張煒, 趙福培, 賀維, 吳世磊, 蘇宇, 陳滌非, 鄢武先, 鄧東周, 黃春萍, 陳永林

1. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，森林和濕地生態(tài)恢復(fù)與保育四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610000；

2. 四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610000；

3. 九寨溝縣林業(yè)和草業(yè)局，四川 阿壩 623400

九寨溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于中國(guó)西南部的四川省，處于濕潤(rùn)的四川盆地邊緣向半干旱的青藏高原延伸的過(guò)渡地帶。它是聯(lián)合國(guó)列入的世界自然遺產(chǎn)和人與生物圈保護(hù)區(qū)[1]。九寨溝作為世界生物多樣性熱點(diǎn)之一，具有保護(hù)全球生物多樣性的意義和研究?jī)r(jià)值[2]。2017 年四川省阿壩藏族羌族自治州九寨溝縣發(fā)生7.0 級(jí)地震，這次地震使得林地資源和野生動(dòng)物棲息地遭到了嚴(yán)重?fù)p毀，區(qū)域內(nèi)局部范圍的生態(tài)系統(tǒng)功能衰退，區(qū)域生態(tài)狀況急劇惡化，大熊貓等珍稀野生動(dòng)物生命安全受到極大威脅。地震導(dǎo)致山體滑坡、泥石流等自然災(zāi)害，進(jìn)一步造成森林植被受到巨大破壞[1,3]。因此，加速地震災(zāi)區(qū)的森林生態(tài)修復(fù)，對(duì)保障該區(qū)域生態(tài)安全、構(gòu)筑生態(tài)屏障具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)不可缺少的重要組成部分，在生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)、凋落物分解、土壤肥力的形成與維持、碳氮周轉(zhuǎn)等方面具有不可替代的作用[4,5]。土壤微生物是對(duì)環(huán)境變化最敏感的生物指標(biāo)，是比土壤有機(jī)質(zhì)更可靠的環(huán)境變化指標(biāo)[6]。微生物在森林土壤環(huán)境中占有十分重要的位置，量化土壤微生物對(duì)于掌握地震災(zāi)區(qū)森林土壤微生物現(xiàn)狀具有十分重要的意義。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法對(duì)九寨溝典型受災(zāi)區(qū)不同受損程度粗枝云杉（Piceaasperata）林土壤微生物豐度進(jìn)行調(diào)查分析，探討地震對(duì)九寨溝粗枝云杉林微生物及其與土壤理化因子之間的相關(guān)性，為震后森林土壤生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)、重建和協(xié)調(diào)提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域九寨溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，位于青藏高原東緣（E103°46′—104°05′，N32°55′—33°16′；1 996?4 764 m a.s.l.）。受熱帶和海洋性季風(fēng)氣候影響，經(jīng)常暴露在亞冰點(diǎn)溫度下，年平均溫度為6 ℃?7 ℃，最高溫度和最低溫度分別為30.7 ℃和?20.2 ℃。年平均降水量約761.8 mm，大部分降水量在5 月至8 月之間。從10 月到次年4 月下旬為雪被期。區(qū)域內(nèi)植被豐富，有冷杉（Abies ernestii）、落葉松（Laris potaninii）、華山松（Pinus armandii）、油松（Pinus tabulaeformis）等，林下植被以高山柳（Salixcupularis）、繡線菊（Spiraea salicifolia）等為主[7]。

2 研究方法

2.1 樣地設(shè)置

研究地段位于九寨溝在地震中受到嚴(yán)重影響的典型粗枝云杉林，土體有翻動(dòng)、崩塌、滑坡等現(xiàn)象。在林內(nèi)分別選擇受損嚴(yán)重、受損中等及受損較輕的3 個(gè)取樣樣地，編號(hào)分別為D1、D2 和D3，同時(shí)選擇沒(méi)有明顯的斷裂、顛覆和滑坡等土地破壞現(xiàn)象，土體及土表植被相對(duì)完整的土壤作為對(duì)照，編號(hào)CK。樣地具體情況見(jiàn)表1。

