溫秀萍，彭琴，2，鄒福賢，2，張廣玲，于虹敏，許文，2*，林羽，2，徐偉，2*，余波

1.福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué) 生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122

使君子是使君子科使君子屬植物使君子QuisqualisindicaL.的干燥成熟果實(shí)，性甘溫，歸胃、脾經(jīng)，用于殺蟲(chóng)消積、健脾胃、除虛熱、殺臟蟲(chóng)[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，使君子具有抗菌[2]、抗病毒[3]、殺蟲(chóng)驅(qū)蟲(chóng)[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗高脂血癥[7]、抗糖尿病[8]、抗癌[9]等多種藥理作用。使君子化學(xué)成分研究表明，其主要含有有機(jī)酸類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)及揮發(fā)性化合物等[10-13]，這些成分是其多種藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前關(guān)于使君子質(zhì)量控制的相關(guān)研究報(bào)道較少。《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)2020年版中使君子以胡蘆巴堿為含量測(cè)定的指標(biāo)[1]；朱華等[14]以使君子中使君子酸鉀含量為指標(biāo)，比較廣東、廣西及四川省3個(gè)不同產(chǎn)地使君子的質(zhì)量；陳芝華等[15]采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定了不同產(chǎn)地使君子中葫蘆巴堿的含量；李改仙等[16]測(cè)定了使君子葉和枝中的總黃酮含量；姜舜堯等[17]采用高效離子交換色譜法分析使君子藥材中胡蘆巴堿成分。但是鑒于使君子具有多方面的藥理活性[2-9]，只檢測(cè)單一成分存在一定的片面性，難以反映出藥材的整體質(zhì)量。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，目前尚未見(jiàn)對(duì)使君子多成分測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，建立多成分綜合評(píng)價(jià)的方法對(duì)使君子質(zhì)量控制水平的提升有重要的意義。

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)方法的快速發(fā)展，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥或復(fù)方的分析[18-21]，因質(zhì)譜具有良好的專(zhuān)屬性和靈敏度，有利于中藥材和中藥復(fù)方的多成分質(zhì)量控制，常應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系化學(xué)成分的定量或定性研究。

因此，本研究通過(guò)建立UPLC-MS/MS，同時(shí)測(cè)定使君子中9個(gè)化學(xué)成分(葫蘆巴堿、香草酸、阿魏酸、丁香酸、兒茶素、鞣花酸、蘋(píng)果酸、沒(méi)食子酸和沒(méi)食子酸甲酯)，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)篩選使君子的潛在質(zhì)控標(biāo)志物，為使君子質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 藥材

使君子34批藥材分別于2018年9月—2019年3月于廣西(批號(hào)：GX1～GX8)、四川(批號(hào)：SC1～SC12)、廣東(批號(hào)：GD1～GD4)、福建(批號(hào)：FJ1～FJ10)地區(qū)收集，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高級(jí)實(shí)驗(yàn)師范世明鑒定為使君子科植物使君子QuisqualisindicaL.的干燥果實(shí)，所有樣品存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源標(biāo)本室。

1.2 試劑

對(duì)照品葫蘆巴堿(批號(hào)：MUST-18050501)、阿魏酸(批號(hào)：MUST-19010106)、丁香酸(批號(hào)：MUST-18083107)、沒(méi)食子酸(批號(hào)：MUST-18032401)、沒(méi)食子酸甲酯(批號(hào)：MUST-19012503)、兒茶素(批號(hào)：MUST-18123009)、蘋(píng)果酸(批號(hào)：MUST-19021503)、鞣花酸(批號(hào)：MUST-18112002)、香草酸(批號(hào)：MUST-18051106)均購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%；甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；Milli-Q超純水(美國(guó)Millipore公司)；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色譜儀串聯(lián)Xevo-TQS型三重四級(jí)桿質(zhì)譜(美國(guó)Waters公司)；CPA225D型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500DE型臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS分析條件

2.1.1色譜條件 色譜柱為Welch Xtimate C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～2.0 min，98%A；2.0～4.0 min，98%～60%A；4.0～6.0 min，60%～40%A；6.0～6.5 min，40%～98%A；6.5～8.0 min，98%A)；流速：0.20 mL·min-1；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2質(zhì)譜條件 正、負(fù)切換電噴霧離子源(ESI)，定性離子掃描模式(MS Scan)，質(zhì)量數(shù)范圍為m/z50～1000，子離子掃描模式(Daughter Scan)，定量采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；毛細(xì)管電壓：負(fù)離子模式為-2.5 kV，正離子模式為3.5 kV；脫溶劑流速：氮?dú)?00 L·h-1；脫溶劑溫度：500 ℃；錐孔氣流速：氮?dú)?50 L·h-1；離子源溫度：150 ℃；碰撞氣體：氬氣。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 使君子中9個(gè)成分的質(zhì)譜測(cè)定條件

