王晶瑩，接傳紅，王影，張瑋瓊，段江南

血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障（inner blood-retinal barrier，iBRB）由中央視網(wǎng)膜毛細(xì)血管形成，具有發(fā)育良好的連接復(fù)合體，其中緊密連接（tight junctions，TJs）對(duì)保障視網(wǎng)膜微血管的獨(dú)特屏障發(fā)揮重要作用。生理?xiàng)l件下，iBRB 維持著神經(jīng)-視網(wǎng)膜微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，但各種危險(xiǎn)因素如高糖、炎癥、缺血缺氧、多種細(xì)胞因子等通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路及作用蛋白，誘發(fā)TJs 下調(diào)及磷酸化途徑，使細(xì)胞旁運(yùn)輸通道開放，破壞機(jī)體保護(hù)屏障功能的能力。內(nèi)皮細(xì)胞TJs 改變導(dǎo)致的iBRB 功能障礙參與了許多視網(wǎng)膜疾病的生理病理過(guò)程，尤其與合并黃斑水腫或視網(wǎng)膜新生血管性疾病密切相關(guān)，常見如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、年齡相關(guān)性黃斑變性等[1]。本文以視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞TJs 相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行綜述，為相關(guān)視網(wǎng)膜疾病研究提供理論依據(jù)。

1 TJs 的主要分子結(jié)構(gòu)

iBRB 是一種高選擇性屏障，主要由單層緊密粘附的內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和周圍的周細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，共同組成神經(jīng)血管單位的基本結(jié)構(gòu)單元[2]。TJs 作為一種多功能復(fù)合體，在iBRB 中形成了一個(gè)細(xì)胞旁擴(kuò)散屏障，起到限制水、離子、小分子溶質(zhì)以及阻止脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在頂端細(xì)胞和基底外側(cè)質(zhì)膜中運(yùn)動(dòng)等作用，同時(shí)TJs 蛋白在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，充當(dāng)信號(hào)中樞，影響細(xì)胞增殖、極性及基因表達(dá)[3-5]。

在內(nèi)皮細(xì)胞中，TJs 常與粘附連接混合在一起，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)有利于嚴(yán)格調(diào)控血管通透性，對(duì)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微環(huán)境、維持穩(wěn)態(tài)起到重要作用。從分子水平上，TJs 由40 多種蛋白質(zhì)組成，包括跨膜蛋白、胞漿蛋白。相鄰細(xì)胞間的跨膜蛋白通過(guò)胞外環(huán)相互結(jié)合形成“拉鏈”狀的“嵴線”結(jié)構(gòu)，以封閉細(xì)胞旁間隙，主要包括Occludin、Claudin 家族、連接粘附分子（junctional adhersion molecular，JAMs）、Tricellulin 等；胞漿蛋白則作為橋梁連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白，形成一個(gè)完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，共同協(xié)作調(diào)節(jié)屏障特性，主要包括閉鎖小帶蛋白ZOs 家族、扣帶素（cingulin）等，大部分胞漿蛋白含有PDZ 結(jié)構(gòu)域，將跨膜蛋白連接到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。此外，TJs 也包括其他具有信號(hào)功能的胞漿蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子、激酶和磷酸酶。

1.1 Claudin 家族

Claudin 家族是分子量為21～27 kDa 的蛋白質(zhì)家族，為TJs 蛋白中最重要的一組蛋白，具有4 次跨膜結(jié)構(gòu)，對(duì)維持TJs 的滲透性發(fā)揮關(guān)鍵作用。其含有2 個(gè)高度保守的細(xì)胞外環(huán)和1 個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)，第1 個(gè)細(xì)胞外環(huán)較長(zhǎng)，平均含有約53 個(gè)氨基酸，是細(xì)胞旁路孔道形成的基礎(chǔ)，能夠調(diào)控陰離子和陽(yáng)離子，影響跨上皮電阻（transepithelial electrical resistance，TEER)和細(xì)胞旁路電荷的選擇性；第2 個(gè)細(xì)胞外環(huán)稍短，平均含有約24 個(gè)氨基酸，主要起支撐作用，加強(qiáng)TJs 之間的連接，使細(xì)胞旁路的縫隙更為緊密[6-7]。大部分的Claudin 家族成員在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有N-末端和C-末端，其中C-末端含有PDZ 結(jié)構(gòu)模體，可與包含PDZ 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白如ZO-1、ZO-2、ZO-3相結(jié)合，ZOs 蛋白通過(guò)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連，使得TJs 蛋白與細(xì)胞內(nèi)骨架形成穩(wěn)定系統(tǒng)，為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)提供了結(jié)構(gòu)保障[8]。