表 1 樣地信息Tab. 1 Basic information of studied sites

2.2 樣品采集

在4 個(gè)對(duì)比研究點(diǎn)，分別隨機(jī)選取3 個(gè)20 m×20 m的樣地作為重復(fù)采樣點(diǎn)。采用5 點(diǎn)法，在每個(gè)重復(fù)采樣點(diǎn)采集0?30 cm 土樣5 份，并去除枯枝落葉等，然后將5 點(diǎn)土樣混合均勻后裝入袋子。分別于2019 年4 月6 日（春 季）、6 月12 日（夏 季）、9 月25 日（秋季）和12 月2 日（冬季）采集土壤樣品。樣品儲(chǔ)存在冷凍箱中，并在24 小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)樣本分成兩份，一份使用真空冷凍干燥機(jī)在?80 °C 下冷凍干燥（Wizard2.0，VirTis USA），供土壤DNA 提取和微生物豐度檢測(cè)使用。另一份在65 °C 下烘箱干燥72 小時(shí)，然后分析以確定質(zhì)量（quantity）（表2）。

2.3 微生物豐度檢測(cè)

凍干土壤樣品的基因組DNA 均采用北京天恩澤基因科技有限公司的Soil DNA out 試劑盒并按操作說(shuō)明提取。并采用天根生化科技（北京）有限公司Universal DNA Purification Kit 試劑盒純化所有的樣品DNA，純化步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后的總DNA 10-100 ng 作模板，在Bio-Rad iCycle PCR 儀中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。采用338f：5′-(GC)-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′和518r：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因。采用U1：5′-(GC)-GTGAAATTGTT GAAAGGGAA-3′和U2：5′-GACTCCTTGGTCCGTG TT-3′擴(kuò)增真菌18S rRNA 基因[8,9]。選擇凝膠上的條帶進(jìn)行切膠回收和擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，連接到pMD19-T 載體（TaKaRa）相連，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將獲得陽(yáng)性克隆。選擇陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒供qPCR 反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用，質(zhì)粒濃度采用ScanDrop100 超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Analytik Jena，德國(guó)）測(cè)定，然后分別進(jìn)行10 倍梯度系列稀釋以作為定量PCR 擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)品在Mini-Opticon Real-Time system (Bio-Rad, USA)上進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以每克樣品(干重)的基因拷貝數(shù)為單位進(jìn)行分析。PCR 反應(yīng)效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為：細(xì)菌107.5%和r2=0.998，真菌98.3%和r2=0.997。

表 2 不同采樣點(diǎn)理化特征Tab. 2 Physical and chemical characteristics of different sampling sites

2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增得到的不同微生物基因拷貝數(shù)經(jīng)過(guò)Ln 對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用最小顯著差異法（LSD）。微生物基因豐度與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系采用Pearson 法分析。數(shù)據(jù)整理、計(jì)算與作圖均采用Microsoft Excel 2013軟件。

3 研究結(jié)果

3.1 不同損毀地微生物的季節(jié)性變化特征

受地震災(zāi)害影響各林地土壤細(xì)菌16S rDNA 和真菌18S rDNA 基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖1，受災(zāi)地森林土壤細(xì)菌16S rDNA 基因拷貝數(shù)范圍為4.39×108?9.58×108copies/g 干土。在相同的采樣季節(jié)，不同損毀地土壤細(xì)菌16S rDNA 豐度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。春季和夏季，CK 土壤細(xì)菌16S rDNA 豐度最高，D3 次之；而秋季和冬季，D3 細(xì)菌16S rDNA 基因豐度最高，CK 次之。各損毀林地土壤細(xì)菌16S rDNA豐度隨時(shí)間變化波動(dòng)較大，表現(xiàn)相似的季節(jié)性變化特征。全年各林地細(xì)菌16S rDAN 基因豐度春季最低，從春季到夏季顯著增長(zhǎng)（P＜0.05），達(dá)到全年最高值，從夏季到冬季又顯著降低（P＜0.05）。

