徐惠龍，劉江明，范小芳，許文，范世明

福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122

三葉青系為葡萄科植物三葉崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg，主要分布于福建、浙江和廣西等南方省區(qū)[1]，以其塊根入藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰和活血止痛功效[2]，而民間亦有以全草、莖及葉入藥的習(xí)俗[3-4]，含有兒茶素、原花青素B1和山柰酚-3-O-蕓香糖苷等多種黃酮類成分[5-8]，有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等特性[9-10]。三葉青是多年生藤本陰生植物，在完全日照下生長不良或者不能生長，適宜生長在遮光度為50%～90%的蔭蔽環(huán)境中[11]。研究顯示，光照強(qiáng)度影響三葉青蒸騰作用、氣孔導(dǎo)度和光合作用[12]，>50%自然全光照時(shí)，三葉青光合作用和生長受到抑制[13]，約30%自然全光照時(shí)，三葉青塊莖產(chǎn)量及其總黃酮含量達(dá)到最高[14]。提示光照條件是調(diào)控三葉青植株及塊根生長發(fā)育、黃酮類化合物形成與積累的重要因素。

1 材料與方法

1.1 材料

UV1800型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；SPAD-502型葉綠素計(jì)(日本柯尼卡美能達(dá)感應(yīng)公司)。

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110774-201113)；甲醇(德國Merck 公司，色譜純)；水為超純水；氫氧化鈉、亞硝酸鈉和硝酸鋁為分析純。

課題組篩選的優(yōu)良種質(zhì)資源三葉青“閩選1號”扦插種苗，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物實(shí)驗(yàn)室范世明正高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤T.hemsleyanumDiels et Gilg的種苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017年1月上旬，在福建中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)珍園(藥用植物園)大棚內(nèi)開展試驗(yàn)，選取生長一致的三葉青“閩選1號”扦插苗移植于控根容器中(直徑50 cm，高30 cm)，土壤均為沙壤土，用黑色遮陽網(wǎng)遮陰生長適應(yīng)2個(gè)月。

本研究設(shè)置不同光照強(qiáng)度3個(gè)水平，分別為自然光照的5%～10%(A處理)、20%～30%(B處理)、30%～45%(C處理)，約每隔45 d(共8次，用①～⑧表示)進(jìn)行隨機(jī)取樣，分別測定各樣品葉、藤莖及根的質(zhì)量。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1葉綠素含量的測定 采用SPAD-502型葉綠素計(jì)測定葉綠素相對含量。

1.3.2葉、藤莖和根總黃酮含量的測定 以蘆丁為對照品測定供試樣品總黃酮含量[15-17]，精密稱取蘆丁44.80 mg于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容得對照品溶液。分別吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 置25 mL量瓶中，甲醇定容至5 mL，加 15% 亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置6 min，加10% 硝酸鋁溶液1 mL 混勻，靜置6 min，加10% 氫氧化鈉溶液10 mL，混勻，甲醇稀釋至刻度，靜置15 min。以不加蘆丁的樣品作空白，檢測波長500 nm，得回歸方程：Y=0.013X-0.015 2(r=0.999 3)。精密稱取供試品粉末2.00 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取2次，每次30 min，然后進(jìn)行反應(yīng)，500 nm 波長測定樣品黃酮含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007和SPSS 20.0 軟件。

2 結(jié)果

2.1 不同光照強(qiáng)度對三葉青生長發(fā)育的影響

三葉青植株形態(tài)隨著光照強(qiáng)度增加發(fā)生適應(yīng)變化。如圖1所示，不同遮陰處理360 d后，植株外部形態(tài)特征差異較大，A處理植株藤莖較長，葉生長較為茂盛，深綠色，根系較少；B處理藤莖生長一般，葉淺綠色，根系生長旺盛，有較多塊根；C處理藤莖生長緩慢，葉較小、淺黃色，根系生長旺盛，須根長而多，偶見小塊根。

注：A.自然光照5%～10%的三葉青藤莖和葉；B.自然光照20%～30%的三葉青藤莖和葉；C.自然光照30%～45%的三葉青藤莖和葉；D.自然光照5%～10%的三葉青根系；E.自然光照20%～30%的三葉青根系；F.自然光照30%～45%的三葉青根系；箭頭標(biāo)注三葉青塊根。圖1 不同光照強(qiáng)度下三葉青植株形態(tài)