1.2 Occludin

Occludin 分子量為60～65 kDa，是首個(gè)發(fā)現(xiàn)的TJs 跨膜蛋白，具有4 次跨膜結(jié)構(gòu)，廣泛表達(dá)于上皮和內(nèi)皮組織。Occludin 含有2 個(gè)較大的細(xì)胞外環(huán)，富含絡(luò)氨酸、甘氨酸和氨基酸殘基，研究[9-10]表明，第2 細(xì)胞外環(huán)對(duì)Occludin 蛋白穩(wěn)定地組裝進(jìn)TJs 結(jié)構(gòu)是必不可少的；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有1 個(gè)短的N-末端和1 個(gè)長(zhǎng)的C-末端，同樣，C-末端通過(guò)與ZOs 蛋白相互作用參與調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性。同時(shí)，Occludin 的磷酸化可以調(diào)節(jié)其自身定位分布，以及TJs 通透性，升高TEER，增強(qiáng)屏障功能[11]。有研究[12]表明，敲除Occludin 蛋白基因的小鼠體內(nèi)腸道和膀胱上皮的細(xì)胞旁通透性及TJs 結(jié)構(gòu)均未見異常，提示Occludin 蛋白可能不是構(gòu)成TJs 復(fù)合物的必需蛋白，但值得注意的是，這些小鼠在組織形態(tài)學(xué)上仍出現(xiàn)諸多異常，如生長(zhǎng)阻滯、胃黏膜上皮細(xì)胞慢性炎癥和增生、睪丸肥大等病理表現(xiàn)。

1.3 JAMs

JAMs 屬于免疫球蛋白家族，包括JAM-A、JAM-B 和JAMC，分子量約為40kDa。JAMs 是一種單跨膜蛋白，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有1 個(gè)C-末端結(jié)構(gòu)，其尾部含有PDZ 結(jié)合基序，可與ZOs 蛋白的第3 個(gè)PDZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合[13]；細(xì)胞外基質(zhì)中含有1 個(gè)N-末端，N 端有2 個(gè)IgG 結(jié)構(gòu)，它們參與細(xì)胞間的粘附和連接裝配[14-15]。

1.4 Tricellulin

TJs 通常被認(rèn)為是包圍單個(gè)細(xì)胞并封閉兩個(gè)相鄰細(xì)胞之間的細(xì)胞間隙結(jié)構(gòu)，然而TJs 中也存在3 個(gè)細(xì)胞聚集的結(jié)構(gòu)，同樣對(duì)細(xì)胞間隙起封閉作用。Tricellulin 是一種分子量為64 kDa的跨膜蛋白，是第1 個(gè)被鑒定出位于3 個(gè)相鄰細(xì)胞連接處的TJs 蛋白。Tricellulin 具有4 次跨膜結(jié)構(gòu)，N-端和C-端位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其中C-端結(jié)構(gòu)被證明有130 個(gè)氨基酸殘基與Occludin一致，推測(cè)Tricellulin 也可受磷酸化的調(diào)節(jié)[16]。研究[17-19]發(fā)現(xiàn)，Tricellun 基因敲除可干擾緊密連接組裝，而Tricellun 的過(guò)度表達(dá)可增強(qiáng)屏障功能，尤其在調(diào)控大分子物質(zhì)經(jīng)旁細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)及維持TJs 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。

1.5 ZOs

ZOs 屬于膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族的細(xì)胞質(zhì)蛋白，包括ZO-1、ZO-2 和ZO-3。ZOs 包含重要的PDZ 結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)與跨膜蛋白Claudins、Occludin 以及JAMs 等的聯(lián)系，在細(xì)胞內(nèi)又同細(xì)胞骨架蛋白以及一些核酸結(jié)合蛋白相互作用，作為連接TJs 鏈與細(xì)胞骨架的支架，形成完整的TJs 復(fù)合體[20]。此外，ZOs 在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖方面發(fā)揮作用。因此，ZOs 作為TJs 中不可缺少的結(jié)構(gòu)成分，在與基因表達(dá)和細(xì)胞行為相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中至關(guān)重要。