在相同采樣季節(jié)，各損毀地土壤真菌18S rDNA豐度也無(wú)顯著的差異性（P＞0.05），基因拷貝數(shù)范圍為1.58×106?2.09×106copies/g 干土(見(jiàn)圖1b)。各損毀地土壤真菌18S rDNA 豐度季節(jié)性變化相似，但與細(xì)菌16S rDAN 基因不同，且波動(dòng)不大。全年各采樣點(diǎn)真菌18S rDNA 豐度從春季到夏季略有降低，但不顯著（P＞0.05），從夏季到秋冬季又逐漸增加，也不顯著（P＞0.05）。

3.2 微生物豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)各損毀林地土壤中的微生物豐度與相應(yīng)的環(huán)境因子進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3，由表3 可知，CK 土壤細(xì)菌16S rDNA基因豐度與土壤pH 值（R=?0.617）呈顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），與土壤總孔隙度（R=0.884）和總氮（R=0.713）分別呈極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）。D1 土壤細(xì)菌16S rDNA 基因豐度與土壤pH 值（R=?0.796）呈極顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.01），與土壤容重（R=?0.610）呈顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），并與土壤總孔隙度（R=0.733）和總氮（R=0.585）分別呈極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）和顯著的正相關(guān)性（P＜0.05）。D2 土壤細(xì)菌16S rDNA 基因豐度與土壤總孔隙度（R=0.612）和總氮（R=0.838）分別呈顯著的正相關(guān)性（P＜0.05）和極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）；D3 土壤細(xì)菌16S rDNA 基因豐度則與土壤總孔隙度（R=0.746）和總氮（R=0.779）分別呈極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）。D1 土壤真菌18S rDNA基因豐度與土壤有機(jī)碳（R=0.705）呈顯著的正相關(guān)性（P＜0.05），而D2、D3 和CK 的土壤真菌18S rDNA基因豐度與所檢測(cè)的環(huán)境因子之間相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。

圖 1 地震損毀林土壤在2019 年4 月（春季）、2019 年6 月（夏季）、2019 年9 月（秋季）、2019 年12 月（冬季）細(xì)菌（1）和真菌（2）rDNA 基因的豐度Fig. 1 The abundance of bacterial (1) and fungal (2) rDNA genes in forest soils damaged by earthquake in April (spring), June (summer),September (autumn), and December (winter) of 2019

4 討論

4.1 微生物豐度的季節(jié)性變化

微生物rDNA 基因的季節(jié)性變化結(jié)果表明，九寨溝粗枝云杉人林受地震不同損毀地土壤細(xì)菌和真菌rDNA 基因豐度均具有明顯的動(dòng)態(tài)特征（見(jiàn)圖3）。與地震前其他高海拔生態(tài)環(huán)境中的研究結(jié)構(gòu)相同，季節(jié)性變化對(duì)微生物的影響具有明顯的階段性特征，亞高山/高山森林的微生物群落從冬季到夏季可能會(huì)增加[10-12]，本研究中各損毀林地土壤細(xì)菌從春季到夏季表現(xiàn)為顯著增長(zhǎng)，到秋冬季節(jié)又顯著降低，且冬季高于春季。而與此相反，真菌則是從春季到夏季表現(xiàn)為降低趨勢(shì)，夏季到秋冬季節(jié)又緩慢增長(zhǎng)。這些結(jié)果都反映了高寒森林季節(jié)性變換對(duì)微生物產(chǎn)生的不同影響，而且由于人工林不同的發(fā)育階段所代表的區(qū)域性環(huán)境因子對(duì)微生物也產(chǎn)生了不同的影響。春季充沛的降雨和土壤凍融帶來(lái)的融雪可能引起細(xì)胞內(nèi)外水勢(shì)的嚴(yán)重失衡[13]，從而導(dǎo)致微生物，尤其是細(xì)菌的死亡。由于對(duì)低溫具有較強(qiáng)的耐受性，以及菌絲體和孢子的形成，大多數(shù)真菌能適應(yīng)土壤凍融過(guò)程中快速變化的極端條件，因此真菌豐度隨季節(jié)性的變化幅度沒(méi)有細(xì)菌劇烈。另外，由于高山森林凋落物的年峰值一般出現(xiàn)在深秋和初冬，新鮮凋落物相對(duì)容易分解[14]，豐富的凋落物增加了大量微生物胞外酶的產(chǎn)生[15,16]。當(dāng)冬季積雪覆蓋時(shí)，相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境也有助于維持微生物活性，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解，平衡土壤水分，因此秋冬季節(jié)微生物豐度維持在比春季更高的水平。