2.2 溶液的配制

2.2.1對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取胡蘆巴堿、蘋(píng)果酸、沒(méi)食子酸、兒茶素、沒(méi)食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸、阿魏酸對(duì)照品適量，加入色譜甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為1.458、0.638、0.490、0.047、0.072、1.017、0.680、0.512、0.057 mg·mL-1的各單一對(duì)照品母液。精密量取適量單一對(duì)照品母液置于5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，得到9個(gè)對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為204.120、63.800、19.600、9.400、7.200、20.340、13.600、51.200、2.052 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋?zhuān)吹貌煌|(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備 取使君子粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中。精密加入50%甲醇水溶液20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量。超聲處理(功率：250 W，頻率：50 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm濾膜濾過(guò)。取續(xù)濾液按1∶19加入50%甲醇水溶液稀釋?zhuān)瑩u勻，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1專(zhuān)屬性考察 取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得到使君子正、負(fù)離子模式下的總離子流圖，見(jiàn)圖1。在MassLynx 4.1工作站中對(duì)正、負(fù)總離子流進(jìn)行分子離子峰的識(shí)別，根據(jù)母離子、子離子質(zhì)譜信息，結(jié)合使君子已有化學(xué)成分研究[10-13]，共鑒定9個(gè)成分，并經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，其tR、母離子、子離子質(zhì)譜信息與對(duì)照品信息均一致。9個(gè)成分分離良好，空白無(wú)干擾，符合分析要求。

注：A.空白溶液；B.對(duì)照品溶液；C.使君子樣品溶液(批號(hào)：FJ8)；1.胡蘆巴堿；2.蘋(píng)果酸；3.丁香酸；4.兒茶素；5.沒(méi)食子酸甲酯；6.香草酸；7.丁香酸；8.鞣花酸；9.阿魏酸。圖1 空白溶液、對(duì)照品溶液和使君子樣品的MRM離子流色譜圖

2.3.2線(xiàn)性關(guān)系及檢測(cè)下限、定量下限考察 吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用50%甲醇水溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲葡盗匈|(zhì)量濃度梯度的對(duì)照品混合溶液，按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，待測(cè)組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。以信噪比(S/N)為3計(jì)算9個(gè)待測(cè)組分的檢測(cè)下限，以S/N為10計(jì)算9個(gè)待測(cè)組分定量下限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 9個(gè)化合物回歸方程、線(xiàn)性范圍、r、檢測(cè)下限及定量下限

2.3.3精密度試驗(yàn) 取同一份混合對(duì)照品溶液，在2.1項(xiàng)色譜、質(zhì)譜條件下測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD。1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定日內(nèi)精密度RSD為1.2%～2.7%；每天進(jìn)樣3次，連續(xù)測(cè)定3 d，測(cè)定日間精密度RSD為1.3%～3.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、6、10、12、24 h按2.1項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)9個(gè)組分質(zhì)量濃度，計(jì)算RSD為1.3%～3.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次(批號(hào)：FJ8)使君子藥材樣品6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算9個(gè)化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.1%～2.4%，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取2.3.4項(xiàng)下已測(cè)得含量的使君子粉末6份，約0.25 g，分別近似1∶1加入各對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率，9個(gè)成分的平均回收率為95.36%～99.47%，RSD為2.52%～3.44%，表明回收率良好。

2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密稱(chēng)取不同產(chǎn)地的使君子樣品粉末，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，將各組分峰面積代入回歸方程計(jì)算得到樣品中9個(gè)組分的含量結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3 各批次使君子樣品中9個(gè)成分的含量(n=3) mg·g-1

續(xù)表3

2.5 數(shù)據(jù)分析

將34批次使君子樣品中9個(gè)成分的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入到OmicShare Tools熱圖聚類(lèi)分析工具，設(shè)置歸一化法，得到熱圖聚類(lèi)分析圖，見(jiàn)圖2。縱向的聚類(lèi)反映不同批次樣品之間的關(guān)系，熱圖顏色的深淺反映不同批次樣品中相應(yīng)成分的含量。進(jìn)一步運(yùn)用GraphPad 8.01數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)4個(gè)產(chǎn)地使君子樣品含量進(jìn)行箱型圖統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)圖3。采用SPSS 19對(duì)34批次使君子的含量進(jìn)行主成分(基于最大方差法)的特征值貢獻(xiàn)率分析，結(jié)果見(jiàn)表4～5。

注：1.胡蘆巴堿；2.蘋(píng)果酸；3.丁香酸；4.兒茶素；5.沒(méi)食子酸甲酯；6.香草酸；7.丁香酸；8.鞣花酸；9.阿魏酸。圖2 不同產(chǎn)地使君子樣品中9個(gè)成分的熱圖聚類(lèi)分析

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。圖3 不同產(chǎn)地使君子中9個(gè)成分含量箱型圖

