張麗勍 管麗琴 蔣飛 方獻(xiàn)平 李水根 張學(xué)英

摘要 ：為明確上海地區(qū)‘紅美人’柑橘的病毒種類，2020年4月在崇明、金山、奉賢、嘉定、閔行和浦東采集疑似病毒感染的葉片樣品11份，采用小RNA深度測(cè)序技術(shù)結(jié)合RT-PCR對(duì)不同來源的混合樣品進(jìn)行病毒種類鑒定。結(jié)果表明，樣品中含有柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus（CTV）、柑橘黃化脈明病毒Citrus yellow vein clearing virus（CYVCV）、柑橘樹皮裂紋類病毒Citrus bark cracking viroid（CBCVd）和柑橘類病毒Ⅴ Citrus viroid V（CVd-Ⅴ）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，上海地區(qū)‘紅美人’柑橘病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍。基于CTV和CYVCV的CP全長(zhǎng)基因及CBCVd和CVd-Ⅴ全基因組序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明：除了CYVCV的分離物與地理來源具有明顯的相關(guān)性外，其余病毒及類病毒均沒有嚴(yán)格的地域相關(guān)性。研究結(jié)果為開展‘紅美人’柑橘種苗病毒檢測(cè)及病毒病的防治奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ：柑橘; 小RNA深度測(cè)序; 病毒鑒定

中圖分類號(hào)：

S 436.66

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020448

Identification of the viruses from Hongmeiren citrus in Shanghai by small RNA sequencing

ZHANG Liqing1，2#， GUAN Liqin3#， JIANG Fei4， FANG Xianping1，2， LI Shuigen1，2， ZHANG Xueying1，2*

（1.Forest & Fruit Research Institute， Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 201403， China;

2.Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology， Shanghai 201403， China;

3.Shanghai Jiading District Agricultural Technology Extension Service Center， Shanghai 201800， China;

4. Shanghai Citrus Research Institute， Shanghai 201913， China）

Abstract

To identify the viruses and viroids from ‘Hongmeiren’ citrus in Shanghai， 11 citrus leaf samples with the virus-like symptoms were collected from the districts of Chongming， Jinshan， Fengxian， Jiading， Minhang and Pudong in April， 2020.The samples were analyzed by small RNA deep sequencing.The results showed that Citrus tristeza virus （CTV）， Citrus yellow vein clearing virus （CYVCV）， Citrus bark cracking viroid （CBCVd） and Citrus viroid V （CVd-Ⅴ） were detected in the samples by small RNA sequencing， which were confirmed by RT-PCR.The mixed infection of viruses/viroids was common in ‘Hongmeiren’ citrus.Phylogenetic analysis was conducted based on the full-length CP gene sequences of CTV and CYVCV， and the full-length genome sequences of CBCVd and CVd-Ⅴ， respectively.The results revealed that only CYVCV showed an obvious correlation with geographical origin.The study laid a foundation for the development of viral diagnosis and prevention in ‘Hongmeiren’ citrus seedlings.

Key words

citrus; small RNA sequencing; virus identification

柑橘是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，栽培主要采用無性繁殖的方法，在田間極易感染病毒類病害[1]。柑橘病毒類病害是柑橘病毒病和類似病毒病害（類病毒等）的統(tǒng)稱[2]。目前，我國從柑橘上鑒定出的病毒主要有：柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus（CTV）、柑橘黃化脈明病毒Citrus yellow vein clearing virus （CYVCV）、柑橘碎葉病毒Citrus tatter leaf virus （CTLV）等[3];類病毒有8種：柑橘裂皮類病毒Citrus exocortis viroid （CEVd）、柑橘曲葉類病毒Citrus bent leaf viroid （CBLVd）、啤酒花矮化類病毒Hop stunt viroid （HSVd）、柑橘矮化類病毒Citrus dwarfing viroid （CDVd）、柑橘樹皮裂紋類病毒Citrus bark cracking viroid （CBCVd）（曾用名Citrus viroid Ⅳ，CVd-Ⅳ）、柑橘類病毒Ⅴ Citrus viroid Ⅴ （CVd-Ⅴ）、柑橘類病毒Ⅵ Citrus viroid Ⅵ （CVd-Ⅵ）和柑橘類病毒Ⅶ Citrus viroid Ⅶ，（CVd-Ⅶ）[47]。

