屈江玲，曹冬梅，2，3，湯華成，婁雨豪

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心）

根據(jù)以往的研究，全世界使用的400 萬(wàn)t 農(nóng)藥中，只有1%揮發(fā)到空氣中，其余消散到土壤、水等環(huán)境介質(zhì)中，最終80%進(jìn)入土壤環(huán)境[1-2]。因此，研究施用農(nóng)藥在土壤中的降解行為對(duì)探究該農(nóng)藥的有效性和持久性有重要意義，更有利于對(duì)農(nóng)藥的環(huán)境行為進(jìn)行監(jiān)測(cè)。近幾年，隨著認(rèn)識(shí)到紅豆、綠豆等雜糧豐富的營(yíng)養(yǎng)，越來(lái)越多人喜愛(ài)食用雜糧。各類雜糧也被大量種植，其中豆類因其高含量的蛋白質(zhì)（20%~50%），深受人們歡迎[3]。而為獲取高產(chǎn)量，農(nóng)民廣泛并大量使用精喹禾靈。

精喹禾靈（quizalofop-p-ethyl）除草劑主要用于大豆、油菜等農(nóng)作物中，清除禾本科雜草[4-7]。其在有土壤、植物組織等環(huán)境介質(zhì)存在的情況下，能迅速水解成相應(yīng)的精喹禾靈酸（quizalofop-p-acid），具有手性和生物活性[8-9]。精喹禾靈和精喹禾靈酸均可抑制目標(biāo)雜草葉中細(xì)胞脂肪酸的合成，導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和惡化[10]。兩者已被證明具有生殖和基因毒性[12-16]。Mustafa 等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，蔥屬植物根分生組織細(xì)胞總?cè)旧w畸變量隨精喹禾靈濃度的增加而增加。Elefsiniotis 等[11]研究了精喹禾靈對(duì)肝臟的影響，發(fā)現(xiàn)精喹禾靈會(huì)造成梗阻性膽汁淤積，肝臟活性檢查證明了精喹禾靈的毒性。由于兩者廣泛的應(yīng)用范圍，人類和許多其他動(dòng)物通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)過(guò)程暴露于這兩種化合物下。

目前常見(jiàn)的除草劑提取技術(shù)有液-液萃取法（LLE）、固相萃取法（SPE）。但前者用時(shí)久，且浪費(fèi)大量有機(jī)溶劑，既不環(huán)保也花費(fèi)高[17]。后者所需的墨盒較為昂貴，而且對(duì)于有些除草劑還會(huì)吸收導(dǎo)致?lián)p耗。而近年來(lái)，快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、有效、可靠、安全的方法—QuEChERS 法在農(nóng)藥檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。選用QuEChERS 法，與其它提取方法相比，該方法安全、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效、高效、可靠。

釋放到土壤中的農(nóng)藥會(huì)經(jīng)歷幾個(gè)物理、化學(xué)和生物過(guò)程，包括吸附、地表徑流、洗脫、揮發(fā)、吸附和降解。Wink 等[18]在好氧條件下，分別在兩種土壤中培養(yǎng)并觀察到禾草靈和惡唑禾草靈迅速水解成相應(yīng)的酸并積累S 型對(duì)映體酸。Liu 等[19]在藻類培養(yǎng)中觀察到手性除草劑對(duì)映體選擇性降解存在差異，表明它們的應(yīng)用形式是決定其對(duì)映體選擇性環(huán)境行為的重要因素。Li 等[20]發(fā)現(xiàn)喹禾靈的耗散分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段迅速減少，持續(xù)1 d；第二個(gè)階段緩慢減少，直至降解結(jié)束。Diao 等[21]研究了在好氧和厭氧條件下，禾草靈及其主要代謝物二氯苯氧基丙酸在兩種土壤中的降解情況。結(jié)果顯示，兩種土壤中禾草靈的降解不是對(duì)映體選擇性的，兩種土壤的計(jì)算半衰均小于1 d。然而，兩種土壤中二氯苯氧基丙酸的降解都是對(duì)映選擇性的，S 型二氯苯氧基丙酸優(yōu)先被降解，導(dǎo)致R 型二氯苯氧基丙酸相對(duì)富集。

