屈江玲，曹冬梅，2，3，湯華成，婁雨豪

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室；3.國家雜糧工程技術(shù)研究中心）

根據(jù)以往的研究，全世界使用的400 萬t 農(nóng)藥中，只有1%揮發(fā)到空氣中，其余消散到土壤、水等環(huán)境介質(zhì)中，最終80%進入土壤環(huán)境[1-2]。因此，研究施用農(nóng)藥在土壤中的降解行為對探究該農(nóng)藥的有效性和持久性有重要意義，更有利于對農(nóng)藥的環(huán)境行為進行監(jiān)測。近幾年，隨著認識到紅豆、綠豆等雜糧豐富的營養(yǎng)，越來越多人喜愛食用雜糧。各類雜糧也被大量種植，其中豆類因其高含量的蛋白質(zhì)（20%~50%），深受人們歡迎[3]。而為獲取高產(chǎn)量，農(nóng)民廣泛并大量使用精喹禾靈。

精喹禾靈（quizalofop-p-ethyl）除草劑主要用于大豆、油菜等農(nóng)作物中，清除禾本科雜草[4-7]。其在有土壤、植物組織等環(huán)境介質(zhì)存在的情況下，能迅速水解成相應(yīng)的精喹禾靈酸（quizalofop-p-acid），具有手性和生物活性[8-9]。精喹禾靈和精喹禾靈酸均可抑制目標雜草葉中細胞脂肪酸的合成，導致生長抑制和惡化[10]。兩者已被證明具有生殖和基因毒性[12-16]。Mustafa 等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，蔥屬植物根分生組織細胞總?cè)旧w畸變量隨精喹禾靈濃度的增加而增加。Elefsiniotis 等[11]研究了精喹禾靈對肝臟的影響，發(fā)現(xiàn)精喹禾靈會造成梗阻性膽汁淤積，肝臟活性檢查證明了精喹禾靈的毒性。由于兩者廣泛的應(yīng)用范圍，人類和許多其他動物通過主動或被動過程暴露于這兩種化合物下。

目前常見的除草劑提取技術(shù)有液-液萃取法（LLE）、固相萃取法（SPE）。但前者用時久，且浪費大量有機溶劑，既不環(huán)保也花費高[17]。后者所需的墨盒較為昂貴，而且對于有些除草劑還會吸收導致?lián)p耗。而近年來，快速、簡便、廉價、有效、可靠、安全的方法—QuEChERS 法在農(nóng)藥檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。選用QuEChERS 法，與其它提取方法相比，該方法安全、簡便、經(jīng)濟、有效、高效、可靠。

釋放到土壤中的農(nóng)藥會經(jīng)歷幾個物理、化學和生物過程，包括吸附、地表徑流、洗脫、揮發(fā)、吸附和降解。Wink 等[18]在好氧條件下，分別在兩種土壤中培養(yǎng)并觀察到禾草靈和惡唑禾草靈迅速水解成相應(yīng)的酸并積累S 型對映體酸。Liu 等[19]在藻類培養(yǎng)中觀察到手性除草劑對映體選擇性降解存在差異，表明它們的應(yīng)用形式是決定其對映體選擇性環(huán)境行為的重要因素。Li 等[20]發(fā)現(xiàn)喹禾靈的耗散分為兩個階段，第一個階段迅速減少，持續(xù)1 d；第二個階段緩慢減少，直至降解結(jié)束。Diao 等[21]研究了在好氧和厭氧條件下，禾草靈及其主要代謝物二氯苯氧基丙酸在兩種土壤中的降解情況。結(jié)果顯示，兩種土壤中禾草靈的降解不是對映體選擇性的，兩種土壤的計算半衰均小于1 d。然而，兩種土壤中二氯苯氧基丙酸的降解都是對映選擇性的，S 型二氯苯氧基丙酸優(yōu)先被降解，導致R 型二氯苯氧基丙酸相對富集。

