徐超華，劉新龍，毛鈞，劉洪博，林秀琴，陸鑫*，蘇火生*

基于SSR分子標記數(shù)據(jù)構(gòu)建割手密核心種質(zhì)庫

徐超華1,2，劉新龍1,2，毛鈞1,2，劉洪博1,2，林秀琴1,2，陸鑫1,2*，蘇火生1,2*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所，云南 開遠 661699；2.云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南 開遠 661699)

以92份割手密初級核心種質(zhì)為研究對象，利用SSR分子標記數(shù)據(jù)，依據(jù)Jaccard、SM和Nei & Li 3種遺傳相似性系數(shù)逐步進行UPGMA聚類、多次抽樣構(gòu)建割手密核心種質(zhì)庫。結(jié)果顯示：92份樣本在15個SSR 位點上呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，共獲得331個多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶比例達100%；利用3種遺傳相似性系數(shù)和隨機取樣共獲得5個核心種質(zhì)庫；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)3個指標在核心種質(zhì)庫代表性檢驗中呈現(xiàn)出較高的檢測效率，其他6個指標檢測效率相對較低；5個核心庫中依據(jù)SM遺傳相似性系數(shù)逐步構(gòu)建的核心種質(zhì)庫質(zhì)量最優(yōu)，該庫由80份樣本組成，Nei’s多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分別為0.984 1和4.259 8，在<0.05概率條件下與原庫(分別為0.985 6和4.358 3)無顯著差異，而且與原庫的農(nóng)藝性狀均值差異百分率為0(<20.00%)，極差符合率為99.16%(>80.00%)。研究認為，依據(jù)SM相似性系數(shù)，通過UPGMA聚類構(gòu)建的80份割手密核心種質(zhì)較好地代表了基礎原始種質(zhì)的分子水平和表型遺傳多樣性，可為后續(xù)割手密種質(zhì)資源的精準鑒定、優(yōu)異抗性基因發(fā)掘和種質(zhì)資源雜交利用提供依據(jù)。

割手密；聚類；多樣性指數(shù)；分子標記；核心種質(zhì)

割手密(L.)即甘蔗細莖野生種，具有分蘗力強、抗性強等特點，分布于N18°15? ~33°20?、E97°~122°，涵蓋中國廣東、廣西、云南、福建、海南和臺灣等17個省份[1]。目前，現(xiàn)代甘蔗品種血緣主要來自熱帶種、割手密、印度種的種間雜交后代，尤其是印度割手密、爪哇割手密和崖城割手密的成功應用推動了世界甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。中國是“甘蔗屬復合群”中大部分資源的起源地和多樣性中心，分布有大量甘蔗野生種質(zhì)資源。自1995年建圃以來，國家甘蔗種質(zhì)資源圃收集、保存了6個屬15個種共3 000余份的甘蔗種質(zhì)資源，位居世界第二。豐富的種質(zhì)資源同時給資源保育工作者帶來了巨大的工作量與挑戰(zhàn)，如何從龐大的種質(zhì)資源中迅速發(fā)掘優(yōu)異資源，將中國的資源優(yōu)勢迅速轉(zhuǎn)化為產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢，對提高甘蔗良種選育效率具有重要意義。

自FRANKEL[4]首次提出核心種質(zhì)的概念以來，國內(nèi)外學者先后構(gòu)建了水稻[5-6]、玉米[7]、小麥[8]、大豆[9]核心種質(zhì)庫，在甘蔗屬及其近緣屬核心庫構(gòu)建上也做了大量的前期研究。劉新龍等[10]以國家甘蔗種質(zhì)資源圃保育的1 202份甘蔗雜交種為材料，依托表型性狀，采用10%總體取樣量、總體聚類分組和對數(shù)比例聚類，構(gòu)建了161份初級核心種質(zhì)。在此基礎上，進一步使用SSR分子標記數(shù)據(jù)，依據(jù)Jaccard、SM和Dice 3種相似性系數(shù)，采用UPGMA逐步聚類法構(gòu)建了107份甘蔗雜交品種核心種質(zhì)。BALAKRISHNAN等[11]以印度坎納諾爾甘蔗育種研究中心保育的713份熱帶種質(zhì)為材料，基于27個質(zhì)量性狀和10個數(shù)量性狀，構(gòu)建了185份熱帶種(L.)核心種質(zhì)庫。在割手密種質(zhì)構(gòu)建方面，TAI等[12]以美國農(nóng)業(yè)部佛州運河點甘蔗研究所保育的342份甘蔗細莖野生種質(zhì)為材料，基于數(shù)量性狀和環(huán)境因子的11種取樣方法，構(gòu)建了包含75份種質(zhì)的甘蔗細莖野生種核心種質(zhì)庫。齊永文等[13]以海南甘蔗育種場保育的540份甘蔗細莖野生種質(zhì)為材料，利用分子標記數(shù)據(jù)和表型性狀，構(gòu)建了包含60份種質(zhì)的甘蔗細莖野生種核心庫。