對(duì)于農(nóng)藥在土壤中的降解因子，有學(xué)者進(jìn)行過(guò)深入研究。其中，有學(xué)者證明三唑酮、毒死蜱等農(nóng)藥降解時(shí)隨溫度變化較大。在合適的溫度范圍內(nèi)，降解速率與溫度變化保持一致[22]。有學(xué)者分析原因?yàn)闇囟壬?，有機(jī)物易于分解，導(dǎo)致容易被微生物吸收。另一方面，溫度可能也在逐漸達(dá)到微生物最舒適的狀態(tài)，活性增加。當(dāng)然，如果溫度增加過(guò)高也會(huì)使得微生物生長(zhǎng)受到抑制。此外，還有學(xué)者證明，溫度可以使得農(nóng)藥水解加快。但不同農(nóng)藥隨溫度變化不同。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，濕度影響農(nóng)藥的水解從而影響降解速率，還會(huì)影響微生物的活性。有機(jī)質(zhì)的含量影響土壤質(zhì)地從而改變土壤對(duì)農(nóng)藥的吸附性，而且也會(huì)影響微生物的繁殖速度[23]。不同農(nóng)藥隨環(huán)境因子變化較大，精喹禾靈的變化趨勢(shì)還有待分析。

此前也有學(xué)者對(duì)精喹禾靈降解規(guī)律進(jìn)行過(guò)分析，但少有人研究精喹禾靈的代謝物精喹禾靈酸，而其也具有毒性[24-27]。此外，研究影響精喹禾靈及精喹禾靈酸降解的因素，有利于監(jiān)測(cè)兩者的殘留動(dòng)態(tài)以及對(duì)環(huán)境的影響，同時(shí)還可以尋找出加快兩者在環(huán)境土壤中的降解。

1 材料與方法

1.1 土壤的制備及其理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤樣品采集于黑龍江省大慶市，采用隨機(jī)采樣法，挖取10 cm 深的土壤。在挖取過(guò)程中，篩選出可見(jiàn)的石頭、植物殘?jiān)?。風(fēng)干碾碎，過(guò)篩備用。黑龍江省大慶市土壤屬暗棕壤，土壤pH 值為8.4，有機(jī)質(zhì)含量為19.3 g·kg-1。

1.2 試劑

精喹禾靈標(biāo)品和精喹禾靈酸標(biāo)品。分析純乙腈和冰乙酸作萃取劑。色譜純乙腈和娃哈哈純凈水作流動(dòng)相。精喹禾靈和精喹禾靈酸溶于分析純乙腈制備1 000 mg·mL-1濃度的母液。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

安捷倫1 260 Infinity II 高效液相色譜儀。Athena C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）。DAD 檢測(cè)器。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 前處理方法

取5 g 樣品土壤放于50 mL 離心管中。萃取劑選用含1%乙酸的乙腈。取15 mL 萃取劑置于離心管內(nèi)，渦旋2 min 讓萃取劑充分萃取。再加入0.1 g NaCl，渦旋30 s 讓水與有機(jī)溶劑分層。最后加入1.5 g 無(wú)水MgSO4，渦旋30 s 將水分吸收，4 000 r·min-1離心10 min。用移液器取7.5 mL 上層液體至試管中，將試管放置于氮吹儀上，于40 ℃下吹干濾液。再用1 mL乙腈定容，溶取檢測(cè)物質(zhì)，過(guò)0.22 μm 濾膜，待測(cè)。

1.4.2 色譜條件

等度洗脫，流動(dòng)相：乙腈/含1%乙酸的水（70∶30，v/v），流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 溫度對(duì)土壤中精喹禾靈及其代謝物降解的影響

土壤采用1.1 制備的土壤樣品，取5 g 土壤樣品放于試管中。精喹禾靈的添加濃度為2 mg·kg-1。土壤含水量為25%。每組制樣11 份，分別放置在15 ℃，25 ℃，35 ℃三個(gè)溫度梯度的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、10、14、21、28、42、60 d 依次取出樣品，按照1.4.1 中的前處理方法進(jìn)行前處理，檢測(cè)精喹禾靈及其代謝物精喹禾靈酸的含量。

1.5.2 濕度對(duì)土壤中精喹禾靈及其代謝物降解的影響

土壤采用1.1 制備的土壤樣品，取5 g 土壤樣品放于試管中。精喹禾靈的添加濃度為2 mg·kg-1。土壤含水量為15%，25%，35%。每組制樣11 份，放置在25 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、10、14、21、28、42、60 d 依次取出樣品，按照1.4.1 中的前處理方法進(jìn)行前處理，檢測(cè)精喹禾靈及其代謝物精喹禾靈酸的含量。

1.5.3 有機(jī)質(zhì)對(duì)土壤中精喹禾靈及其代謝物降解的影響

去除有機(jī)質(zhì)：取1.1 制備的土壤樣品200 g，放置于1 L 燒杯中，依次倒入10 mL 濃度為30%的過(guò)氧化氫溶液。反應(yīng)劇烈可以快速攪拌。待氣泡減少后再次加入過(guò)氧化氫溶液，直至有機(jī)質(zhì)含量小于0.05%。將處理好的去有機(jī)質(zhì)土壤樣品烘干碾碎，過(guò)70 目篩備用[28]。