對于農(nóng)藥在土壤中的降解因子，有學者進行過深入研究。其中，有學者證明三唑酮、毒死蜱等農(nóng)藥降解時隨溫度變化較大。在合適的溫度范圍內(nèi)，降解速率與溫度變化保持一致[22]。有學者分析原因為溫度升高，有機物易于分解，導致容易被微生物吸收。另一方面，溫度可能也在逐漸達到微生物最舒適的狀態(tài)，活性增加。當然，如果溫度增加過高也會使得微生物生長受到抑制。此外，還有學者證明，溫度可以使得農(nóng)藥水解加快。但不同農(nóng)藥隨溫度變化不同。有學者發(fā)現(xiàn)，濕度影響農(nóng)藥的水解從而影響降解速率，還會影響微生物的活性。有機質(zhì)的含量影響土壤質(zhì)地從而改變土壤對農(nóng)藥的吸附性，而且也會影響微生物的繁殖速度[23]。不同農(nóng)藥隨環(huán)境因子變化較大，精喹禾靈的變化趨勢還有待分析。

此前也有學者對精喹禾靈降解規(guī)律進行過分析，但少有人研究精喹禾靈的代謝物精喹禾靈酸，而其也具有毒性[24-27]。此外，研究影響精喹禾靈及精喹禾靈酸降解的因素，有利于監(jiān)測兩者的殘留動態(tài)以及對環(huán)境的影響，同時還可以尋找出加快兩者在環(huán)境土壤中的降解。

1 材料與方法

1.1 土壤的制備及其理化性質(zhì)的測定

土壤樣品采集于黑龍江省大慶市，采用隨機采樣法，挖取10 cm 深的土壤。在挖取過程中，篩選出可見的石頭、植物殘渣等。風干碾碎，過篩備用。黑龍江省大慶市土壤屬暗棕壤，土壤pH 值為8.4，有機質(zhì)含量為19.3 g·kg-1。

1.2 試劑

精喹禾靈標品和精喹禾靈酸標品。分析純乙腈和冰乙酸作萃取劑。色譜純乙腈和娃哈哈純凈水作流動相。精喹禾靈和精喹禾靈酸溶于分析純乙腈制備1 000 mg·mL-1濃度的母液。

1.3 實驗設(shè)備

安捷倫1 260 Infinity II 高效液相色譜儀。Athena C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）。DAD 檢測器。

1.4 檢測方法

1.4.1 前處理方法

取5 g 樣品土壤放于50 mL 離心管中。萃取劑選用含1%乙酸的乙腈。取15 mL 萃取劑置于離心管內(nèi)，渦旋2 min 讓萃取劑充分萃取。再加入0.1 g NaCl，渦旋30 s 讓水與有機溶劑分層。最后加入1.5 g 無水MgSO4，渦旋30 s 將水分吸收，4 000 r·min-1離心10 min。用移液器取7.5 mL 上層液體至試管中，將試管放置于氮吹儀上，于40 ℃下吹干濾液。再用1 mL乙腈定容，溶取檢測物質(zhì)，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.4.2 色譜條件

等度洗脫，流動相：乙腈/含1%乙酸的水（70∶30，v/v），流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長為236 nm。

1.5 試驗設(shè)計

1.5.1 溫度對土壤中精喹禾靈及其代謝物降解的影響

土壤采用1.1 制備的土壤樣品，取5 g 土壤樣品放于試管中。精喹禾靈的添加濃度為2 mg·kg-1。土壤含水量為25%。每組制樣11 份，分別放置在15 ℃，25 ℃，35 ℃三個溫度梯度的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、10、14、21、28、42、60 d 依次取出樣品，按照1.4.1 中的前處理方法進行前處理，檢測精喹禾靈及其代謝物精喹禾靈酸的含量。

1.5.2 濕度對土壤中精喹禾靈及其代謝物降解的影響

土壤采用1.1 制備的土壤樣品，取5 g 土壤樣品放于試管中。精喹禾靈的添加濃度為2 mg·kg-1。土壤含水量為15%，25%，35%。每組制樣11 份，放置在25 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、10、14、21、28、42、60 d 依次取出樣品，按照1.4.1 中的前處理方法進行前處理，檢測精喹禾靈及其代謝物精喹禾靈酸的含量。

1.5.3 有機質(zhì)對土壤中精喹禾靈及其代謝物降解的影響

去除有機質(zhì)：取1.1 制備的土壤樣品200 g，放置于1 L 燒杯中，依次倒入10 mL 濃度為30%的過氧化氫溶液。反應(yīng)劇烈可以快速攪拌。待氣泡減少后再次加入過氧化氫溶液，直至有機質(zhì)含量小于0.05%。將處理好的去有機質(zhì)土壤樣品烘干碾碎，過70 目篩備用[28]。

