韋 婉綜述， 李國忠審校

缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke)是一類高發(fā)病率和高死亡率的急性腦血管病，每年在全球范圍內(nèi)導(dǎo)致約70萬人死亡或殘疾[1]，嚴(yán)重威脅人類的身體健康和生活質(zhì)量。缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包含基因與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。目前溶栓是治療缺血性卒中的有效手段，但不可避免會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞再灌注損傷，因此靶向調(diào)控缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物，對于缺血性腦卒中的治療十分關(guān)鍵。

H19基因?yàn)槟赶当磉_(dá)的父系印跡基因，位于人類11號染色體p15.5位置，具有高度保守性和同源性[2]。在RNA聚合酶II的催化作用下，H19基因可轉(zhuǎn)錄生成長鏈非編碼RNA H19(long noncoding RNA-H19，LncRNA-H19)，LncRNA-H19是最早發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA之一[3]，其在胚胎發(fā)育期呈現(xiàn)出高表達(dá)，而出生后，在大多數(shù)組織中的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)[4]。據(jù)報(bào)道，LncRNA-H19在產(chǎn)后的異常表達(dá)與膀胱癌、胃癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等腫瘤有關(guān)[5～7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-H19在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[8]和小鼠頸動(dòng)脈損傷后的血管平滑肌細(xì)胞[9]中存在異常表達(dá)；缺氧狀態(tài)下也異常表達(dá)，可刺激腦部發(fā)生缺血再灌注(Ischemia and Reperfusion，I/R)損傷[10]。這表明LncRNA-H19參與到缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程，本文針對LncRNA-H19在缺血性腦卒中中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 LncRNA-H19通過DUSP5-ERK1 / 2軸激活自噬

缺氧是腦缺血再灌注(I/R)損傷的主要原因，可通過激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α來刺激LncRNA-H19的表達(dá)[10]。Wang等設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[11]，LncRNA-H19 在大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注(Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion，MCAO/R)小鼠和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y氧糖剝奪/再復(fù)氧(Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation，OGD/R)模型中表達(dá)均升高，用LncRNA-H19 siRNA 和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤分別抑制LncRNA-H19 和自噬作用后均可減少凋亡細(xì)胞百分比，增加細(xì)胞活力，并抑制神經(jīng)元OGD/R后自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ和Beclin 1 的表達(dá)上調(diào)和泛素結(jié)合蛋白p62的表達(dá)下調(diào)，說明LncRNA-H19 是通過激活自噬小體形成而促進(jìn)自噬；當(dāng)LncRNA-H19 siRNA 和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素合用時(shí)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平與單獨(dú)應(yīng)用LncRNA-H19 siRNA時(shí)變化趨勢相反，說明OGD/R條件下抑制LncRNA-H19是通過抑制自噬過程發(fā)揮增加細(xì)胞活力的作用；已知雙特異性蛋白磷酸酶5(Dual Specificity Protein Phosphatase5，DUSP5)的上調(diào)會(huì)抑制ERK1 / 2而誘導(dǎo)自噬抑制[12]，在實(shí)驗(yàn)中LncRNA-H19 siRNA可以上調(diào)DUSP5的表達(dá)并抑制p-ERK1/2，而DUSP5 siRNA可逆轉(zhuǎn)LncRNA-H19 siRNA對細(xì)胞的保護(hù)作用及對p-ERK1/2的抑制，說明LncRNA-H19 siRNA通過上調(diào)DUSP5的表達(dá)發(fā)揮抑制自噬的作用；同時(shí)，LncRNA-H19 siRNA會(huì)減低p-ERK1/2蛋白的表達(dá)而在此基礎(chǔ)上應(yīng)用DUSP5 siRNA可逆轉(zhuǎn)以上作用，由此證實(shí)了OGD/R條件下LncRNA-H19通過抑制DUSP5的表達(dá)增加ERK1/2的磷酸化以增加其激活，從而激活自噬過程。

