肖艷松，鐘權(quán)，吳文信，李思軍，朱俊子，鐘杰*

湖南煙草靶斑病的病原鑒定及分子檢測(cè)

肖艷松1，鐘權(quán)1，吳文信1，李思軍1，朱俊子2，鐘杰2*

(1.湖南省煙草公司郴州市公司，湖南 郴州 423000；2.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

2019至2020年，在湖南省郴州、永州、湘西和常德煙區(qū)發(fā)生了一種嚴(yán)重的葉部病害，表現(xiàn)為葉部出現(xiàn)圓形或不規(guī)則黃褐色病斑，有不規(guī)則同心紋，病斑周?chē)梢?jiàn)黃綠色暈圈，后期易破裂穿孔。經(jīng)組織分離、形態(tài)學(xué)觀(guān)察、分子鑒定以及柯赫氏法則驗(yàn)證，確定該病害為煙草靶斑病，病原為立枯絲核菌(Kola)。在此基礎(chǔ)上，以煙草靶斑病菌rDNA-ITS序列為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物Rs-1，建立了特異性針對(duì)靶斑病菌的PCR檢測(cè)體系，從煙草病斑處檢測(cè)煙草靶斑病菌。

煙草；煙草靶斑??；立枯絲核菌；湖南

巴西最早發(fā)現(xiàn)煙草靶斑病[1]。此后，該病害在哥斯達(dá)黎加、美國(guó)北卡羅來(lái)納州嚴(yán)重發(fā)生，南非、意大利、保加利亞和津巴布韋等國(guó)家也有煙草靶斑病發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)造成80%以上的損失[2-3]。2005年，吳元華等[4]首次報(bào)道在中國(guó)遼寧省丹東煙區(qū)發(fā)現(xiàn)煙草靶斑病；隨后，陸續(xù)有吉林、黑龍江、廣西煙區(qū)[5]發(fā)生該病害的報(bào)道。2016年，云南省普洱市和臨滄市煙區(qū)靶斑病暴發(fā)流行，造成煙葉絕收[6]。2019至2020年，筆者在對(duì)湖南省煙草病害進(jìn)行調(diào)研時(shí)，發(fā)現(xiàn)郴州、永州、湘西和常德煙區(qū)發(fā)生了疑似靶斑病的病害，遂對(duì)病害葉片進(jìn)行標(biāo)本采集、組織分離、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)以及柯赫氏法則鑒定，并建立了簡(jiǎn)易的檢測(cè)方法?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1　材料來(lái)源

2019至2020年，對(duì)湖南省郴州、永州、常德、湘西煙區(qū)發(fā)生的一種葉部病害進(jìn)行調(diào)查，采集具有典型葉部發(fā)病癥狀的煙草葉片。

1.2　方法

1.2.1病原菌分離純化及鑒定

利用常規(guī)組織分離法[7]對(duì)病葉進(jìn)行病原菌分離。取病健交界處組織小塊，經(jīng)75%乙醇和0.1% HgCl2消毒、無(wú)菌水漂洗后，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA、含鏈霉素50 μg/mL)上，26 ℃黑暗培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

將純化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板，26 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，觀(guān)察菌落形態(tài)、顏色，測(cè)量其生長(zhǎng)速率。根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

根據(jù)柯赫氏法則對(duì)菌株進(jìn)行致病性測(cè)定[8]。選取2個(gè)月大小盆栽煙草(云煙87)進(jìn)行接種。每個(gè)菌株接種3盆。菌株在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，打取菌落邊緣菌餅，接種于煙草葉片，以無(wú)菌絲的瓊脂塊為對(duì)照。將植株放置于保濕裝置中25 °C保濕2 d后，置于正常溫室培養(yǎng)。觀(guān)察記錄發(fā)病情況。葉片發(fā)病后從病斑處再次分離病原菌并進(jìn)行鑒定。