1.6 cingulin

cingulin 與ZOs 一樣為細(xì)胞質(zhì)蛋白，分子量為140 kDa，其N-端與ZOs 蛋白及細(xì)胞骨架蛋白纖維形肌動(dòng)蛋白（fibrous actin，F(xiàn)-Actin）相結(jié)合，發(fā)揮著連接細(xì)胞骨架與胞漿蛋白的作用。Klaudia 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中cingulin 的過(guò)表達(dá)可增加TJs 鏈的長(zhǎng)度和跨內(nèi)皮細(xì)胞的電阻值，并降低分子量為376 Da 和70,000 Da 熒光示蹤分子的通透性；而在敲低cingulin 的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中，低分子量熒光示蹤分子的通透性顯著增加，這提示cingulin 可經(jīng)促進(jìn)TJs 的形成進(jìn)而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的旁細(xì)胞屏障功能。此外，cingulin 可在腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的作用下發(fā)生磷酸化，進(jìn)而增強(qiáng)TJs 和細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)的結(jié)合性[22]。

2 調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞TJs 的常見信號(hào)通路

參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的信號(hào)通路十分復(fù)雜，其中蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、Rho、磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路在影響TJs 結(jié)構(gòu)及功能中扮演著重要的角色，不同作用途徑之間既相互獨(dú)立又互為關(guān)聯(lián)，對(duì)保護(hù)iBRB 完整性具有十分重要的意義。

2.1 PKC 通路

PKC 家族包括12 個(gè)已知同工酶，可分為3 個(gè)亞種：常規(guī)（α、βI、βII 和γ）、新型（δ、ε、η、μ、θ）和非典型（ζ 和ι），屬于AGC 激酶家族。PKC 是目前公認(rèn)的多種生理病理過(guò)程中信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可通過(guò)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等刺激因子發(fā)揮信號(hào)調(diào)節(jié)作用[23]，控制細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞過(guò)程，參與調(diào)節(jié)上皮和內(nèi)皮屏障，尤其與血管內(nèi)皮屏障功能密切相關(guān)，既可以通過(guò)直接磷酸化TJs 蛋白，也可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)的途徑破壞細(xì)胞間TJs 的結(jié)構(gòu)和功能，引起血管通透性增加。異常的PKC 活性導(dǎo)致多種疾病，最密切的為腫瘤、神經(jīng)退行性病變和糖尿病[24]。在視網(wǎng)膜血管疾病中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-PKC 通路活化可導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞TJs 破壞，血管通透性增高，引起黃斑水腫，非典型PKC 抑制劑可阻止VEGF 誘導(dǎo)的Occludin 和ZO-1 磷酸化及降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性[25]；Aveleira 等[26]證實(shí)，在牛視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中，TNF-α 可通過(guò)PKCζ/NF-κB 信號(hào)通路降低ZO-1 和Claudin-5的表達(dá)并增加細(xì)胞旁通透性。因此，PKC 信號(hào)通路常作為血視網(wǎng)膜屏障及TJs 的作用靶點(diǎn)，對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮通透性的研究和治療具有十分重要的意義。

2.2 Rho 通路

Rho 家族是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中一類重要蛋白，屬于小GTP 結(jié)合蛋白R(shí)as 超家族中一員，主要包括RhoA、Racl 和Cdc42 共3 種最具特征的Rho-GTP 酶，它們可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間TJs 的完整性來(lái)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控，其中RhoA 的研究最為廣泛、深入，是最早報(bào)道的與血管內(nèi)皮屏障相關(guān)的Rho-GTP 酶。當(dāng)RhoA 激活后可作用于下游效應(yīng)器Rho 激酶（Rho associated kinase，ROCK），使其磷酸化而激活，后者可直接介導(dǎo)TJs 蛋白的重新分布，開放血管內(nèi)皮屏障[27]；也可以通過(guò)介導(dǎo)肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）失活，提高和維持肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）的磷酸化水平，增加肌動(dòng)球蛋白聚集和解聚過(guò)程，使細(xì)胞骨架收縮，進(jìn)一步改變TJs 結(jié)構(gòu)。在平滑肌和非肌細(xì)胞中，ROCK 還能直接磷酸化MLC 刺激肌球蛋白收縮，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能[28]。此外，在內(nèi)皮屏障功能障礙的惡化過(guò)程中，ROCK 還可激活核因子κB (nuclear factor kappa，NF-κB)，上調(diào)腫瘤干擾因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)表達(dá)，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6 和IL-8 等分泌，參與自身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)。在炎癥因子激動(dòng)下，內(nèi)皮細(xì)胞可組成大量的Factin 應(yīng)力微絲，重組肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，通過(guò)提高向心應(yīng)力及改變細(xì)胞形態(tài)，直接引起內(nèi)皮通透性，也可以經(jīng)由影響細(xì)胞間緊密連接蛋白的分布情況，進(jìn)一步惡化內(nèi)皮細(xì)胞通透性[29]。因此，RhoA/ROCK1 作為經(jīng)典的調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排及緊密連接蛋白功能的信號(hào)通路，對(duì)血視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化起到重要調(diào)控作用。