齊永文等[13]應用分子標記數(shù)據(jù)構(gòu)建了甘蔗細莖野生種核心種質(zhì)庫，但分子標記數(shù)據(jù)主要用于探討不同取樣比例的確定和核心種質(zhì)庫質(zhì)量的檢測，未用于樣本間聚類、等位變異數(shù)量等分析，未充分發(fā)揮分子標記數(shù)據(jù)的優(yōu)勢。近年來，國家甘蔗種質(zhì)資源圃收集并保存了約600份割手密種質(zhì)資源，極大地豐富了國家甘蔗種質(zhì)資源。前期，蘇火生等[14]以國家甘蔗種質(zhì)資源圃保育的596份割手密種質(zhì)為試驗材料，依據(jù)27個表型性狀，采用15%總體取樣量，以莖徑分組，按多樣性比例構(gòu)建了92份初級核心種質(zhì)庫。在此基礎上，課題組進一步使用SSR分子標記數(shù)據(jù)，通過比較2種取樣策略和3種遺傳距離(Nei & Li、Jaccard、SM)相似系數(shù)，進一步縮減92份割手密初級核心庫，結(jié)合農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)評價不同核心種質(zhì)庫的質(zhì)量，以篩選出最優(yōu)核心種質(zhì)庫，旨在為后續(xù)割手密種質(zhì)資源的精準鑒定、優(yōu)異抗性基因的發(fā)掘和種質(zhì)資源的雜交利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

以前期蘇火生等[14]構(gòu)建的92份割手密初級核心種質(zhì)為研究對象。92份割手密無性系均保育在云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所國家甘蔗種質(zhì)資源圃。

1.2　方法

1.2.1葉片基因組總DNA提取與PCR擴增

采用CTAB法[15]進行甘蔗幼葉基因組DNA的提取和純化。依據(jù)前人[16-18]的研究方法，篩選出15對多態(tài)性較高的SSR引物，用于核心種質(zhì)的遺傳多樣性研究。參照劉新龍等[10]的方法設計SSR反應體系和PCR擴增條件。參照劉新龍等[19]的銀染方法快速銀染。

1.2.2分子標記數(shù)據(jù)統(tǒng)計

在相同遷移位置上，利用人工讀帶的方式，統(tǒng)計擴增條帶，無擴增條帶記為“0”，有擴增條帶記為“1”。利用NTSYSpc2.1，計算參試材料3種不同相似系數(shù)(Jaccard、SM和Nei & Li)。采用位點的基因型頻率計算Nei’s遺傳多樣性(He)[20]和Shannon-Weier多樣性指數(shù)()[21]。

式中，p為SSR標記第個基因位點的基因型頻率。

1.2.3取樣策略

根據(jù)相似性系數(shù)，應用NTSYSpc2.1軟件對所有參試材料進行UPGMA系統(tǒng)聚類，參照HU等[22]、WANG等[23]提出的多次聚類最小距離取樣方法構(gòu)建核心種質(zhì)。根據(jù)每次聚類結(jié)果，找出最相似的2個樣本，剔除1份，剩余材料組成1個核心庫，計算每次形成的核心庫(新庫)的Nei’s遺傳多樣性、Shannon-Weiner多樣性指數(shù)，應用檢驗評價新庫與原庫之間的遺傳多樣性是否存在顯著差異。當存在顯著差異時，終止多次聚類取樣，上一個新庫為該相似性系數(shù)條件下取得的最佳核心種質(zhì)庫。為了確保所構(gòu)建的核心種質(zhì)具有最大的適用性，2個樣本的選擇依據(jù)以下4種原則：1)若樣本來源地點特殊且保存數(shù)量很少，可以直接保留；2)若2個樣本都具有抗性且抗性不同，保留抗性更優(yōu)異的樣本；3)若2個樣本都具有抗性且抗性相同，保留具備較多等位基因數(shù)的樣本；4)若2個樣本遺傳背景不清，保留具備較多等位基因數(shù)的樣本。

