霍佳歡 李雙民 溫曉蕾 馮麗娜 李雅麗 張娜娜 蘭淑慧 齊慧霞

摘要：菌核青霉菌（Penicillium sclerotiorum）是板栗儲(chǔ)藏期引起栗仁腐爛的主要致病菌之一。為明確該病菌生長及產(chǎn)孢的適宜環(huán)境條件，本試驗(yàn)采用生長速率法和血球計(jì)數(shù)法對(duì)不同營養(yǎng)、溫度、pH值、通氣狀況等條件下病菌的生長情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，最適宜栗仁菌核青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的溫度為25 ℃，pH值為6，光照條件為全黑暗;沙堡弱培養(yǎng)基最適合該病菌菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基最適合產(chǎn)孢;菌核青霉菌在以木糖醇為基礎(chǔ)碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大、產(chǎn)孢量最多;菌絲生長的最佳氮源為牛肉膏，產(chǎn)孢量最多的氮源為蛋白胨和酵母浸粉;菌絲體在24 h連續(xù)振蕩的條件下生長的最好;50 ℃為菌核青霉菌致死溫度。

關(guān)鍵詞：板栗;栗仁腐爛病;菌核青霉菌;培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)： S436.64? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）23-0129-04

收稿日期：2021-03-25

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2020YFD1000700）;河北省教育廳平臺(tái)項(xiàng)目（河北省板栗產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，2019—2023年）。

作者簡介：霍佳歡（1997—），女，河北廊坊人，碩士研究生，研究方向?yàn)榘謇醪『α餍信c防控，E-mail：2469634717@qq.com;共同第一作者：李雙民（1968—），男，河北昌黎人，中學(xué)高級(jí)教師，研究方向?yàn)楣麡洳∠x害防治，E-mail：lishuangmin2021@163.com。

通信作者：溫曉蕾，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué)，E-mail：xiaoleiwen@sina.com;齊慧霞，碩士，教授，研究方向?yàn)橹参锊『α餍信c防控，E-mail：qihuix@163.com。

栗仁腐爛病是板栗生產(chǎn)上的常見病害之一，在南北方各板栗產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，近年來因板栗產(chǎn)量的大幅度提高，栗仁腐爛率也隨之增加，危害率高達(dá)40%～50%，嚴(yán)重制約著板栗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。栗仁腐爛病常發(fā)生于貯藏期間，多由病原微生物引起，常見的有鐮刀菌屬、鏈格菌屬、單端孢屬、青霉屬以及曲霉屬等[3]，其中青霉屬在全國各板栗產(chǎn)區(qū)均可危害，造成栗仁發(fā)生青腐，產(chǎn)生褐色或青色的病斑，后期轉(zhuǎn)為藍(lán)綠色或青綠色[4]。目前板栗上已報(bào)道的青霉種類有小刺青霉、擴(kuò)展青霉以及擬青霉等[5-7]，而對(duì)菌核青霉的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)對(duì)引起貯藏期栗仁腐爛的菌核青霉菌其適宜培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，以期為制定有效的防腐保鮮措施提供科學(xué)依據(jù)，減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2019—2020年在河北科技師范學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室開展。栗仁菌核青霉菌（Penicillium sclerotiorum）由河北科技師范學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基對(duì)菌核青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 在無菌超凈臺(tái)內(nèi)，將直徑5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅分別接種到玉米粉、胡蘿卜、番茄、沙堡弱、燕麥馬鈴薯、綠豆、肉汁胨、板栗培養(yǎng)基平板中央，每種培養(yǎng)基各設(shè)3個(gè)重復(fù)，均于25 ℃全黑暗條件下培養(yǎng)。每間隔24 h采用十字交叉法[8]測(cè)量菌落直徑，菌落生長14 d時(shí)采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子數(shù)量[9]。

1.2.2 溫度對(duì)菌核青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 超凈臺(tái)內(nèi)將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于馬鈴薯葡萄球瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中央，分別放置于5、10、15、20、25、30、35 ℃全黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)溫度均設(shè)3次重復(fù)，菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3 光照對(duì)菌核青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 超凈臺(tái)內(nèi)將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于PDA平板中央，設(shè)置不同光照（24 h光照、12 h 光照/黑暗、24 h黑暗）條件，25 ℃下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.4 不同pH值對(duì)菌核青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值，制成pH值為5、6、7、8、9、10、11的7種不同培養(yǎng)基，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于PDA平板中央，在25 ℃全黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每種pH值設(shè)3次重復(fù)，菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.5 碳源對(duì)菌核青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 將察氏培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的肌醇、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖醇和乳糖替換察氏培養(yǎng)基中的蔗糖[10]，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于平板中央，每種碳源設(shè)3個(gè)重復(fù)，25 ℃全黑暗條件下培養(yǎng)。菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.6 氮源對(duì)菌核青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的影響 基礎(chǔ)培養(yǎng)基同上，以等量的牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母浸粉和氯化銨替換察氏培養(yǎng)基中硝酸鈉[10]，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于平板中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，25 ℃黑暗下培養(yǎng)。菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)量方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.7 通氣狀況對(duì)菌絲生長的影響 將液體PDA培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，每瓶100 mL，將3個(gè)直徑為0.5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅在超凈臺(tái)內(nèi)接種到三角瓶內(nèi)，在溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min搖床內(nèi)分別24 h振蕩、12 h振蕩/12 h靜止、24 h靜止培養(yǎng) 5 d，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。5 d以后，將菌絲通過紗布過濾，用烘箱烘干（直到不含有任何水分），稱量菌絲干質(zhì)量[11]。

