金光輝，張春雨，張桂芝，李鑫，王鵬程，姜麗麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

馬鈴薯食用部分生長(zhǎng)于土壤中，形似豆?fàn)頪1]，故俗稱(chēng)土豆，起源于南美洲秘魯?shù)陌驳谒股矫}，是世界第三大主糧作物，具有較高的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。瘡痂病是當(dāng)前危害馬鈴薯商品薯和種薯且極難防治的世界級(jí)土傳病害之一，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前，瘡痂病的防治措施有輪作、深翻、施用有機(jī)肥等物理防治和使用五氯硝基苯[2]、硫酸鏈霉素和噻菌銅[3]等化學(xué)藥劑的化學(xué)防治方式，但防治效果并不理想，嚴(yán)重影響我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。選育抗病品種是防治瘡痂病最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一。馬鈴薯瘡痂病是由放線(xiàn)菌科鏈霉菌屬細(xì)菌引起的病害，病原菌種類(lèi)十 分復(fù) 雜，S.scabies[4-5]、S.galilaeus[6]、S.acidiscabies[7]、S.turgidiscabies[8]被認(rèn)為是我國(guó)瘡痂病較常見(jiàn)瘡痂病的病原菌，其中普通瘡痂病菌S scabies 最為普遍，近年來(lái)在我國(guó)大部分主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，部分地區(qū)發(fā)生率達(dá)到100%，嚴(yán)重影響我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了我國(guó)馬鈴薯主糧化大面積高效發(fā)展。

植物體表面普遍存在氣孔、水孔和皮孔等可為病原菌提供通道的自然孔口，這些孔口的數(shù)量、大小和結(jié)構(gòu)對(duì)植物對(duì)病原菌的抵抗能力具有重要影響。關(guān)于植物表皮皮孔與氣孔的研究已有很多報(bào)道，木薯葉片氣孔密度影響了細(xì)菌性枯萎病的發(fā)病程度[9]。氣孔的密度對(duì)植物的抗病性的影響在番茄白粉病等研究中也得到證實(shí)[10-11]。在馬鈴薯黑痣病的研究中發(fā)現(xiàn)，抗病品種的皮孔數(shù)明顯少于感病品種的皮孔數(shù)[12]。目前為止，僅有劉淑娜進(jìn)行了皮孔數(shù)量對(duì)瘡痂病抗性影響的研究，通過(guò)4 個(gè)品種研究表明，抗性水平較高的馬鈴薯品種的皮孔數(shù)量明顯少于感病品種，仍應(yīng)該繼續(xù)通過(guò)對(duì)更多的種質(zhì)資源的研究，進(jìn)一步明確皮孔數(shù)對(duì)瘡痂病抗性水平的影響[13]。

我國(guó)對(duì)馬鈴薯瘡痂病的研究較少，迄今為止，僅有宋志軍[14]、高同國(guó)[15]、何虎翼[16]、邢瑩瑩[17]、杜魏甫[18]等幾篇報(bào)道，僅對(duì)致病菌分離鑒定和抗源的鑒定方面以及病原菌的致病性進(jìn)行了研究，這些研究?jī)H鑒定出很少高抗性種質(zhì)資源，尚未鑒定出對(duì)瘡痂病免疫的種質(zhì)資源，不能滿(mǎn)足我國(guó)馬鈴薯的種植以及抗瘡痂病新品種選育的需求，我國(guó)馬鈴薯種質(zhì)資源的瘡痂病抗性鑒定工作有待進(jìn)一步加強(qiáng)。馬鈴薯瘡痂病的研究進(jìn)展相對(duì)緩慢，塊莖表型性狀對(duì)馬鈴薯瘡痂病抗性影響的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此，研究以113 份不同抗性水平的馬鈴薯種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料進(jìn)行盆栽接種鑒定，以期篩選出具有高水平瘡痂病抗性的種質(zhì)資源，同時(shí)對(duì)每個(gè)種質(zhì)資源的塊莖表型性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，初步探索馬鈴薯瘡痂病抗性與塊莖表型性狀之間的關(guān)系，有利于馬鈴薯瘡痂病的防治和抗病育種研究，旨為田間育種后代的快速選擇以及抗病基因的發(fā)掘奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：普通瘡痂病菌S.scabies 的KS28-2 菌株，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)馬鈴薯研究所保存提供，經(jīng)致病基因分子鑒定、蘿卜苗和馬鈴薯致病性鑒定，該菌株致病性最強(qiáng)，該病菌為黑龍江省馬鈴薯瘡痂病主要病菌之一[17]。