為了比較3種核心種質(zhì)庫的質(zhì)量，以相同樣本數(shù)量的2個隨機核心庫為對照，應用4個分子標記指標(Nei’s遺傳多樣性、Shannon-Weiner多樣性指數(shù)、總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù))和4個數(shù)量性狀指標(極差符合率、變異系數(shù)符合率、均值差異百分率和方差差異百分率)綜合評價核心庫構(gòu)建質(zhì)量的好壞。其中，4個數(shù)量性狀指標計算公式同文獻[22]。在均值差異百分率小于20%，同時極差符合率大于80%的情況下，可以認為該核心庫較好地代表了原始種質(zhì)群體的遺傳多樣性水平[22]。

2　結(jié)果與分析

2.1　初級核心種質(zhì)的遺傳多樣性

依據(jù)前人研究報道和云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室研究結(jié)果[16-18]，篩選出15對多態(tài)性較高的SSR引物，用于核心種質(zhì)的遺傳多樣性研究。標記數(shù)據(jù)分析(表1)顯示，15對SSR引物共獲得331個擴增條帶，平均每對SSR引物獲得22.1個擴增條帶，多態(tài)性條帶比例為100%。其中，SMC278CS引物獲得36個多態(tài)性擴增條帶，SMC1047HA獲得32個多態(tài)性擴增條帶。15對SSR引物平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.985 6，平均Shannon-Weiner多樣性指數(shù)為4.358 3。說明割手密初級核心種質(zhì)庫在15個SSR位點上遺傳多樣性十分豐富。

表1　15對SSR引物在92份割手密初級核心種質(zhì)間的多態(tài)性分析結(jié)果

表1(續(xù))

2.2　核心種質(zhì)的取樣策略

依據(jù)Jaccard、Nei & Li和SM 3種遺傳相似性系數(shù)，采用UPGMA系統(tǒng)聚類法構(gòu)建割手密核心種質(zhì)庫，隨著剔除材料的逐漸增多，多次聚類取樣建立的核心種質(zhì)遺傳多樣性呈下降趨勢。當樣本剔除到第13個材料時，剩余的79份材料所組成的核心種質(zhì)Nei’s遺傳多樣性指數(shù)與原庫檢驗沒有顯著差異，但Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與原庫呈顯著差異；當剔除12份材料時，剩余80份材料形成的核心種質(zhì)庫與原庫之間的Nei’s遺傳多樣性和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)均不存在顯著差異，Jaccard、Nei & Li和SM 3種遺傳相似性系數(shù)逐步聚類的結(jié)果基本一致。據(jù)此，可以認為剩余的80份材料構(gòu)成的核心種質(zhì)庫為該相似性系數(shù)下最優(yōu)核心庫，分別編號為J-80、NL-80和SM-80。

2.3　核心種質(zhì)的代表性檢測

為比較依托3種遺傳相似性系數(shù)構(gòu)建的割手密核心種質(zhì)庫的質(zhì)量，隨機取樣，構(gòu)建編號為RS-80-1和RS-80-2的2個隨機核心種質(zhì)庫。根據(jù)5個核心種質(zhì)庫與原庫的檢驗結(jié)果(表2)，5個核心庫均與原庫的Nei’s遺傳多樣性沒有顯著差異；隨機核心種質(zhì)庫RS-80-1和RS-80-2的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與原庫在<0.05的概率水平下呈顯著差異，核心種質(zhì)庫SM-80、J-80、NL-80與原庫均無顯著差異，說明隨機核心種質(zhì)庫RS-80-1和RS-80-2不能完全代表原庫的遺傳多樣性水平。