‘紅美人’（又名‘愛媛28’），是從日本引進(jìn)的橘橙類雜交品種，由‘南香’（母本）和‘天草’（父本）雜交而成。該品種有甜橙香氣，果面橙紅色，果肉柔軟多汁，深受消費(fèi)者喜愛[8]。近兩年因其品質(zhì)優(yōu)良，在上海柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)展較快。但是在生產(chǎn)上也出現(xiàn)了一些問題，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前‘紅美人’柑橘種苗市場(chǎng)魚龍混雜，種苗疏于管理，極易導(dǎo)致病毒類病害的發(fā)生。小RNA測(cè)序技術(shù)（small RNA sequencing， sRNA-seq）于2009年開始出現(xiàn)，該技術(shù)可獲得病毒的大量 sRNA序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析能高效鑒定病毒種類，易于發(fā)現(xiàn)新病毒或新分離物，且可同時(shí)鑒定多種RNA或DNA病毒，已被廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)[9]。本研究采用小RNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合RT-PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，初步明確了侵染上海地區(qū)‘紅美人’柑橘的主要病毒種類及其復(fù)合侵染的情況，研究結(jié)果可為后續(xù)開展‘紅美人’柑橘種苗病毒檢測(cè)及病毒病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘紅美人’柑橘病葉于2020年采自上海‘紅美人’柑橘主栽區(qū)崇明、金山、奉賢、嘉定、閔行和浦東6區(qū)共11份樣品，采集信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 小RNA深度測(cè)序與生物信息學(xué)分析

將表1中疑似病毒病癥狀葉片混樣，分為CT1樣品（編號(hào)C1～C4）、CT2樣品（編號(hào)C5～C7）和CT3樣品（編號(hào)C8～C11）（表 1）。利用TRIzol Reagent（Invitrogen）提取葉片總RNA，采用TruseqTM Small RNA Sample Prep Kit（Illumina）構(gòu)建3個(gè)cDNA文庫。Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序。建庫和測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

生物信息學(xué)分析：采用Fastx-Toolkit軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，獲得clean reads用于序列拼接組裝，通過從頭組裝生成重疊群（contig）和單一序列（singleton），將拼接結(jié)果與病毒數(shù)據(jù)庫（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/）進(jìn)行BLASTn比對(duì)，將得到的病毒序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并注釋。

1.2.2 柑橘病毒的RT-PCR檢測(cè)

根據(jù)小RNA測(cè)序分析得到的結(jié)果，選取豐度較高的10種病毒及類病毒（表2），采用One Step RT-PCR Kit（TaKaRa）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，引物序列及反應(yīng)條件見表2。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收并克隆至pMD19-T載體上，選取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 CTV和CYVCV病毒CP基因克隆及系統(tǒng)發(fā)育分析

設(shè)計(jì)并合成引物CTV-CP-F/CTV-CP-R和CYVCV-CP-F/CYVCV-CP-R，分別擴(kuò)增CTV和CYVCV的CP基因開放閱讀框（open reading frame，ORF），引物序列及反應(yīng)條件見表2。RT-PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物克隆測(cè)序參照1.2.2。利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）分別對(duì)CTV和CYVCV的分離物（表3）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.2.4 CBCVd和CVd-Ⅴ系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰接法對(duì)1.2.2中RT-PCR得到的CBCVd和CVd-Ⅴ全長(zhǎng)序列分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，方法參照1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 小RNA測(cè)序結(jié)果