分別取未去有機(jī)質(zhì)和去有機(jī)質(zhì)的土壤樣品5 g放于試管中。精喹禾靈的添加濃度為2 mg·kg-1。土壤含水量為25%。每組制樣11 份，放置在25 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、10、14、21、28、42、60 d 依次取出樣品，按照1.4.1 中的前處理方法進(jìn)行前處理，檢測(cè)精喹禾靈及其代謝物精喹禾靈酸的含量。

1.5.4 微生物對(duì)土壤中精喹禾靈及其代謝物降解的影響

土壤滅菌處理：取1.1 制備的土壤樣品200 g，放置于500 mL 燒杯中，并用紙和橡皮膠密封好，放置在120 ℃的滅菌鍋中滅菌3 次。滅菌后的土壤于50 ℃烘箱中烘干，過(guò)70 目篩備用[28]。

分別取未滅菌和滅菌的土壤樣品5 g 放于試管中。精喹禾靈的添加濃度為2 mg·kg-1。土壤含水量為25%。每組制樣11 份，放置在25 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。于0、1、3、5、7、10、14、21、28、42、60 d 依次取出樣品，按照1.4.1 中的前處理方法進(jìn)行前處理，檢測(cè)精喹禾靈及其代謝物精喹禾靈酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法的準(zhǔn)確度、精密度

用0.5、1、2、5、25 μg·mL-1濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回收率可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。如表1 所示，精喹禾靈和精喹禾靈酸的決定系數(shù)R2分別為0.999 5 和0.999 8，線性回歸性良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程Table 1 Standard solution regression equations

檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度通常通過(guò)添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差確定。土壤樣品添加濃度依次為0.05、0.2、2 mg·kg-1。日間精度為連續(xù)5 d 檢測(cè)樣品土壤，日內(nèi)精度為1 d 檢測(cè)5 次樣品土壤。從表2 可以看出，土壤樣品中精喹禾靈和精喹禾靈酸的添加回收率分別在95.6%~103.2%和97.1%~105.6%之間。相對(duì)偏差分別在0.36~3.55 和0.96~3.18 之間?？梢?jiàn)準(zhǔn)確度和精密度都能滿足精喹禾靈及其代謝物的檢測(cè)要求。以信噪比S/N=3 確定檢出限，精喹禾靈及精喹禾靈酸的檢出限為0.005 mg·kg-1和0.003 mg·kg-1。

2.2 溫度對(duì)精喹禾靈及其代謝物降解的影響

適宜的溫度對(duì)精喹禾靈和精喹禾靈酸的降解速率有很大影響。從圖1 中可以看出，25 ℃條件下，土壤中兩種化合物的降解最快。35 ℃條件下次之，15 ℃條件下最慢。原因分析，35 ℃和15 ℃不是微生物生存的最佳溫度，導(dǎo)致其降解速率變慢。其次，溫度也影響了精喹禾靈的水解。圖1 中可以看出，精喹禾靈酸隨著精喹禾靈的分解先增加，然后逐漸也被分解，其最高殘留量大概在3~5 d 的時(shí)候，其隨溫度的變化與精喹禾靈一致，精喹禾靈降解的越慢，其最大值往右移動(dòng)。

表2 精喹禾靈及其代謝物在土壤中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）Table 2 Recoveries and RSDs for quizalofop-p-ethyl and and its metabolite in soil

精喹禾靈的降解隨時(shí)間先快后慢，符合一階動(dòng)力學(xué)方程，因此用一階動(dòng)力學(xué)方程來(lái)擬合其降解曲線，及濃度C=C0e-kt，其半衰期T1/2=ln2/k[28]。不同溫度下的一階動(dòng)力學(xué)方程及半衰期如表3 所示，15 ℃和35 ℃條件下精喹禾靈的半衰期分別為13.6、12.8 d，而25 ℃時(shí)則短至5.3 d。

圖1 精喹禾靈及其代謝物在不同溫度土壤中的降解Fig.1 Degradation of quizalofop-p-ethyl and its metabolite in soil at different temperatures

表3 精喹禾靈在不同溫度土壤中的動(dòng)力學(xué)方程及半衰期Table 3 The kinetic equation and half-life of quizalofop-p-ethyl in different temperature soil

2.3 濕度對(duì)精喹禾靈及其代謝物降解的影響

從圖2 中可以看出，當(dāng)濕度在15%到35%范圍內(nèi)變化時(shí)，精喹禾靈的降解速率隨著濕度的增加而逐漸加快，不過(guò)速率變化幅度很小，35%的含水量條件下分解最快。可能是微生物該三種濕度條件下都能保持很好的活性，當(dāng)濕度略微增加時(shí)，微生物分解精喹禾靈的速率也有所增加。此外，水分較多時(shí)，精喹禾靈溶解的也比較多，這也可能對(duì)精喹禾靈的非生物降解有一定影響。精喹禾靈酸的變化趨勢(shì)仍是隨著時(shí)間增加，先極具增加，再逐漸減小，隨濕度的變化幾乎與精喹禾靈一致，精喹禾靈降解越慢，其最大值往右移動(dòng)。精喹禾靈在三種濕度條件下的半衰期比較接近（表4），分別為5.6、5.3、5.3 d，都降解的比較快。