2 LncRNA-H19通過驅(qū)動(dòng)組蛋白去乙酰化酶1依賴的M1小膠質(zhì)細(xì)胞極化促進(jìn)缺血性腦卒中的神經(jīng)炎癥發(fā)生

為了解缺血性腦卒中神經(jīng)炎癥的發(fā)生機(jī)制，Wang等[13]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者血中LncRNA-H19表達(dá)明顯上調(diào)，且與NIHSS評分和TNF-α的水平呈正相關(guān)，LncRNA-H19表達(dá)上調(diào)同樣存在于MCAO處理后的小鼠的腦組織、血漿及白細(xì)胞；MCAO鼠側(cè)腦室內(nèi)注射LncRNA-H19 siRNA可顯著降低卒中后24 h的腦梗死體積和腦水腫，降低了腦和血漿TNF-α及腦白細(xì)胞介素-1β水平，同時(shí)增長了腦轉(zhuǎn)化生長因子-β和血漿白細(xì)胞介素-10的濃度，并減輕卒中后14 d的腦組織損失和神經(jīng)功能缺損?；谑笮∧z質(zhì)細(xì)胞(BV2)的實(shí)驗(yàn)顯示，LncRNA-H19 siRNA的應(yīng)用可明顯逆轉(zhuǎn)OGD/R導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞活力的減低，并減少OGD/R誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α釋放，降低小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型標(biāo)志物CD11b和CD16的產(chǎn)生，并增加M2表型標(biāo)志物Ang-1和CD206的表達(dá)，說明OGD/R誘導(dǎo)的LncRNA-H19表達(dá)可使小膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)OGD/R可明顯上調(diào)組蛋白脫乙酰酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)的表達(dá)并減低組蛋白H3、H4的乙酰化水平，LncRNA-H19 siRNA的應(yīng)用可使上述作用消失。通過HDAC1 cDNA與LncRNA-H19 siRNA共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)HDAC1的過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)LncRNA-H19 siRNA增加細(xì)胞活力、減少TNF-α的釋放、下調(diào)CD11b、上調(diào)CD206及組蛋白H3、H4乙?；降淖饔?，說明LncRNA-H19敲低通過下調(diào)HDAC1驅(qū)動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞的M1到M2表型轉(zhuǎn)化，抑制神經(jīng)炎癥發(fā)生，即LncRNA-H19通過驅(qū)動(dòng)組蛋白去乙?；?依賴的M1小膠質(zhì)細(xì)胞極化促進(jìn)缺血性腦卒中的神經(jīng)炎癥發(fā)生。

3 LncRNA-H19可通過上調(diào)酸性磷酸酶5的表達(dá)增加動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)

據(jù)報(bào)道，動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的主要原因[14]，酸性磷酸酶可以通過促進(jìn)脂質(zhì)合成而增加動(dòng)脈粥樣硬化和卒中的風(fēng)險(xiǎn)[15]，Huang等[16]實(shí)驗(yàn)證明，大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者循環(huán)血中LncRNA-H19和酸性磷酸酶5(Acid Phosphatase 5，ACP5)表達(dá)顯著增加，使用慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)表達(dá)的ACP5，并建立缺血性腦卒中小鼠模型，發(fā)現(xiàn)ACP5是LncRNA-H19的直接作用靶點(diǎn)，慢病毒介導(dǎo)的LncRNA-H19上調(diào)了ACP5的表達(dá)，促進(jìn)VSMC和HUVEC增殖并抑制其凋亡，同時(shí)動(dòng)脈硬化斑塊大小較對照組增大。綜合以上，LncRNA-H19通過對ACP5蛋白的正向調(diào)控作用誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，增加缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