供試種質(zhì)資源：供試馬鈴薯種質(zhì)資源113 份，均來(lái)自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)馬鈴薯研究所（詳見(jiàn)表1）。

供試培養(yǎng)基：YME 培養(yǎng)基[17]：瓊脂粉20 g，麥芽浸提物10 g，酵母粉4 g，葡萄糖4 g，蒸餾水定容至1 000 mL，分裝于錐形瓶中后高壓蒸汽滅菌。

表1 供試馬鈴薯種質(zhì)資源詳表Table 1 Table of potato germplasm resources used for research

1.2 主要儀器

VS-1300U 型超凈工作臺(tái)，PQX-280A-12HM 型生化培養(yǎng)箱，MLS-3781L-PC 型全自動(dòng)高壓滅菌鍋，F(xiàn)A2004 型電子天平、DMS-653 顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板（求精醫(yī)用儀器廠(chǎng)）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 瘡痂病菌培養(yǎng)和接種體制備

在超凈工作臺(tái)中，將滅菌好的YME 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，用接種環(huán)挑取瘡痂病菌絲，在培養(yǎng)基上以劃線(xiàn)的方式接種。將接種好的YME 培養(yǎng)基放入28 ℃生化培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿平板時(shí)，向培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌蒸餾水，輕輕將菌絲從YME 培養(yǎng)基上輕輕洗下，制成孢子懸浮液。在顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板，對(duì)病原菌的孢子數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液的濃度調(diào)整到1×107cfu·ml-1，作為接種體[13]。

1.3.2 盆栽種植與接菌處理

播種前將種薯放在15～20 ℃的自然光下催芽10 d 左右，至芽長(zhǎng)0.5 cm 左右。將113 個(gè)馬鈴薯種質(zhì)資源于0.1%高錳酸鉀溶液中浸10～15 min，栽培基質(zhì)經(jīng)過(guò)121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min，采用盆栽種植于溫室內(nèi)，每個(gè)種質(zhì)資源種植4 盆，設(shè)置3 盆處理1 盆對(duì)照，待盆栽中的小薯大部分長(zhǎng)至直徑約2 cm 時(shí)，將濃度為1×107cfu·ml-1的孢子懸浮液，采用灌根的方法對(duì)盆栽進(jìn)行接種，每盆接入孢子懸浮液300 mL，對(duì)照組加入同等體積無(wú)菌蒸餾水。接種后按照正常的馬鈴薯盆栽管理的管理方法進(jìn)行。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 瘡痂指數(shù)平均值測(cè)定方法

瘡痂病的調(diào)查方法和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)完全按照劉淑娜[13]的方法進(jìn)行：每盆單獨(dú)收獲后，洗凈塊莖并晾干，計(jì)算出每個(gè)處理全部塊莖的病斑面積等級(jí)均值（MA）和病斑深度等級(jí)均值（MD），計(jì)算每個(gè)種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)平均值（MSI）：根據(jù)公式MSI=（MA×MD）×5，計(jì)算瘡痂指數(shù)平均值（MSI）。根據(jù)每個(gè)處理的瘡痂指數(shù)平均值（MSI），將馬鈴薯瘡痂病抗性等級(jí)劃分為5個(gè)等級(jí)：

高抗0＜MSI≤6

中抗6＜MSI≤15

感病15＜MSI≤22

高感22＜MSI≤30

重感MSI＞30

表2 病斑面積等級(jí)Table 2 Incidence degree of lesion area

表3 病斑深度等級(jí)Table 3 Incidence degree of lesion depth

1.4.2 薯型和芽眼深淺測(cè)定方法

根據(jù)馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程[19]將薯型分為圓形（以品種克新2 號(hào)為對(duì)照）、橢圓形（以品種克新4 號(hào)為對(duì)照）和長(zhǎng)形（以品種Spunta 為對(duì)照），將芽眼類(lèi)型由淺到深分為淺（以品種中薯3 號(hào)為對(duì)照）、中（以品種克新4 號(hào)為對(duì)照）和深（以品種花525 為對(duì)照）3 個(gè)類(lèi)型，分別調(diào)查記錄113 份種質(zhì)資源塊莖的形狀和芽眼類(lèi)型。