2.4 有機(jī)質(zhì)對(duì)精喹禾靈及其代謝物降解的影響

從圖3 中可以看出，去除有機(jī)質(zhì)的土壤精喹禾靈降解的速率明顯減慢下來(lái)。去除了有機(jī)質(zhì)的土壤可能嚴(yán)重影響了微生物的繁殖。此外土壤中的腐殖質(zhì)含量也可能影響了精喹禾靈的水解。有機(jī)質(zhì)含量對(duì)于土壤吸附精喹禾靈也有影響。從圖中可以看出，精喹禾靈酸的減小的趨勢(shì)也變得平緩，大約在7~10 d達(dá)到最大值，最大值時(shí)間往右移動(dòng)較多。從表5 中可以看出，精喹禾靈在去有機(jī)質(zhì)土中的半衰期比較長(zhǎng)，達(dá)到21.7 d。

圖2 精喹禾靈及其代謝物在不同濕度土壤中的降解Fig.2 Degradation of quizalofop-p-ethyl and its metabolites in soil with different humidity

表4 精喹禾靈在不同濕度土壤中的動(dòng)力學(xué)方程及半衰期Table 4 The kinetic equation and half-life of quizalofop-p-ethyl in different humidity soil

圖3 精喹禾靈及其代謝物在未去有機(jī)質(zhì)和去有機(jī)質(zhì)土壤中的降解Fig.3 The degradation of quizalofop-p-ethyl its metabolites in soil without removing organic matter and removing organic matter

表5 精喹禾靈在未去有機(jī)質(zhì)和去有機(jī)質(zhì)土壤中的動(dòng)力學(xué)方程及半衰期Table 5 The kinetic equation and half-life of quizalofop-p-ethyl in the soil without removing organic matter and removing organic matter

2.5 微生物對(duì)精喹禾靈及其代謝物降解的影響

微生物對(duì)精喹禾靈及其代謝物降解速率的影響結(jié)果如圖4 所示。由于滅菌土壤中只有化學(xué)降解，降解速率顯著減小?？梢?jiàn)生物降解占其很大比例。而精喹禾靈酸在滅菌的土壤中變化趨勢(shì)變化較大，先增多，后逐漸變平緩，有上下波動(dòng)?？赡苁且环矫婢天`在降解為精喹禾靈酸，另一方面其本身也在降解。表6 顯示，精喹禾靈在滅菌土壤中的半衰期延長(zhǎng)至38.5 d，在所有條件中降解最慢。

圖4 精喹禾靈及其代謝物在未滅菌和滅菌土壤中的降解Fig.4 Degradation of quizalofop-p-ethyl and its metabolites in unsterilized and sterilized soil

表6 精喹禾靈在未滅菌和滅菌土壤中的動(dòng)力學(xué)方程及半衰期Table 6 The kinetic equation and half-life of quizalofop-p-ethyl in unsterilized and sterilized soil

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，土壤中殘留的精喹禾靈中間代謝物為精喹禾靈酸。在室溫25°C 時(shí)，35%的含水量下，有機(jī)質(zhì)含量高的土壤，精喹禾靈及其代謝物降解最快。土微生物對(duì)精喹禾靈及其代謝物降解影響最大。同時(shí)也說(shuō)明了精喹禾靈及其代謝物同時(shí)存在化學(xué)降解和微生物降解。

溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于精喹禾靈及其代謝物的降解，在較小的范圍內(nèi)，濕度的增加有利于精喹禾靈及其代謝物的降解。溫度、濕度對(duì)精喹禾靈及其代謝物的降解一定程度上是因?yàn)橛绊懥宋⑸锘钚?。?dāng)然也改變了精喹禾靈化學(xué)降解的條件，這些都會(huì)改變兩者的降解速率。去除有機(jī)質(zhì)的試驗(yàn)表明，在貧瘠的土壤中，精喹禾靈及其代謝物的殘留時(shí)間可能更長(zhǎng)。

綜上所述，微生物是影響精喹禾靈及其代謝物的最大影響因子，選擇適合微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，更有利于精喹禾靈及其代謝物的快速降解。適宜的環(huán)境溫度、較高的含水量和有機(jī)質(zhì)含量條件對(duì)精喹禾靈的降解有促進(jìn)作用。