從表1可知，三葉青植株的生物量都呈現(xiàn)上升的趨勢，不同光照強(qiáng)度處理對三葉青生物量的影響較大。在①～⑦時(shí)期，莖葉(地上部)干質(zhì)量：A>B>C，在⑤～⑧時(shí)期，C處理三葉青葉和藤莖生物量都明顯比A和B處理的少(P<0.05)；在⑧時(shí)期C處理的葉生物量都明顯比B處理少(P<0.05)，說明光照強(qiáng)度太高不利于葉子的生長。在①～⑦時(shí)期，根(地下部)干質(zhì)量C>B>A；在④～⑧時(shí)期C處理的根生物量明顯比A處理多(P<0.05)，B處理也比A處理也有明顯增多；而到了⑧時(shí)期，根干質(zhì)量B處理明顯大于A和C處理(P<0.05)，說明適宜的光照強(qiáng)度更有利于根系的生長。

表1 不同光照強(qiáng)度和時(shí)間下三葉青生物量 g

2.2 不同光照強(qiáng)度對三葉青葉綠素含量的影響

從圖2可知，不同光照強(qiáng)度對三葉青葉片葉綠素含量影響存在差異，各生長期葉綠素均表現(xiàn)出A>B>C趨勢。說明隨著光照強(qiáng)度的增加，三葉青葉片的葉綠素含量逐漸下降，這可能導(dǎo)致其光合作用能力下降，是造成其藤莖生物量下降的原因。

注：不同小寫字母表示各處理樣品中葉綠素含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖2 不同光照強(qiáng)度下三葉青葉綠素含量

2.3 不同光照強(qiáng)度對三葉青葉、藤莖及根總黃酮含量的影響

黃酮類成分是三葉青主要次生代謝產(chǎn)物，也是其主要藥效成分。如圖3～5所示，①～⑧時(shí)期，A、B、C處理中三葉青葉總黃酮含量都有不同程度的增加，且均為C>B>A；雖然在①～⑧時(shí)期，三葉青藤莖中的總黃酮含量變化不穩(wěn)定，但不同時(shí)期中均為C>B>A；在①～⑤時(shí)期，A、B、C處理中三葉青根中總黃酮含量呈上升的趨勢；在⑥～⑧時(shí)期，先下降后上升；但在①～⑧時(shí)期，三葉青根總黃酮含量均為C>B>A。說明隨著光照強(qiáng)度的增加，三葉青各部位總黃酮均表現(xiàn)出上升的趨勢。

圖3 不同光照強(qiáng)度下三葉青葉總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖4 不同光照強(qiáng)度下三葉青藤莖總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖5 不同光照強(qiáng)度下三葉青根總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討論

3.1 不同光照強(qiáng)度對三葉青生長發(fā)育的影響

植物通過光合作用合成碳水化合物等主要能量產(chǎn)物，在不同的光強(qiáng)下，植物的葉綠素含量、光合特性發(fā)生相應(yīng)的變化，其生物量及生長發(fā)育會受到不同程度的影響[18]。研究顯示，遮陰處理有利于三七等喜陰藥用植物的生長發(fā)育，與全日照相比，遮陰條件下其生長速度加快、生物量明顯增長、葉面積增大、葉色深綠、葉片的葉綠素含量增加、葉片凈光合速率升高等[19]。適宜的光照條件有利于三葉青植株及塊根生長發(fā)育，如23 μmol·m-2·s-1的光強(qiáng)有利于三葉青腋芽外植體的萌發(fā)[20]。

本研究表明，三葉青植株的總生物量都隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)增長的趨勢，地上部分的A處理生物量明顯優(yōu)于B和C處理，這可能是三葉青喜涼爽氣候的習(xí)性有關(guān)，A處理遮光密度大，比較陰涼，有利于其莖葉的生長，所以A處理的三葉青地上部分生物量較大；地下部分卻是B與C處理的生物量明顯優(yōu)于A處理，這可能是根系的生長與光照強(qiáng)度有關(guān)，C處理光照強(qiáng)度最強(qiáng)，溫度較高，土壤含水量相對較低，植株響應(yīng)光照過強(qiáng)而表現(xiàn)出的適應(yīng)性生長，所以根系生長較旺；而B處理地下塊根明顯優(yōu)于A與C處理，這可能是由于適度的光照條件有利于三葉青地下塊根的形成與膨大。各時(shí)期A處理三葉青的葉片葉綠素含量高于B與C處理，這與圖1中其葉片的顏色特征相吻合，而A處理地上部生物量較高，說明較低的光照強(qiáng)度條件更有利于三葉青進(jìn)行光合作用和莖葉生長；①～⑥時(shí)期葉綠素含量呈現(xiàn)明顯的增長趨勢，⑦時(shí)期明顯降低，在⑧時(shí)期又明顯上升，究其原因，⑥～⑦處于冬季時(shí)期，可能是由于氣溫較低影響葉綠素的形成，植物進(jìn)入休眠狀態(tài)，⑦時(shí)期以后，氣候溫暖、陽光充足，故而后期的葉綠素含量又急劇上升。