將分離純化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)7 d。刮取菌絲，采用SDS-NaCl方法提取病原菌DNA[9]。以此為模板，對(duì)菌株的rDNA-ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×EsMaster Mix 25 μL，總DNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后，委托上海生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得的序列用BLASTn從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性查找，通過(guò)MEGA 6軟件的ClustalW比對(duì)后，用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用自舉法進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗(yàn)[11]。

1.2.2煙草靶斑病病原菌分子檢測(cè)方法的建立

取0.1 g病原菌菌絲于1.5 mL離心管中，加入100 μL 1×TE溶液，用無(wú)菌槍頭搗碎，12 000離心5 min，吸取上清，即獲得真菌DNA粗提物。

基于rDNA-ITS序列，設(shè)計(jì)煙草靶斑病菌特異性引物Rs-1，上游5-ATCGATGAAGAACGCAGC GA-3和下游5-GGTGTGAAGCTGCAAAGACC-3，對(duì)從病原菌提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行引物特異性檢測(cè)。以煙草赤星病菌的rDNA- ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物Aa-1，上游5-GAACCTCTCGGGGT TACAGC-3，下游GCGAGTCTCCAGCAAAGCTA-3，作為對(duì)照引物，以煙草赤星病菌、炭疽病菌和煙草黑脛病菌為對(duì)照菌株。

在田間采集煙草靶斑病和赤星病發(fā)病的煙草植株。選取帶不同大小病斑的葉片，剪取葉片病斑部分。提取帶病斑葉片DNA，分別用引物Rs-1和Aa-1進(jìn)行PCR檢測(cè)，并以無(wú)癥狀健康煙草葉片為對(duì)照。

2　結(jié)果與分析

2.1　煙葉病害的癥狀

2019年至2020年，在湖南省郴州、永州、常德、湘西煙區(qū)發(fā)現(xiàn)的類(lèi)似煙草靶斑病的葉部病害，從煙草下部葉片開(kāi)始發(fā)病，迅速向上部葉片擴(kuò)展。發(fā)病初期病斑小，水浸狀，后擴(kuò)展成近圓形或不規(guī)則形狀，邊緣黃褐色，中央顏色略淺，有不規(guī)則同心紋，迎著光線(xiàn)，可觀(guān)察到病斑中央有灰白色靶點(diǎn)，病斑周?chē)梢?jiàn)褪黃綠色暈圈。后期病斑易破裂穿孔，且病斑融合引起葉片枯萎壞死(圖1)。

1　煙株苗期葉片病害癥狀；2、3　成株期煙葉病害癥狀。

2.2　分離病原菌的鑒定結(jié)果

對(duì)采集的煙草葉片病樣進(jìn)行組織分離，共獲得28個(gè)菌落形態(tài)一致的菌株。將分離的菌株于PDA培養(yǎng)基上26 ℃恒溫培養(yǎng)，生長(zhǎng)速率為24.80 mm/d。菌絲初為白色，后變?yōu)辄S褐色。菌絲有分隔，分支夾角接近90°，在分割處有縊縮，且分隔處附近有隔膜(圖2)。

利用菌餅活體接種云煙87葉片，4 d后煙草葉片出現(xiàn)明顯的壞死癥狀：病斑初為水浸狀，后逐漸擴(kuò)大，周?chē)悬S色暈圈，病斑易穿孔(圖3)。從接種發(fā)病病斑處再次分離得到的病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子檢測(cè)，鑒定為煙草靶斑病病菌。根據(jù)柯赫氏法則，確定該病害為煙草靶斑病，病原為立枯絲核菌()。

圖3　分離菌株接種煙草后葉片發(fā)病癥狀

對(duì)代表菌株CZBB-Y1的rDNA-ITS基因區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，獲得了長(zhǎng)度約為697 bp的片段。將測(cè)得的序列提交至NCBI的GenBank(登錄號(hào)MW255345)，BLASTn同源性搜索比對(duì)顯示，其與AG-3的ITS序列具有100%的一致性，序列覆蓋率為96%。利用ITS構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果，菌株CZBB-Y1與聚在一簇(圖4)。結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定，確定菌株CZBB-Y1為立枯絲核菌()。