3個(gè)混合樣本CT1（編號(hào)C1～C4）、CT2（編號(hào)C5～C7）和CT3（編號(hào)C8～C11）分別獲得22 727 867、25 438 222個(gè)和22 963 772個(gè)原始序列（raw reads），對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)控，包括去除reads中的接頭序列及由于接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads等，3個(gè)混合樣本分別獲得clean reads 19 260 326、22 346 222個(gè)和20 566 427個(gè)，其長(zhǎng)度分布見圖1。其中，3個(gè)混合樣本中長(zhǎng)度為21 nt小RNA的clean reads所占比例最高，分別為26.00%、32.07%和31.20%。

提取長(zhǎng)度為18～32 nt的序列進(jìn)行拼接組裝，拼接結(jié)果分別與植物病毒數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，將得到的病毒序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并注釋，結(jié)果如下：混合樣本CT1得到5 642個(gè)contigs，包含349 885 bp，平均每個(gè)contig長(zhǎng)62 bp，最長(zhǎng)的contig為1 234 bp，GC含量為51.66%。其中165個(gè)contigs可以比對(duì)到8種病毒及類病毒（表3）;CT2得到5 691個(gè)contigs，包含360 490 bp，平均每個(gè)contig長(zhǎng)63 bp，最長(zhǎng)的contig為1 207 bp，GC含量為49.03%。其中166個(gè)contigs可以比對(duì)到8種病毒及類病毒（表3）;CT3得到6 726個(gè)contigs，包含441 185 bp，平均每個(gè)contig長(zhǎng)66 bp，最長(zhǎng)的contig為1 249 bp，GC含量為50.92%。219個(gè)contigs 可以比對(duì)到10種病毒及類病毒（表3）。

2.2 RT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證小RNA深度測(cè)序結(jié)果的可靠性，對(duì)C1～C11號(hào)樣品中的10種豐度較高的病毒及類病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增到的特異性條帶進(jìn)行測(cè)序及進(jìn)一步分析。結(jié)果表明：C1～C11號(hào)樣品中共可檢測(cè)出兩種病毒及兩種類病毒：CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ（圖2）。其中樣品C1僅檢測(cè)出CTV;樣品C5同時(shí)檢測(cè)出CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;樣品C8同時(shí)檢測(cè)出CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;樣品C9同時(shí)檢測(cè)出CTV和CBCVd;樣品C10同時(shí)檢測(cè)出CYVCV和CBCVd（圖2）。病毒及類病毒的檢出率分別為27.3%（CTV）、18.2%（CYVCV）、36.4%（CBCVd）、27.3%（CVd-Ⅴ）。

RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)：各樣品中同種病毒或類病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物序列完全一致，樣品中CTV序列與CTV-BaraoB-6（EU579362）外殼蛋白（coat protein，CP）基因序列一致性為99.4%，將侵染上?！t美人’柑橘的CTV命名為CTV-SH01;樣品中CYVCV序列與CYVCV-YN-EL（KX156751）CP基因序列一致性為99.5%，將侵染上?！t美人’柑橘的CYVCV命名為CYVCV-SH01;樣品中CBCVd序列與CBCVd-C7-2（MG457786）基因組序列一致性為98.6%，將侵染上海‘紅美人’柑橘的CBCVd命名為CBCVd-SH01;樣品中CVd-Ⅴ序列與CVd-FE（JQ348927）基因組序列一致性為99.6%，將侵染上?！t美人’柑橘的CVd-Ⅴ命名為CVd-Ⅴ-SH01。其中CBCVd和CVd-Ⅴ均為環(huán)狀類病毒，通過背靠背引物擴(kuò)增獲得基因組全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度分別為284 bp和293 bp，測(cè)序驗(yàn)證后提交至NCBI，GenBank登錄號(hào)分別MT780548和MT780547。以上結(jié)果與小RNA測(cè)序結(jié)果中高豐度contig序列一致?；旌细腥窘Y(jié)果也說明：同一份柑橘樣品能夠同時(shí)被多種病毒及類病毒感染。