表2　核心種質(zhì)庫與原庫多樣性指數(shù)差值的t檢驗結(jié)果

“SM-66”示SM核心庫與原庫差異顯著時樣本的數(shù)量為66。“*”示在0.05水平差異顯著。

從5個核心種質(zhì)庫保留的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)(表3)來看，核心庫SM-80保留了原庫的全部條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，核心庫J-80和NL-80丟失總條帶和多態(tài)性條帶各1個。根據(jù)不同核心庫27個數(shù)量性狀差異情況來看，5個核心種質(zhì)庫的均值差異百分率都為0，極差符合率為97.04%～100.00%，變異系數(shù)符合率為97.97%～103.45%，說明5個核心種質(zhì)庫與原庫數(shù)量性狀均沒有太大的差異，即新構(gòu)建的5個核心種質(zhì)庫較好地代表了原庫的表型遺傳多樣性水平。

表3　不同核心種質(zhì)庫在總條帶、多態(tài)性條帶和農(nóng)藝性狀相關檢測指標上的評價結(jié)果

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)3個指標能夠有效地評價5個核心種質(zhì)庫的質(zhì)量好壞。筆者最終從分子遺傳多樣性、保留的總條帶數(shù)、保留的多態(tài)性條帶數(shù)和表型性狀差異情況，確定核心種質(zhì)庫SM-80作為最佳核心庫。該庫由80份材料組成(表4)，占初級核心種質(zhì)庫的86.96%，占原始種質(zhì)(596)的13.42%。SM-80核心種質(zhì)Nei’s多樣性指數(shù)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分別為0.984 1和4.259 8，在<0.05概率條件下與原庫(分別為0.985 6和4.358 3)無顯著差異，而且與原庫的農(nóng)藝性狀均值差異百分率為0(<20.00%)，極差符合率為99.16%(>80.00%)。以上數(shù)據(jù)綜合表明，核心庫SM-80較好地代表了原始種質(zhì)群體的農(nóng)藝性狀水平。

表4　入選核心種質(zhì)庫的80種材料

3　結(jié)論與討論

齊永文等[13]研究了SSR引物數(shù)量和種質(zhì)鑒別能力間的關系，結(jié)果表明，當使用5對引物時，鑒別出的種質(zhì)數(shù)量可達到所有種質(zhì)的90%；當使用9對引物時，可鑒別出所有種質(zhì)，說明9對引物已經(jīng)能夠鑒別所有種質(zhì)。本研究中，15對SSR引物產(chǎn)生331個多態(tài)性條帶，平均每對引物產(chǎn)生22.1個條帶；而齊永文等[13]應用20對SSR引物產(chǎn)生454個多態(tài)性條帶，平均每對引物產(chǎn)生22.7個條帶。2個研究中，平均每對引物產(chǎn)生的條帶數(shù)相差不大，間接證明15對SSR引物多態(tài)性豐富?？偟亩鄳B(tài)性條帶數(shù)(331)僅為齊永文等[13]的72.9%，說明在核心庫構(gòu)建過程中，SSR引物數(shù)量越多，更能夠準確反映群體的遺傳多樣性，建議在以后的核心庫構(gòu)建過程中要保證足夠的SSR引物數(shù)量。

董玉琛等[24]認為核心庫構(gòu)建可以分2步：首先依托表型數(shù)據(jù)(數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀)構(gòu)建初級核心種質(zhì)庫；在此基礎上，利用分子標記數(shù)據(jù)進行DNA水平的遺傳冗余壓縮，從而篩選到既在分子層面又在表型層面具有代表性的核心種質(zhì)庫，此方法在甘蔗[10]、大豆[25]、柿子[26]等植物上得到了應用。本研究以國家甘蔗種質(zhì)資源圃保育的596份割手密為原始種質(zhì)群體，基于表型和SSR分子標記數(shù)據(jù)，構(gòu)建了割手密初級核心種質(zhì)92份(占總資源的15.4%)和核心種質(zhì)80份(占總資源的13.4%)，并應用4個分子標記指標和4個數(shù)量性狀指標進行驗證。結(jié)果表明，依托SM遺傳相似系數(shù)構(gòu)建的核心庫質(zhì)量最優(yōu)，在<0.05概率條件下，SM-80的多樣性指數(shù)與原庫的無顯著差異，與原庫的農(nóng)藝性狀均值差異百分率為0(<20.00%)，極差符合率為99.16%(>80.00%)，說明SM-80對原庫表型性狀和分子遺傳多樣性都具有較好的代表性。該庫由80 份割手密無性系組成，占原初級核心種質(zhì)庫的86.9%，占原始種質(zhì)群體(=596)的13.4%。2個隨機核心種質(zhì)庫，雖然在表型水平對原庫具有較好的代表性，但在分子水平上，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與原庫存在顯著差異，而依據(jù)SM遺傳相似性系數(shù)構(gòu)建的核心種質(zhì)庫在表型和分子水平的遺傳多樣性都具有較好的代表性?？梢?，依據(jù)相似性系數(shù)構(gòu)建的核心種質(zhì)庫質(zhì)量要優(yōu)于同等數(shù)量的隨機核心種質(zhì)庫。