圖4　基于靶斑病菌株CZBB-Y1, R. solani和其他Rhizoctonia屬菌株ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3　煙草靶斑病菌的分子檢測(cè)

煙草靶斑病常與赤星病混合發(fā)生，易混淆。為了對(duì)煙草靶斑病進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，基于rDNA-ITS序列設(shè)計(jì)了煙草靶斑病菌特異性引物Rs-1和Aa-1，并用簡(jiǎn)易法提取了病原真菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證引物的特異性。結(jié)果表明，引物Rs-1能特異地?cái)U(kuò)增煙草靶斑病菌中預(yù)期大小片段，而煙草赤星病菌、炭疽病菌和煙草黑脛病菌無(wú)擴(kuò)增片段。同時(shí)，引物Aa-1可特異地?cái)U(kuò)增出煙草赤星病菌中預(yù)期片段，但煙草靶斑病菌、炭疽病菌和煙草黑脛病菌無(wú)擴(kuò)增片段(圖5)。

M　Marker；泳道1~4　分別代表引物Rs-1對(duì)煙草靶斑病菌、赤星病菌、炭疽病菌、黑脛病菌的PCR擴(kuò)增；泳道5~8　分別代表Aa-1對(duì)煙草靶斑病菌赤星病菌、炭疽病菌、黑脛病菌的PCR擴(kuò)增。

用設(shè)計(jì)的特異性引物分別對(duì)感染煙草靶斑病和赤星病的煙草葉片病斑進(jìn)行檢測(cè)。挑取病斑處壞死組織，利用簡(jiǎn)易法提取DNA，以此為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，利用引物Rs-1可特異性擴(kuò)增出陽(yáng)性煙草靶斑病菌和感染靶斑病病斑中的特異性片段，而對(duì)健康葉片和煙草赤星病病斑無(wú)擴(kuò)增片段(圖6)。引物Aa-1可特異地?cái)U(kuò)增出陽(yáng)性煙草赤星病菌和赤星病病斑的特異性片段，而對(duì)照健康葉片和煙草靶斑病葉片無(wú)擴(kuò)增片段。說(shuō)明引物能滿(mǎn)足快速檢測(cè)并區(qū)分煙草靶斑病和赤星病的診斷要求。

M　Marker；泳道1~6　分別為引物Rs-1對(duì)煙草靶斑病菌、靶斑病大病斑、靶斑病中號(hào)病斑、靶斑病小病斑、赤星病病斑、健康煙草葉片PCR擴(kuò)增；泳道7~12　分別為引物Aa-1對(duì)煙草赤星病菌、赤星病病斑、靶斑病大病斑、靶斑病中號(hào)病斑、靶斑病小病斑、健康煙草葉片PCR擴(kuò)增。

3　結(jié)論與討論

通過(guò)病害癥狀觀(guān)察、組織分離、形態(tài)學(xué)觀(guān)察、ITS基因序列分析和致病力測(cè)定，鑒定了湖南煙區(qū)發(fā)生的煙草靶斑病，確定其病原菌為立枯絲核菌[12-13]。

立枯絲核菌寄主范圍非常廣泛，可引起莖腐病、紋枯病和苗期立枯病等多種植物病害。在煙草上，立枯絲核菌主要引起苗期病害，一般條件下很難產(chǎn)生有性孢子，孢子的生活力也十分脆弱，但煙草靶斑病是絲核菌通過(guò)有性孢子傳播引起的葉部病害。