2.3 CTV和CYVCV CP基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增和系統(tǒng)進(jìn)化分析

分別擴(kuò)增獲得CTV-SH01和CYVCV-SH01的CP基因序列，長(zhǎng)度分別為652 bp和978 bp（登錄號(hào)：MT780545和MT780546）。為進(jìn)一步明確CTV-SH01和CYVCV-SH01與已經(jīng)報(bào)道的CTV和CYVCV分離物的進(jìn)化關(guān)系，分別以同屬長(zhǎng)線病毒科Closteroviridae的甜菜黃化病毒Beet yellows virus和甲型線狀病毒科Alphaflexiviridae的印度柑橘環(huán)斑病毒Indian citrus ringspot virus為外群構(gòu)建了CTV和CYVCV的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

結(jié)果表明：CTV-SH01分離物與美國T36（U16304）和埃及Qaha（AY340974）CTV分離物聚為一簇，親緣關(guān)系較近?？傮w而言，沒有嚴(yán)格的地域相關(guān)性（圖3a）。CYVCV-SH01分離物與浙江分離物ZJ-4（KY933797）和ZJ-1（KY933794）聚為一小簇，與中國其他各地區(qū)分離物聚為一大簇，這些地區(qū)包括湖南、廣東、重慶、四川，云南，浙江、江西等，其他國家包括印度和土耳其的分離物聚為另一大簇。因此，CYVCV的分離物具有明顯的地域特異性（圖3b）。

2.4 CBCVd和CVd-Ⅴ全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以蘋果銹果類病毒屬Apscaviroid的蘋果銹果類病毒Apple scar skin viroid作為外群，構(gòu)建了CBCVd和CVd-Ⅴ的基因組進(jìn)化樹。

對(duì)CBCVd的進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，上海地區(qū)‘紅美人’柑橘上的分離物（CBCVd-SH01）和古巴分離物Cu39（AJ630360）及日本分離物L(fēng)E（AB054633）聚為一小簇，與其他國家如塞浦路斯、希臘、南非等國家以及中國其他地區(qū)分離物親緣關(guān)系也較近，而與巴基斯坦的兩株分離物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3c）。

對(duì)CVd-Ⅴ的進(jìn)化樹分析結(jié)果表明：上海地區(qū)‘紅美人’柑橘上的分離物CVd-Ⅴ-SH01與巴基斯坦兩株分離物AL（JQ348931）和JK2（JQ348933）聚為一小簇，與中國其他地區(qū)分離物，例如浙江、重慶和湖南的分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與澳大利亞的兩株分離物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3d）?？傮w而言，基于全基因組的進(jìn)化樹分析結(jié)果表明：兩種柑橘類病毒沒有明顯的地域特異性。

3 討論

本研究利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)對(duì)采自上海崇明、金山、奉賢、嘉定、閔行和浦東的‘紅美人’柑橘葉片樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過提取葉片總RNA、構(gòu)建小RNA文庫并進(jìn)行測(cè)序，生物信息學(xué)分析結(jié)合RT-PCR驗(yàn)證，明確了樣品中存在CTV和CYVCV兩種病毒及CVd-Ⅴ和CBCVd 兩種類病毒。