分別取未去有機質(zhì)和去有機質(zhì)的土壤樣品5 g放于試管中。精喹禾靈的添加濃度為2 mg·kg-1。土壤含水量為25%。每組制樣11 份，放置在25 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、10、14、21、28、42、60 d 依次取出樣品，按照1.4.1 中的前處理方法進行前處理，檢測精喹禾靈及其代謝物精喹禾靈酸的含量。

1.5.4 微生物對土壤中精喹禾靈及其代謝物降解的影響

土壤滅菌處理：取1.1 制備的土壤樣品200 g，放置于500 mL 燒杯中，并用紙和橡皮膠密封好，放置在120 ℃的滅菌鍋中滅菌3 次。滅菌后的土壤于50 ℃烘箱中烘干，過70 目篩備用[28]。

分別取未滅菌和滅菌的土壤樣品5 g 放于試管中。精喹禾靈的添加濃度為2 mg·kg-1。土壤含水量為25%。每組制樣11 份，放置在25 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、10、14、21、28、42、60 d 依次取出樣品，按照1.4.1 中的前處理方法進行前處理，檢測精喹禾靈及其代謝物精喹禾靈酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線及方法的準確度、精密度

用0.5、1、2、5、25 μg·mL-1濃度梯度的標準溶液繪制標準曲線。回收率可通過標準曲線計算得到。如表1 所示，精喹禾靈和精喹禾靈酸的決定系數(shù)R2分別為0.999 5 和0.999 8，線性回歸性良好。

表1 標準溶液回歸方程Table 1 Standard solution regression equations

檢測方法的準確度和精密度通常通過添加回收率和相對標準偏差確定。土壤樣品添加濃度依次為0.05、0.2、2 mg·kg-1。日間精度為連續(xù)5 d 檢測樣品土壤，日內(nèi)精度為1 d 檢測5 次樣品土壤。從表2 可以看出，土壤樣品中精喹禾靈和精喹禾靈酸的添加回收率分別在95.6%~103.2%和97.1%~105.6%之間。相對偏差分別在0.36~3.55 和0.96~3.18 之間?？梢姕蚀_度和精密度都能滿足精喹禾靈及其代謝物的檢測要求。以信噪比S/N=3 確定檢出限，精喹禾靈及精喹禾靈酸的檢出限為0.005 mg·kg-1和0.003 mg·kg-1。

2.2 溫度對精喹禾靈及其代謝物降解的影響

適宜的溫度對精喹禾靈和精喹禾靈酸的降解速率有很大影響。從圖1 中可以看出，25 ℃條件下，土壤中兩種化合物的降解最快。35 ℃條件下次之，15 ℃條件下最慢。原因分析，35 ℃和15 ℃不是微生物生存的最佳溫度，導致其降解速率變慢。其次，溫度也影響了精喹禾靈的水解。圖1 中可以看出，精喹禾靈酸隨著精喹禾靈的分解先增加，然后逐漸也被分解，其最高殘留量大概在3~5 d 的時候，其隨溫度的變化與精喹禾靈一致，精喹禾靈降解的越慢，其最大值往右移動。

表2 精喹禾靈及其代謝物在土壤中的添加回收率和相對標準偏差（RSDs）Table 2 Recoveries and RSDs for quizalofop-p-ethyl and and its metabolite in soil

精喹禾靈的降解隨時間先快后慢，符合一階動力學方程，因此用一階動力學方程來擬合其降解曲線，及濃度C=C0e-kt，其半衰期T1/2=ln2/k[28]。不同溫度下的一階動力學方程及半衰期如表3 所示，15 ℃和35 ℃條件下精喹禾靈的半衰期分別為13.6、12.8 d，而25 ℃時則短至5.3 d。

圖1 精喹禾靈及其代謝物在不同溫度土壤中的降解Fig.1 Degradation of quizalofop-p-ethyl and its metabolite in soil at different temperatures

表3 精喹禾靈在不同溫度土壤中的動力學方程及半衰期Table 3 The kinetic equation and half-life of quizalofop-p-ethyl in different temperature soil