煙草靶斑病菌株間的融合群具有多樣性，同時(shí)不同地域的菌株也具有其獨(dú)特性。部分研究[6,14-17]顯示，中國(guó)云南和東北部分地區(qū)的煙草靶斑病菌屬于相同的AG-3融合群，而陳媛媛等[5]發(fā)現(xiàn)從廣西分離到的部分煙草靶斑病菌屬于A(yíng)G-2和AG-4融合群，這與20世紀(jì)80年代在美國(guó)卡羅萊納州北部發(fā)現(xiàn)部分AG-4菌株可引起煙草靶斑病的結(jié)果類(lèi)似[2]。MERCADO等[18]首次報(bào)道在阿根廷西北地區(qū)煙草上發(fā)現(xiàn)引起煙草靶斑病的立枯絲核菌AG-2.1融合群。隨后又發(fā)現(xiàn)該區(qū)域煙草上的AG4HG-I和AG4HG-III融合群菌株主要引起煙草立枯病，AG2-1既可引起立枯病，也可引起靶斑病[19]。這些研究結(jié)果說(shuō)明絲核菌不同融合群與其分離的地理環(huán)境、發(fā)病部位和侵染方式等有關(guān)。對(duì)不同煙區(qū)發(fā)生的煙草靶斑病病原進(jìn)行分離鑒定，將為探討菌株的融合群和菌株間的遺傳多樣性分化，為研究病原菌種群遺傳變異及對(duì)該病害發(fā)生流行預(yù)測(cè)提供依據(jù)。

由于煙草靶斑病易與煙草赤星病、野火病、炭疽病等同時(shí)發(fā)生，容易造成混淆，傳統(tǒng)的鑒定方法需要經(jīng)過(guò)病原菌分離、純化、培養(yǎng)等過(guò)程，耗時(shí)長(zhǎng)，在病害流行時(shí)易造成誤診，因而延誤最佳防治時(shí)期。筆者依據(jù)煙草靶斑病菌和赤星病菌序列設(shè)計(jì)特異性引物，提取病原真菌DNA后，可直接快速地從煙草病害的病斑處檢測(cè)并區(qū)分煙草靶斑病和赤星病，為煙草靶斑病的檢測(cè)與診斷提供了工具，但由于煙草靶斑病菌的遺傳背景復(fù)雜，對(duì)于該檢測(cè)方法是否可應(yīng)用于所有地區(qū)的煙草靶斑病檢測(cè)，還需通過(guò)檢測(cè)更多的樣本來(lái)驗(yàn)證。

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Pathogen identification and molecular detection of tobacco target spot in Hunan Province

XIAO Yansong1, ZHONG Quan1, WU Wenxin1, LI Sijun1, ZHU Junzi2, ZHONG Jie2*

(1.Chenzhou Tobacco Company of Hunan Province, Chenzhou, Hunan 423000, China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Changsha, Hunan 410128, China)

From 2019 to 2020, a serious leaf disease was found in Hunan Province including Chenzhou, Yongzhou, Xiangxi and Changde. Symptoms displayed as round or irregular brown spots, with irregular concentric pattern and yellow-green halo and later the infected leaves were easy to rupture and perforate. The pathogen was confirmed to beKola via tissue isolation, morphological observation, molecular identification and Koch’s Postulates. On this basis, a direct PCR method for detection of tobacco target spot was established using the specific primers Rs-1F and Rs-1R designed based on the rDNA-ITS sequence of the pathogen. Using this method, the pathogen fungus could be detected directly from the disease spots on tobacco leaves.

tobacco; tobacco target spot;; Hunan Province

S435.72

A

1007-1032(2020)06-0711-05

肖艷松，鐘權(quán)，吳文信，李思軍，朱俊子，鐘杰．湖南煙草靶斑病的病原鑒定及分子檢測(cè)[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(6)：711-715．

XIAO Y S, ZHONG Q, WU W X, LI S J, ZHU J Z, ZHONG J. Pathogen identification and molecular detection of tobacco target spot in Hunan Province[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(6): 711-715.

http://xb.hunau.edu.cn

2020-06-12

2020-09-01

湖南省郴州市煙草公司項(xiàng)目(CZYC2020JS04)

肖艷松(1981—)，女，湖南邵陽(yáng)人，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事烤煙栽培及植保技術(shù)研究，xiaoyansong106@126.com；*通信作者，鐘杰，博士，副教授，主要從事植物病理學(xué)研究，wzzhtx@sina.com

10.13331/j.cnki.jhau.2020.06.012

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維