1.4.3 塊莖皮孔數(shù)測(cè)定方法

每個(gè)處理選擇3 個(gè)100 g 左右的健康馬鈴薯塊莖，用直徑為1 cm 的圓形打孔器，分別于馬鈴薯頭部、中部、尾部分別打孔2 次，分別記錄113 份種質(zhì)資源直徑1 cm 面積上塊莖表皮的皮孔個(gè)數(shù)，用于后續(xù)分析。

1.4.4 塊莖表皮光滑度測(cè)定方法

根據(jù)馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程[19]，在收獲當(dāng)日，隨機(jī)選取5 個(gè)健康塊莖，觀(guān)察表皮光滑程度，按照光滑（光滑，無(wú)網(wǎng)紋）、中（較光滑，有網(wǎng)紋）、粗糙（粗糙，重麻皮）三個(gè)等級(jí)，分別調(diào)查記錄113 份種質(zhì)資源塊莖的表皮光滑度。

1.4.5 塊莖表皮顏色測(cè)定方法

根據(jù)馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程[19]，在收獲當(dāng)日，未經(jīng)陽(yáng)光曬過(guò)，健康塊莖的表皮顏色，按最大相似原則，按照白色、黃色、紅色、紫色4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，分別調(diào)查記錄113 份種質(zhì)資源塊莖的表皮顏色。

1.4.6 薯肉顏色測(cè)定方法

根據(jù)馬鈴薯種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程[19]，采用1.4.4的材料，在正常光線(xiàn)條件下，切開(kāi)塊莖，觀(guān)察薯肉顏色，按最大相似性原則，將薯肉顏色分為白色、黃色、紅色、紫色4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，分別調(diào)查記錄113 份種質(zhì)資源塊莖的薯肉顏色。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003 和spss17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并分析作圖。

表5 馬鈴薯種質(zhì)資源塊莖瘡痂病抗性與部分表型性狀間的相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation coefficient between tuber common scab resistance and some phenotypic traits in potato germplasm resources

2 結(jié)果與分析

2.1 不同馬鈴薯種質(zhì)資源對(duì)瘡痂病的抗性評(píng)價(jià)

如表4 所示，全部供試種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)在2.50～39.04 范圍之間，平均瘡痂指數(shù)為14.23，其中瘡痂指數(shù)平均值最小品系為ND17-34-20，最大的為SASSY。不同種質(zhì)資源收獲的塊莖形成的病斑深度和病斑面積均有所不同。其中對(duì)瘡痂病表現(xiàn)高抗的種質(zhì)資源有7 份，高抗種質(zhì)資源占所有供試種質(zhì)資源的比例為6.19%，其平均瘡痂指數(shù)為4.13；表現(xiàn)中抗的種質(zhì)資源有67 份，中抗種質(zhì)資源占所有供試種質(zhì)資源的比例為59.29%，其平均瘡痂指數(shù)為10.72；感病的種質(zhì)資源為27 份，感病種質(zhì)資源占所有供試種質(zhì)資源的比例為23.89%，平均瘡痂指數(shù)為18.2；高感的種質(zhì)資源為6 份，高感種質(zhì)資源占所有供試種質(zhì)資源的比例為5.31%，平均瘡痂指數(shù)為23.55；重感的種質(zhì)資源為6 份，比例為5.31%，供試全部種質(zhì)資源的平均瘡痂指數(shù)為34.51。

表4 不同抗性等級(jí)的馬鈴薯種質(zhì)資源所占比例Table 4 Proportion of potato germplasm resources with different resistance levels

2.2 馬鈴薯瘡痂病抗性與塊莖部分表型性狀的關(guān)系

相關(guān)性分析表明，馬鈴薯種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)與其塊莖的表皮光滑度存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與其塊莖的芽眼類(lèi)型不具有直線(xiàn)相關(guān)關(guān)系；馬鈴薯瘡痂病抗性等級(jí)與其塊莖的薯型和芽眼類(lèi)型不存在顯著相關(guān)關(guān)系。