2.3 P13K/Akt 通路

PI3K 是一個(gè)激酶家族，在幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均有表達(dá)，Akt 是其下游研究最多的效應(yīng)分子，PI3K/Akt 信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、增殖及血管生成、葡萄糖代謝等多種生理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。PI3K 是由1 個(gè)催化亞基（p110）和1 個(gè)調(diào)節(jié)亞基（p85）組成的異源二聚體，該類激酶可將磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（P1P2）轉(zhuǎn)化為胞質(zhì)膜內(nèi)小葉中的第二信使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（P1P3），P1P3 可導(dǎo)致Akt 從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，Akt 在Thr308 和Ser473 分別被磷酸肌醇依賴性蛋白激酶（PDK1 和PDK2）磷酸化后被激活。激活后的Akt 主要通過(guò)其下游成分包括糖原合成酶激酶（GSK-3β）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和snail 參與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的降解，抑制Occludin 和Claudins 的轉(zhuǎn)錄，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞TJs 功能。Sardarpasha 等[30]發(fā)現(xiàn)，在豬視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中，色素上皮源性因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）可通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生及增加ZO-1 表達(dá)以減少內(nèi)屏障滲透作用。黃萍等[31]在鉛損傷血視網(wǎng)膜屏障的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)PI3K/Akt 通路抑制劑Wortmannin 可以提高Occludin 和Claudin-5 的表達(dá)水平，顯著降低視網(wǎng)膜組織內(nèi)p-Akt(Ser473)的磷酸化水平，從而參與iBRB 通透性保護(hù)。因此，PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TJs 的組裝和拆卸，但可能是由于不同作用藥物刺激及不同信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)串?dāng)_所致，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

2.4 MAPK 通路

MAPK 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，屬于CMGC（CDK/MAPK/GSK3/CLK）激酶組，包括細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶1/2（ERK1/2）、p38、c-Jun N 末端激酶（JNK）和ERK5。主要負(fù)責(zé)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子和外界應(yīng)激信號(hào)作出反應(yīng)，對(duì)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生起著重要調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)、有絲分裂、分化和凋亡。MAPK 信號(hào)通路組成為保守的三級(jí)激酶模式，通過(guò)MAPK 激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK 依次磷酸化將上游信號(hào)傳遞至下游答應(yīng)分子。MAPK 可通過(guò)調(diào)節(jié)TJs 以保護(hù)內(nèi)皮屏障功能，其作用機(jī)制主要通過(guò)如NF-κB、Snail1、p53 等核蛋白及轉(zhuǎn)錄因子，以及如VEGF、TLR、MLC2 等其他信號(hào)的串?dāng)_。如Tetsuo Adachi 等[32]研究表明，在人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中，應(yīng)用p38MAPK 抑制劑可顯著抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的Claudin-5 下調(diào)、TEER 降低和FITC-葡聚糖滲漏。Leal 等[33]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，羥苯磺酸鈣可通過(guò)抑制MAPK/NF-κB 信號(hào)以恢復(fù)VEGF 導(dǎo)致的視網(wǎng)膜內(nèi)皮Claudin-5、ZO-1 和Occludin 的水平以及減少白細(xì)胞粘附來(lái)預(yù)防iBRB 結(jié)構(gòu)及功能的破壞。因此，MAPK 信號(hào)通路與內(nèi)皮細(xì)胞TJs 的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

3 小結(jié)

iBRB 對(duì)于維持正?；虿±頎顟B(tài)下神經(jīng)視網(wǎng)膜的完整性至關(guān)重要，其喪失是許多視網(wǎng)膜疾病的病理基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但由于iBRB 的存在，使得目前市場(chǎng)上許多臨床用藥無(wú)法進(jìn)入視網(wǎng)膜，因此，研究人員越來(lái)越重視通過(guò)調(diào)節(jié)TJs 進(jìn)行治療性干預(yù)以解決這一問(wèn)題[34-35]。目前，對(duì)構(gòu)成iBRB 中TJs 的分子病理學(xué)機(jī)制和屏障功能改變研究日益深入，但調(diào)節(jié)血視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞TJs 的相關(guān)信號(hào)通路在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用和多種信號(hào)途徑的協(xié)作機(jī)制仍亟待進(jìn)一步深入研究，這將有利于為相關(guān)視網(wǎng)膜疾病恢復(fù)iBRB 結(jié)構(gòu)功能和保護(hù)視力提供理論依據(jù)和靶向治療方案。