表4 34批次使君子樣品的主成分特征值貢獻(xiàn)率

表5 使君子中9個(gè)成分對(duì)主成分的貢獻(xiàn)值

3 討論

3.1 色譜、質(zhì)譜條件的選擇

在色譜柱的選擇上，比較了不同色譜柱：Waters HSS T3 C18(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)、Waters CORTECS C18(100 mm × 2.1 mm，1.6 μm)、Phenomenex kintecx(100 mm× 2.1 mm，1.7 μm)及Welch Xtimate C18(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)，結(jié)果表明，Welch Xtimate C18色譜柱在色譜峰的保留和峰形上優(yōu)于其他色譜柱，并且達(dá)到基線(xiàn)分離的分析時(shí)間縮短，效率提高，因此選擇該色譜柱。流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇中，考察了4種流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液時(shí)，使君子樣品中9個(gè)成分峰形優(yōu)于其他系統(tǒng)，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。質(zhì)譜條件選擇中，本實(shí)驗(yàn)采用MRM正、負(fù)離子切換模式同時(shí)定量9個(gè)待測(cè)成分，優(yōu)選最佳的碰撞能量和錐孔電壓，葫蘆巴堿、香草酸、阿魏酸、丁香酸、鞣花酸在正離子模式下靈敏度高于負(fù)離子模式，而沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、兒茶素及蘋(píng)果酸則是在負(fù)離子模式下靈敏度較高。

3.2 樣品含量測(cè)定結(jié)果分析

使君子藥理研究表明其具有抗菌[2]、抗病毒[3]、殺蟲(chóng)驅(qū)蟲(chóng)[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗高脂血癥[7]、抗糖尿病[8]、抗癌[9]等多種藥理作用。從本次測(cè)定的指標(biāo)來(lái)看，生物堿類(lèi)成分葫蘆巴堿是使君子的主要成分之一，其具有驅(qū)蟲(chóng)作用[12]；使君子中酚酸類(lèi)成分沒(méi)食子酸、鞣花酸、香草酸、蘋(píng)果酸、兒茶素、丁香酸、阿魏酸、沒(méi)食子酸甲酯等成分具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、保肝[22-29]等作用，9個(gè)測(cè)定的成分可能均是使君子發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)34批次不同產(chǎn)地使君子藥材9個(gè)成分含量測(cè)定的結(jié)果表明，葫蘆巴堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到2.541～3.938 mg·g-1，其次是鞣花酸0.167～1.221 mg·g-1，其余成分含量較低，除蘋(píng)果酸外，其他有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于0.5 mg·g-1。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地使君子表現(xiàn)為不同聚類(lèi)方式。熱圖響應(yīng)結(jié)果表明，胡蘆巴堿、蘋(píng)果酸、兒茶素在福建產(chǎn)使君子樣品中的含量高于其他產(chǎn)區(qū)樣品。從9個(gè)成分含量的箱型圖可知，使君子指標(biāo)性成分胡蘆巴堿含量的中位值在福建和廣西地區(qū)樣品中高于四川和廣東地區(qū)樣品；福建產(chǎn)使君子樣品中蘋(píng)果酸、兒茶素含量的中位值高于其他3??；廣東和福建產(chǎn)使君子樣品中沒(méi)食子酸和香草酸含量的中位值高于廣西與四川樣品；廣東產(chǎn)使君子樣品中鞣花酸含量的中位值顯著高于福建、四川和廣西樣品；其他成分含量相對(duì)較低且不同產(chǎn)地之間差異不明顯。主成分的累積貢獻(xiàn)率結(jié)果表明，主成分1和2的貢獻(xiàn)率最高，累積貢獻(xiàn)率>50%，并且主成分1對(duì)應(yīng)的最大貢獻(xiàn)成分為胡蘆巴堿(0.748)和蘋(píng)果酸(0.714)，而主成分2的最大貢獻(xiàn)成分為鞣花酸(0.911)。綜上，通過(guò)UPLC-MS/MS測(cè)定結(jié)合9個(gè)成分的含量，發(fā)現(xiàn)胡蘆巴堿、鞣花酸和蘋(píng)果酸的含量相對(duì)較高，并且對(duì)聚類(lèi)熱圖及主成分的貢獻(xiàn)較大，同時(shí)箱型圖的結(jié)果可知，3個(gè)成分在不同產(chǎn)地間具有明顯的差異性，因此，胡蘆巴堿、鞣花酸和蘋(píng)果酸對(duì)使君子的質(zhì)量評(píng)價(jià)可能具有重要意義。且這3個(gè)成分具有殺蟲(chóng)[4]、抗慢性病[26]、抗菌[29]、抗氧化[30]等作用，建議將其作為使君子的質(zhì)控標(biāo)志物。

本草考證和文獻(xiàn)記載查證表明，使君子藥用品種使用沒(méi)有混亂，與現(xiàn)今《中國(guó)藥典》收載的使君子一致，主產(chǎn)地為廣東、廣西、福建、四川等地，道地產(chǎn)區(qū)為四川眉州、合川和福建邵武[31-32]。本研究測(cè)定了福建、四川、廣西、廣東4個(gè)產(chǎn)區(qū)使君子藥材中9個(gè)成分的含量，不同產(chǎn)區(qū)藥材雖然基原一致，但是成分間含量存有差異，化學(xué)聚類(lèi)存在明顯區(qū)分。本研究建立的UPLC-MS/MS快速、靈敏度高，可以實(shí)現(xiàn)使君子藥材多成分同時(shí)測(cè)定，并且篩選出胡蘆巴堿、鞣花酸和蘋(píng)果酸3個(gè)成分可作為使君子的質(zhì)控標(biāo)志物，為使君子整體質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。