2.3 馬鈴薯瘡痂病抗性與塊莖表皮皮孔密度的關(guān)系

為分析馬鈴薯塊莖表皮的皮孔密度對(duì)瘡痂病指數(shù)的影響，對(duì)113 個(gè)馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖1 所示，結(jié)果表明，瘡痂病指數(shù)平均值隨著塊莖表皮皮孔密度的增加而增加。塊莖表皮皮孔密度與瘡痂指數(shù)平均值呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.585 5，回歸方程為y=1.827 4 x-1.579 7，說(shuō)明塊莖皮孔密度與瘡痂病抗性具有明顯的相關(guān)性，對(duì)馬鈴薯瘡痂病的抗性水平具有重要影響。

圖1 不同馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂病指數(shù)與皮孔密度的相關(guān)性Fig.1 Correlation between MSI in different resistant potato germplasm resources and tuber lenticels density

2.4 馬鈴薯塊莖表皮顏色和肉色對(duì)瘡痂指數(shù)的影響

根據(jù)圖2 可知，馬鈴薯種質(zhì)資源塊莖的肉質(zhì)顏色對(duì)瘡痂指數(shù)的影響具有顯著差異，紫色肉質(zhì)的馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂指數(shù)最大，為15.00，白色肉質(zhì)的馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂指數(shù)最小，為13.48，白色、紅色和黃色肉質(zhì)種質(zhì)資源之間的瘡痂指數(shù)沒(méi)有顯著差異，但顯著小于紫色肉質(zhì)的種質(zhì)資源；根據(jù)圖3 可知，紅色表皮和紫色表皮的馬鈴薯種質(zhì)資源塊莖瘡痂指數(shù)較小且沒(méi)有顯著差異，白色表皮塊莖的馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂指數(shù)最大，為17.05，說(shuō)明紅色和紫色塊莖表皮的馬鈴薯種質(zhì)資源對(duì)瘡痂病的抗性較高。

圖2 不同種質(zhì)資源塊莖肉質(zhì)顏色對(duì)瘡痂指數(shù)的影響Fig.2 Effects of tuber fleshy color on MSI in different germplasm resources

圖3 不同種質(zhì)資源塊莖表皮顏色對(duì)瘡痂指數(shù)的影響Fig.3 Effects of tuber skin color on MSI in different germplasm resources

3 討論

不同種質(zhì)資源對(duì)瘡痂病具有不用的抗性水平，在113 份種質(zhì)資源中，僅篩選ND17-34-20、ND17-12-12、ND17-4-7 和11-1-38 等7 份高抗種質(zhì)資源，占全部種質(zhì)資源的6%，宋志軍等[14]在20 份高世代馬鈴薯種質(zhì)資源中篩選得到2 份高抗類(lèi)型種質(zhì)資源，并指出可以通過(guò)SSR 遺傳相似性系數(shù)大致區(qū)分抗病類(lèi)型和感病類(lèi)型，何虎翼等[17]在36 份馬鈴薯種質(zhì)資源在田間自然瘡痂病圃中鑒定出2 份高抗種質(zhì)資源，目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)具有免疫瘡痂病菌特性的馬鈴薯種質(zhì)資源。由此可見(jiàn)，具有高水平瘡痂病抗性的種質(zhì)資源較難獲得，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)有保存種質(zhì)資源1 700 余份（不包括野生種和原始栽培種）[20]，因此目前被鑒定的種質(zhì)資源數(shù)量相對(duì)較少，仍需要加大力度對(duì)現(xiàn)有種質(zhì)資源加以利用和新種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)，優(yōu)異的抗病品種是提升馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的有力支撐。