表 3 各位點(diǎn)微生物基因豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)性分析Tab. 3 Pearson’s correlation analyses between soil microbial gene abundance and environmental variables at each sampling site

4.2 不同地震損毀程度林地微生物豐度差異

由于地震對(duì)土壤和森林植被的破壞造成了土壤養(yǎng)分的明顯下降，土壤黏粒的迅速流失，使土壤微生物失去了繁育生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生存載體[17]。土壤微生物對(duì)外界環(huán)境的變化又十分敏感，這就導(dǎo)致了土壤微生物豐度的下降。由于地震破壞程度的不同，林地土壤中資源的可利用性差異也不相同，不同損毀地微生物下降的趨勢(shì)也就表現(xiàn)相應(yīng)的差異。受損較輕的D3 林地較受損嚴(yán)重的D2 和D3 林地，植被覆蓋和生物量相對(duì)較高，微生物的生存空間更大，食物來(lái)源更廣，微生物的生長(zhǎng)繁殖優(yōu)勢(shì)相對(duì)也就更大，因此表現(xiàn)為豐度降低程度相對(duì)較小。

研究發(fā)現(xiàn)土壤理化指標(biāo)和微生物豐度受地震影響明顯下降，而且在不同損毀地表現(xiàn)出一定的影響差異。微生物的生長(zhǎng)活性常常受氮有效性的限制，環(huán)境中氮有效性越高，微生物的活性越強(qiáng)，繁殖也越快[18]。在不同損毀林地細(xì)菌豐度均與土壤總氮呈顯著或極顯著的正相關(guān)性，充分表明了，地震帶來(lái)的土壤氮素的流失可能是引起土壤微生物豐度變化的重要因素。另一個(gè)重要的因素是土壤總孔隙度，它對(duì)各損毀林地的影響都顯著。土壤孔隙結(jié)構(gòu)在土壤中的分布呈現(xiàn)出高度的異質(zhì)性，并且極易受周圍環(huán)境的影響，能及時(shí)反映土壤涵養(yǎng)水源、吸持水分及保障氣體暢通能力。同時(shí)土壤孔隙特征是影響微生物功能、活性和異質(zhì)性的主要因素[19]。地震對(duì)土壤總孔隙度造成不同程度的嚴(yán)重影響[20]，使土壤總孔隙度顯著降低，隨之表現(xiàn)為土壤微生物相應(yīng)的顯著降低。

綜上所述，受地震災(zāi)害影響九寨溝粗枝云杉林土壤細(xì)菌16S rDNA 和真菌18S rDNA 基因豐度均有不同程度的降低；與相似生境研究結(jié)果一致，微生物豐度的變化具有明顯的季節(jié)性特征，但細(xì)菌和真菌豐度的變化趨勢(shì)不同。各林地土壤微生物豐度受到環(huán)境因子的影響，其中土壤pH 值、土壤總孔隙度、土壤總氮、土壤容重對(duì)土壤微生物產(chǎn)生的影響更深刻。