4 LncRNA-H19通過p53 / Notch1途徑阻止缺血性腦卒中的神經(jīng)發(fā)生

Notch通路與卒中后的神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)，Notch1通過激活其下游信號分子來調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的形狀，從而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[17]；p53可以調(diào)節(jié)Notch1的轉(zhuǎn)錄[18]；在胃癌，肝癌和間充質(zhì)干細(xì)胞中，LncRNA-H19的上調(diào)可抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性[19～22]，故Wang等作出假設(shè)：缺血誘導(dǎo)的LncRNA-H19過表達(dá)降低了p53的活性從而減弱Notch1的轉(zhuǎn)錄，抑制了神經(jīng)發(fā)生過程[23]。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，向缺血小鼠模型的側(cè)腦室注射LncRNA-H19 siRNA可增加卒中發(fā)生后7 d和14 d的BrdU(增殖細(xì)胞標(biāo)志物)和DCX(神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)志物)的免疫熒光密度，而在敲除LncRNA-H19的基礎(chǔ)上抑制p53則會(huì)降低BrdU和DCX的免疫熒光密度，消除了卒中發(fā)生后7 d和14 d時(shí)LncRNA-H19 siRNA的促神經(jīng)生成作用；RT-PCR技術(shù)證實(shí)敲除LncRNA-H19可以顯著上調(diào)p53靶基因bax和cdkn1a的轉(zhuǎn)錄水平，即LncRNA-H19的過表達(dá)在卒中時(shí)抑制p53的轉(zhuǎn)錄；Western Blot分析結(jié)果顯示LncRNA-H19的敲低可以增加p-p53(p53活化狀態(tài))的水平，而同時(shí)抑制p53活化和LncRNA-H19表達(dá)，則抵消了抑制LncRNA-H19對p-p53的作用；此外，抑制LncRNA-H19后Notch1表達(dá)上調(diào)，而在敲除LncRNA-H19的基礎(chǔ)上抑制p53后Notch1表達(dá)減弱，p53抑制劑可明顯降低p-p53的表達(dá)，在p53抑制的情況下Notch1的表達(dá)明顯減弱。結(jié)合以上，研究證實(shí)了LncRNA-H19通過減弱p53的轉(zhuǎn)錄活性并最終降低Notch1的表達(dá)來阻止缺血性腦卒中后的神經(jīng)發(fā)生。

5 LncRNA- H19-miR-19a-ID2軸可誘導(dǎo)缺氧缺血引起的神經(jīng)元損傷

根據(jù)既往實(shí)驗(yàn)報(bào)道，上調(diào)的LncRNA-H19通過增加DNA結(jié)合抑制因子2(inhibitor of DNA binding 2，ID2)的表達(dá)來促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖[24]；在急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中LncRNA-H19能夠與ID2競爭性結(jié)合miR-19a/b來調(diào)節(jié)ID2的表達(dá)[25]；ID2已被證明可在缺血缺氧條件下誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[26，27]，以此為基礎(chǔ)Xiao等設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)[28]，首次在缺氧缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過程中確定了LncRNA-H19-miR-19a-ID2軸的存在。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者發(fā)病后3 h內(nèi)外周血LncRNA-H19水平明顯增高，且與患者NIHSS得分呈正相關(guān)；在MCAO/R大鼠的缺血半暗帶以及氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD)神經(jīng)元細(xì)胞中LncRNA-H19表達(dá)水平均升高，且ID2 mRNA在OGD神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)有相似的趨勢；向MCAO/R鼠的腦室內(nèi)注射LncRNA-H19 siRNA，可減少卒中后72 h的腦梗死體積并減輕鼠的神經(jīng)功能缺損，同時(shí)半暗帶區(qū)域TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少；敲除OGD神經(jīng)元細(xì)胞中的LncRNA-H19，可降低ID2表達(dá)并減弱神經(jīng)元凋亡，同時(shí)miR-19a水平顯著升高；通過雙重?zé)晒馑孛笢y定、RIP和下拉實(shí)驗(yàn)，證明了miR-19a可競爭性地直接與LncRNA-H19和ID2 mRNA 3’-UTR結(jié)合，從而對ID2表達(dá)產(chǎn)生直接抑制作用。即缺氧缺血環(huán)境可誘導(dǎo)LncRNA-H19表達(dá)上調(diào)，競爭性地與游離的miR-19a結(jié)合增多，致使miR-19a與ID2 mRNA的結(jié)合減弱，進(jìn)而ID2表達(dá)水平增高，最終誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷凋亡。

綜上所述，LncRNA-H19以多種機(jī)制參與到缺血性腦卒中的病理過程，包括炎癥反應(yīng)、凋亡及自噬過程、動(dòng)脈硬化、神經(jīng)發(fā)生等，對缺血性腦卒中的診斷及預(yù)后具有較高生物學(xué)價(jià)值，有望成為新的治療靶點(diǎn)。在未來的實(shí)驗(yàn)中，我們?nèi)孕鑼ncRNA-H19參與卒中的復(fù)雜機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，為缺血性腦卒中的治療提供一個(gè)更加明確的方向。