K/AKT通路起重要作用的致癌circRNA，CIRS-7的高表達(dá)可以減少miR-7誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Wang[25]等研究發(fā)現(xiàn)circLMTK2在GC組織中表達(dá)上調(diào)，circLMTK2的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，其機(jī)制是通過海綿化miR-150-5p，從而間接調(diào)控c-Myc表達(dá)，促進(jìn)GC腫瘤發(fā)生。Huang[26]等同樣發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000745在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，組織分化越差，同樣在胃癌患者的血漿樣本中較健康對照組表達(dá)下調(diào)，表達(dá)水平越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越高，血漿hsa_circ_0000745、癌胚抗原(CEA)聯(lián)合檢測，使AUC達(dá)到0.775，說明其聯(lián)合應(yīng)用具有良好的診斷效能。由于circRNA廣泛的存在、穩(wěn)定性、保守，其作為胃癌的潛在標(biāo)志物成為了可能。

3.3circRNA與結(jié)直腸癌:結(jié)直腸癌(CRC)是最常見的惡性腫瘤之一,它具有容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特性，其發(fā)生是多種因素的綜合，比如年齡、肥胖、不健康的飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)等。因此CRC對于人類的健康構(gòu)成了較大危害?？紤]到傳統(tǒng)的治療手段的缺點(diǎn)，比如化療藥物的毒性以及耐受性，臨床治療的效果依然很難達(dá)到滿意。

circRNA在結(jié)直腸癌中的研究也日益增多，Shang[27]等研究揭示了環(huán)狀PACRGL通過miR-142-3p/miR-50 6-3p-TGF-β1軸促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，以及對N1-N2中性粒細(xì)胞的分化，同時(shí)也揭示了circRNA_PACRGL在大腸癌細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移中的致癌作用。Chen[28]等在最近的研究中也發(fā)現(xiàn)了circRNA_CTNNA1作為miR-149-5p的海綿，在體內(nèi)外均可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)也與結(jié)腸癌的進(jìn)展呈正相關(guān)，過度表達(dá)也提示了circRNA_CTNNA1大腸癌細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)變，表達(dá)增高的結(jié)腸癌患者的腫瘤體積和質(zhì)量顯著增加。低氧是導(dǎo)致很多實(shí)體腫瘤的一個(gè)方面，體外的circ-133來自于缺氧細(xì)胞，并通過作用于miR-133a/gef-H1/RhoA軸而進(jìn)入常氧細(xì)胞并促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Xu[29]等發(fā)現(xiàn)了circRNA_0001178、circRNA_0000826在CRC組織中表達(dá)顯著上調(diào)。并且提示circRNA_0001178和circRNA_0000826可能作為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的潛在診斷生物標(biāo)志物。Yuan[30]等研究發(fā)現(xiàn)circ_0026344表達(dá)水平與結(jié)直腸癌進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。circ_0026344低表達(dá)預(yù)示CRC患者預(yù)后不良，其機(jī)制可能是海綿化miR-21和miR-31，circ_0026344的表達(dá)水平與CRC組織中miR-21和miR-31的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)直腸癌的發(fā)病率近年來有持續(xù)提高和年輕化的趨勢，circRNA的發(fā)現(xiàn)為結(jié)直腸癌尋找具有高靈敏度和特異性的標(biāo)志物提供了可能。

4 小結(jié)與展望

近年來由于消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率比較以往有很大的增高，而由于其普遍具有高復(fù)發(fā)率易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，其預(yù)后不甚理想，早期發(fā)現(xiàn)以及做出診斷就顯得尤為重要。因此需要尋找敏感性和特異性較高的腫瘤標(biāo)志物。circRNA由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被降解，含量較高等多種因素而成為了被研究的熱門，有些文獻(xiàn)也報(bào)道了和傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測能顯著提高對某一種腫瘤疾病的診斷效能。然而其應(yīng)用也要依賴于細(xì)胞組織，還不能單獨(dú)應(yīng)用在血清等容易獲得的臨床樣本中，并且circRNA與腫瘤的具體機(jī)制也需要進(jìn)一步闡明。隨著進(jìn)一步深入的研究，circRNA有望成為特異性和敏感性較高的腫瘤標(biāo)志物。