3.2 不同光照強(qiáng)度對三葉青總黃酮含量的影響

植物化學(xué)成分的形成和積累受光照強(qiáng)度的調(diào)控，光強(qiáng)不足可限制植物的光合作用，減少碳源產(chǎn)物的合成，致使其生長受阻，而光強(qiáng)過強(qiáng)則會損傷光合器官[21-22]。對藥用植物而言，光照強(qiáng)度影響其黃酮類等次生代謝產(chǎn)物的合成。銀杏幼苗葉和三葉青塊根總黃酮含量隨光照強(qiáng)度變化而改變，在透光度約為30%時(shí)，其總黃酮含量最高，而強(qiáng)光或過度遮陰，總黃酮含量均下降，認(rèn)為適度光照強(qiáng)度有利于黃酮類化合物的的合成與積累[23]。

本研究表明，在不同生長時(shí)期中，三葉青的總黃酮含量均表現(xiàn)為葉>藤莖>根，而葉片作為植物進(jìn)行光合作用的場所，隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，三葉青植株可能為了響應(yīng)這種環(huán)境條件的改變，葉片中的光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為黃酮類化合物，從而適應(yīng)光照強(qiáng)度的升高。對于陰生植物的三葉青而言，其葉片所接受光照強(qiáng)度范圍的篩選是最關(guān)鍵的栽培調(diào)控措施。從⑤～⑧時(shí)期，三葉青葉總黃酮含量隨著光強(qiáng)的增加而上升，B或C處理與A處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B處理和C處理之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明三葉青葉中黃酮類化合物的合成需要較高的光照強(qiáng)度；①～⑧時(shí)期，相對于A或B處理，C處理可以顯著性提高三葉青根總黃酮含量，說明較高的光照強(qiáng)度可以促進(jìn)黃酮化合物合成及轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.3 三葉青適宜光照強(qiáng)度的栽培技術(shù)

藥用植物栽培技術(shù)的確立不僅要考察藥用部位的生物產(chǎn)量，還要考量其藥效化學(xué)成分含量，以實(shí)現(xiàn)藥材生產(chǎn)的產(chǎn)量大、品質(zhì)優(yōu)的目的。從三葉青總黃酮測定結(jié)果可以看出，在生長后期，葉總黃酮含量較高，而藤莖和根總黃酮含量較低，如⑧時(shí)期，葉總黃酮含量為藤莖的5.01～6.67倍，為根的4.43～6.08倍，B和C處理可以顯著提高其總黃酮含量，而B、C處理之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明隨著光照強(qiáng)度的增加可以提高三葉青總黃酮的含量，但存在一個(gè)臨界值；從三葉青藥用部位生物量來看，隨著光照強(qiáng)度的增加，其葉和藤莖生物量下降，根系生物量增加，促進(jìn)塊根的形成與發(fā)育。如圖1所示，B處理中三葉青葉顏色保持綠色，根系生長旺盛，有較多塊根；而C處理葉淺黃色，根系生長旺盛，須根長而多，有少量小塊根。這說明適當(dāng)增加光照強(qiáng)度可以促進(jìn)三葉青根系生長與塊根的形成，但光照強(qiáng)度過強(qiáng)可能損傷葉光合系統(tǒng)而影響植物生長。因此，綜合三葉青活性成分含量和生物量，B處理可以促進(jìn)三葉青黃酮類成分的合成與累積、促進(jìn)塊根的形成與膨大。

適度增加光照強(qiáng)度有利于三葉青塊根的發(fā)育及總黃酮的累積，透光度20%～30%的條件較適合三葉青的栽培。