CTV屬長(zhǎng)線病毒屬Closterovirus，其引起的柑橘衰退病已經(jīng)在全世界許多地區(qū)造成數(shù)百萬棵柑橘樹死亡[16]。柑橘屬多數(shù)植物可被CTV侵染。不同柑橘產(chǎn)區(qū)分離的CTV分離物在致病性上有一定差異[17]。我國主要發(fā)生在中部和南部的柑橘屬植物上[18]。不同的CTV株系可引起3種不同類型的癥狀：速衰型、莖陷點(diǎn)型和苗黃型[19]。本研究中主要采集的為葉片樣品，C1、C5和C9樣品中檢測(cè)到CTV，葉片呈現(xiàn)黃化特征，根據(jù)癥狀可初步判定為苗黃型。CYVCV為印度柑橘病毒屬M(fèi)andarivirus成員，我國于2009年首次發(fā)現(xiàn)[12]，其寄主范圍較為廣泛，可危害檸檬、酸橙及一些寬皮柑橘品種[20]。張艷慧等首次在浙江‘紅美人’柑橘上檢測(cè)出CYVCV，并且在這些植株中未檢測(cè)到其他柑橘病毒[21]。CYVCV引起的癥狀主要為葉片卷曲黃化，后期葉片下卷、皺縮、畸形甚至嫩葉脫落，導(dǎo)致樹勢(shì)減弱[22]。本研究通過小RNA深度測(cè)序結(jié)合PCR驗(yàn)證證實(shí)C5，C8和C10樣品中能夠檢測(cè)到CYVCV，且3份樣品均表現(xiàn)明顯的卷曲黃化，葉片皺縮，畸形和樹勢(shì)減弱的癥狀，這與已報(bào)道的CYVCV在易感品種上的癥狀一致，一方面證實(shí)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，另一方面說明“紅美人”柑橘也是CYVCV的易感品種之一。CTV和CYVCV傳播途徑相似，均可通過媒介昆蟲和嫁接進(jìn)行傳播。本研究在上海地區(qū)‘紅美人’柑橘葉片樣品中同時(shí)檢測(cè)出CTV和CYVCV，同時(shí)還檢測(cè)到兩種柑橘類病毒。劉惠芳研究發(fā)現(xiàn)CYVCV的群體進(jìn)化關(guān)系與地理來源具有相關(guān)性，與寄主及品種相關(guān)性不明顯[23]。本研究構(gòu)建的CYVCV系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，CYVCV的分離物具有明顯的地域特異性，CYVCV-SH01分離物與浙江分離物聚為一小簇，與中國其他各地區(qū)分離物聚為一大簇。

CBCVd也稱為柑橘類病毒IV（CVd-IV），屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科Pospiviroidae椰子死亡類病毒屬Cocadviroid[24]。CVd-Ⅴ屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科蘋果銹果類病毒屬[7]。由于柑橘育苗多采用嫁接技術(shù)，在田間長(zhǎng)期無性繁殖過程中往往存在類病毒混合侵染現(xiàn)象[25]，且由于柑橘類病毒復(fù)合侵染可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，往往會(huì)使癥狀加重。將CVd-Ⅴ與CBLVd 或CVd-Ⅲ共同接種至指示植物‘Etrog’香櫞上時(shí)，葉片癥狀更加明顯，且植株出現(xiàn)明顯的矮化現(xiàn)象[26]。柑橘類病毒與病毒也可互作產(chǎn)生協(xié)同作用，Lu等報(bào)道CTV與CDVd共侵染后有利于CDVd復(fù)制[26]。與CYVCV和CTV相比，CBCVd和CVd-Ⅴ等柑橘類病毒侵染許多柑橘屬植物和柑橘近屬植物時(shí)，并不引起明顯癥狀[25]，但復(fù)合侵染時(shí)可能導(dǎo)致癥狀加劇，本研究中能檢測(cè)到CBCVd、CVd-Ⅴ和CYVCV、CTV的復(fù)合侵染，這種復(fù)合侵染是否導(dǎo)致癥狀的加劇還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)，柑橘病毒和類病毒復(fù)合侵染在上?！t美人’柑橘種植區(qū)發(fā)生普遍，樣品C5同時(shí)檢測(cè)出CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;樣品C8同時(shí)檢測(cè)出CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;樣品C9同時(shí)檢測(cè)出CTV和CBCVd;樣品C10同時(shí)檢測(cè)出CYVCV和CBCVd，這些結(jié)果說明柑橘病毒和類病毒混合感染的情況較為普遍，這些病毒與類病毒之間是否具有協(xié)同效應(yīng)等相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。為保障上海地區(qū)‘紅美人’柑橘產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，需加強(qiáng)種苗病毒檢測(cè)，重視種苗質(zhì)量的監(jiān)督和管理，保障種苗來源。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）