2.3 濕度對精喹禾靈及其代謝物降解的影響

從圖2 中可以看出，當濕度在15%到35%范圍內(nèi)變化時，精喹禾靈的降解速率隨著濕度的增加而逐漸加快，不過速率變化幅度很小，35%的含水量條件下分解最快?？赡苁俏⑸镌撊N濕度條件下都能保持很好的活性，當濕度略微增加時，微生物分解精喹禾靈的速率也有所增加。此外，水分較多時，精喹禾靈溶解的也比較多，這也可能對精喹禾靈的非生物降解有一定影響。精喹禾靈酸的變化趨勢仍是隨著時間增加，先極具增加，再逐漸減小，隨濕度的變化幾乎與精喹禾靈一致，精喹禾靈降解越慢，其最大值往右移動。精喹禾靈在三種濕度條件下的半衰期比較接近（表4），分別為5.6、5.3、5.3 d，都降解的比較快。

2.4 有機質(zhì)對精喹禾靈及其代謝物降解的影響

從圖3 中可以看出，去除有機質(zhì)的土壤精喹禾靈降解的速率明顯減慢下來。去除了有機質(zhì)的土壤可能嚴重影響了微生物的繁殖。此外土壤中的腐殖質(zhì)含量也可能影響了精喹禾靈的水解。有機質(zhì)含量對于土壤吸附精喹禾靈也有影響。從圖中可以看出，精喹禾靈酸的減小的趨勢也變得平緩，大約在7~10 d達到最大值，最大值時間往右移動較多。從表5 中可以看出，精喹禾靈在去有機質(zhì)土中的半衰期比較長，達到21.7 d。

圖2 精喹禾靈及其代謝物在不同濕度土壤中的降解Fig.2 Degradation of quizalofop-p-ethyl and its metabolites in soil with different humidity

表4 精喹禾靈在不同濕度土壤中的動力學方程及半衰期Table 4 The kinetic equation and half-life of quizalofop-p-ethyl in different humidity soil

圖3 精喹禾靈及其代謝物在未去有機質(zhì)和去有機質(zhì)土壤中的降解Fig.3 The degradation of quizalofop-p-ethyl its metabolites in soil without removing organic matter and removing organic matter

表5 精喹禾靈在未去有機質(zhì)和去有機質(zhì)土壤中的動力學方程及半衰期Table 5 The kinetic equation and half-life of quizalofop-p-ethyl in the soil without removing organic matter and removing organic matter

2.5 微生物對精喹禾靈及其代謝物降解的影響

微生物對精喹禾靈及其代謝物降解速率的影響結(jié)果如圖4 所示。由于滅菌土壤中只有化學降解，降解速率顯著減小?？梢娚锝到庹计浜艽蟊壤?。而精喹禾靈酸在滅菌的土壤中變化趨勢變化較大，先增多，后逐漸變平緩，有上下波動?？赡苁且环矫婢天`在降解為精喹禾靈酸，另一方面其本身也在降解。表6 顯示，精喹禾靈在滅菌土壤中的半衰期延長至38.5 d，在所有條件中降解最慢。

圖4 精喹禾靈及其代謝物在未滅菌和滅菌土壤中的降解Fig.4 Degradation of quizalofop-p-ethyl and its metabolites in unsterilized and sterilized soil

表6 精喹禾靈在未滅菌和滅菌土壤中的動力學方程及半衰期Table 6 The kinetic equation and half-life of quizalofop-p-ethyl in unsterilized and sterilized soil

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，土壤中殘留的精喹禾靈中間代謝物為精喹禾靈酸。在室溫25°C 時，35%的含水量下，有機質(zhì)含量高的土壤，精喹禾靈及其代謝物降解最快。土微生物對精喹禾靈及其代謝物降解影響最大。同時也說明了精喹禾靈及其代謝物同時存在化學降解和微生物降解。

溫度過高或過低都不利于精喹禾靈及其代謝物的降解，在較小的范圍內(nèi)，濕度的增加有利于精喹禾靈及其代謝物的降解。溫度、濕度對精喹禾靈及其代謝物的降解一定程度上是因為影響了微生物活性。當然也改變了精喹禾靈化學降解的條件，這些都會改變兩者的降解速率。去除有機質(zhì)的試驗表明，在貧瘠的土壤中，精喹禾靈及其代謝物的殘留時間可能更長。

綜上所述，微生物是影響精喹禾靈及其代謝物的最大影響因子，選擇適合微生物生長的環(huán)境，更有利于精喹禾靈及其代謝物的快速降解。適宜的環(huán)境溫度、較高的含水量和有機質(zhì)含量條件對精喹禾靈的降解有促進作用。