在植物與病原菌的互作過(guò)程中，馬鈴薯塊莖表皮的皮孔是用于氣體交換的孔道，排列疏松得補(bǔ)充組織可以使病原菌相對(duì)容易的侵染植物[21]。研究表明，瘡痂指數(shù)與塊莖表皮單位面積皮孔數(shù)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明單位面積皮孔數(shù)量是影響馬鈴薯瘡痂病抗性的重要指標(biāo)之一。國(guó)外報(bào)道中指出，一些瘡痂病抗性較強(qiáng)的馬鈴薯種質(zhì)資源，塊莖表皮皮孔數(shù)具有較少的特點(diǎn)[22]，這與研究結(jié)論基本一致。研究?jī)H針對(duì)馬鈴薯塊莖表皮的皮孔密度與瘡痂病抗性的關(guān)系進(jìn)行了初步研究，但是在以往的研究中，植物皮孔大小、性狀以及組織結(jié)構(gòu)等特性同樣對(duì)植物的抗病性具有重要影響，因此以后將針對(duì)馬鈴薯皮孔特性繼續(xù)開(kāi)展更加系統(tǒng)的研究。

植物表皮是植物與外界直接接觸的最外層細(xì)胞，是植物避免生物危害的第一道屏障，在馬鈴薯黑痣病抗性影響結(jié)構(gòu)因素的研究中發(fā)現(xiàn)，菌絲容易侵染表皮粗糙，裂縫多且深的馬鈴薯塊莖[12]，在研究中，馬鈴薯塊莖同樣表現(xiàn)出表皮光滑的馬鈴薯種質(zhì)資源，瘡痂指數(shù)較小，繼而瘡痂病的抗性水平越高，抗病水平與表皮光滑程度存在顯著正相關(guān)關(guān)系。在馬鈴薯瘡痂病高發(fā)地區(qū)，可以?xún)?yōu)先選擇表皮光滑型品種，抗性水平較高的種質(zhì)資源的利用有利于降低馬鈴薯瘡痂病發(fā)生率與嚴(yán)重程度，防止因瘡痂病造成的馬鈴薯商品價(jià)值降低，降低馬鈴薯種植的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，塊莖表皮光滑程度可以作為評(píng)價(jià)瘡痂病抗性的一個(gè)重要指標(biāo)，可以對(duì)新培育的種質(zhì)資源進(jìn)行瘡痂病抗性綜合評(píng)價(jià)，對(duì)培育具有良好推廣價(jià)值的抗病新品種具有重要意義。

馬鈴薯塊莖是有匍匐莖尖端膨大形成的一個(gè)縮短而肥大的變態(tài)莖，因品種的不同，馬鈴薯塊莖表皮有白、黃、紫、褐、黑等不同顏色，塊莖肉質(zhì)也有白、黃、紅、紫色等之分，Waterer 通過(guò)嵌合體材料研究馬鈴薯塊莖顏色與瘡痂病抗性的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，紅色表皮具有更高的瘡痂病的抗性水平，認(rèn)為瘡痂病抗性基因與表皮顏色表達(dá)基因是連鎖的[23]，研究表明，紅色和紫色表皮的馬鈴薯種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)明顯小于黃色和白色表皮種質(zhì)資源，在皮色對(duì)瘡痂病抗性的影響上與前人產(chǎn)生了類(lèi)似的結(jié)論。紫色肉質(zhì)種質(zhì)資源的瘡痂指數(shù)明顯高于白、黃和紅色種質(zhì)資源，由于表皮顏色和肉質(zhì)顏色是由遺傳因素決定的，同時(shí)不同肉色馬鈴薯塊莖含有的酚類(lèi)物質(zhì)和抗氧化能力均具有明顯差異[24]，深入研究馬鈴薯塊莖瘡痂病的抗病影響因素，有利于揭示馬鈴薯瘡痂病的抗病機(jī)制，對(duì)瘡痂病的科學(xué)防治和理論研究具有重要意義。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)113 份馬鈴薯種質(zhì)資源的鑒定以及表皮皮孔數(shù)量、表皮光滑度和皮色肉色等表型性狀的初步研究，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯種質(zhì)資源瘡痂病抗性與塊莖表表型性狀具有較大的關(guān)聯(lián)性，可以為馬鈴薯抗瘡痂病育種提供一定的參考。寄主與病原菌相互作用是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，影響寄主抗病性的結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)還有很多，在以后的研究中可以適當(dāng)增加種質(zhì)資源的數(shù)量，對(duì)接種后的表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步完善馬鈴薯瘡痂病結(jié)構(gòu)特征以及生理生化與抗病性的關(guān)系，為馬鈴薯抗病育種提供科學(xué)依據(jù)。