綜上所述，本研究構(gòu)建的割手密核心種質(zhì)數(shù)量少且較好地代表了596份原始種質(zhì)群體的遺傳多樣性水平，有利于針對性地開展鑒定評價，大幅縮短工作時間和節(jié)省工作量，為后續(xù)割手密種質(zhì)資源的精準鑒定、優(yōu)異抗性基因發(fā)掘和種質(zhì)資源雜交利用提供依據(jù)。

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Construction of a core-collection ofbased on SSR molecular markers

XU Chaohua1,2, LIU Xinlong1,2, MAO Jun1,2, LIU Hongbo1,2, LIN Xiuqin1,2, LU Xin1,2*, SU Huosheng1,2*

(1.Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kaiyuan, Yunnan 661699, China; 2.Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan, Yunnan 661699, China)

A stepwise UPGMA cluster sampling approach with three different genetic similarity coefficients(Jaccard, SM, and Nei & Li) was applied to a SSR molecular data of 92-genotype primary core collection. Results showed that 92 genotypes possessed abundant genetic diversity at 15 SSR loci, which produced 331 polymorphic bands in amplification, constituting a mean of 100% of total bands. The genetic similarity coefficients were constructed with three approaches and two random samplings, which produced five putative core collections. To evaluate the quality of putative core collections, three indices, Shannon-Wiener diversity index, polymorphic band number and percentage of polymorphic bands, using core collections had the highest identification efficiency, while others were less efficient. The putative core collection constructed using SM genetic similarity coefficient had higher quality than others. The putative core collection consisted of 80genotypes shaving a 0.984 1 Nei’s diversity index and 4.259 8 Shannon-Wiener diversity index, and did not differ significantly(<0.05) in molecular diversity from the primary core. Further, MD was 0%(<20.00%) and CR 99.16%(>80.00%).The putative core collection of 80genotypes based on SM genetic similarity coefficient did not differ significantly from the genetic diversity of the primary core regarding to the agronomic traits or molecular markers. The putative core will facilitate the evaluation and utilization of the germplasm in developing elite sugarcane hybrids, and mining elite genes.

; clustering; diversity index; molecular marker; core collection

S566.102.4

A

1007-1032(2020)06-0657-07

徐超華，劉新龍，毛鈞，劉洪博，林秀琴，陸鑫，蘇火生．基于SSR分子標記數(shù)據(jù)構(gòu)建割手密核心種質(zhì)庫[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2020，46(6)：657-663．

XU C H, LIU X L, MAO J, LIU H B, LIN X Q, LU X, SU H S. Construction of a core-collection ofbased on SSR molecular markers[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(6): 657-663.

http://xb.hunau.edu.cn

2019-11-28

2019-12-19

云南省農(nóng)業(yè)基礎研究聯(lián)合專項(2018FG001-017)；國家農(nóng)作物種質(zhì)資源共享服務平臺項目(NICGR-2019-44)；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部政府購買服務項目(19190167)

徐超華(1986—)，男，湖北洪湖人，碩士，助理研究員，主要從事甘蔗種質(zhì)資源的研究與利用，xuchaohua_0435@sina.com；*通信作者，陸鑫，碩士，副研究員，主要從事甘蔗種質(zhì)資源的研究與利用，xinlu_ky@126.com；*通信作者，蘇火生，碩士，副研究員，主要從事甘蔗種質(zhì)資源的研究與利用，shs304@163.com

10.13331/j.cnki.jhau.2020.06.004

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正