1.2.8 致死溫度的測(cè)定 菌核青霉菌生長初期，未產(chǎn)孢之前（2 d以內(nèi)）轉(zhuǎn)入裝有5 mL無菌水的試管中，每個(gè)處理標(biāo)好編號(hào)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將各試管按照不同編號(hào)依次放入40、45、50、55、60、65 ℃水浴鍋中，水浴10 min，然后將處理后的菌餅接種到PDA培養(yǎng)平板中央。25 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌絲生長情況，明確致死溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)菌核青霉菌菌絲生長、產(chǎn)孢的影響

由表1可知，栗仁菌核青霉菌在8種培養(yǎng)基上均可生長，最適合菌核青霉菌生長的培養(yǎng)基為沙堡弱培養(yǎng)基，14 d菌落直徑達(dá)7.95 cm;其次為板栗培養(yǎng)基，菌落直徑可達(dá)6.98 cm。適宜菌核青霉菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d產(chǎn)孢量可達(dá)6.99×105個(gè)/皿。表明沙堡弱培養(yǎng)基最適合菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基最適合產(chǎn)孢。

2.2 溫度對(duì)菌核青霉菌菌絲生長、產(chǎn)孢的影響

由表2可知，溫度對(duì)病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量均有顯著影響，栗仁菌核青霉菌在10～30 ℃條件下均能生長，最佳的生長溫度范圍在20～30 ℃，其中在25 ℃條件下菌落生長最好，14 d時(shí)菌落直徑可達(dá)到6.33 cm;同時(shí)25 ℃也最適合產(chǎn)孢，14 d時(shí)產(chǎn)孢量為3.76×105個(gè)/皿。溫度低于5 ℃或高于35 ℃時(shí)菌落生長十分緩慢，略有菌絲產(chǎn)生。

2.3 光照對(duì)菌核青霉菌菌絲生長、產(chǎn)孢的影響

由表3可知，在3種不同光照條件下，栗仁菌核青霉菌以全黑暗條件下生長最快，14 d時(shí)菌落直徑達(dá)6.8 cm。24 h光照和12 h光照/黑暗條件下菌落直徑相對(duì)較小，分別為6.02 cm和5.83 cm，且這2處理對(duì)菌核青霉菌菌絲生長的影響無顯著差異。全黑暗、全光照和12 h光照/黑暗3個(gè)處理對(duì)菌核青霉菌產(chǎn)孢量影響無顯著差異，14 d時(shí)產(chǎn)孢量分別為3.95×105、3.63×105、3.73×105個(gè)/皿。表明菌核青霉菌在黑暗條件下更易于菌絲生長和產(chǎn)孢。

2.4 不同pH值對(duì)菌核青霉菌菌絲生長、產(chǎn)孢的影響

栗仁菌核青霉菌在7種不同pH值上生長狀態(tài)如表4所示，最適宜栗仁菌核青霉菌菌絲生長和產(chǎn)孢的pH值為6，培養(yǎng)14 d菌落直徑達(dá)6.62 cm;產(chǎn)孢量為3.70×105個(gè)/皿。pH值為11時(shí)，菌落生長較慢，培養(yǎng) 14 d 菌落直徑為5.93 cm;pH值為5時(shí)，不適宜其產(chǎn)孢，培養(yǎng)14 d產(chǎn)孢量為2.35×105個(gè)/皿。

2.5 碳源對(duì)菌核青霉菌菌絲生長、產(chǎn)孢的影響

由表5可知，菌核青霉菌在8種不同碳源上均能生長，菌絲在以木糖醇為碳源的培養(yǎng)基上生長的最好，菌落直徑最大、產(chǎn)孢量最多，培養(yǎng)14 d菌落直徑為6.02 cm，產(chǎn)孢量為4.27×105個(gè)/皿;菌絲對(duì)可溶性淀粉的利用能力最低，培養(yǎng)14 d菌落直徑僅為3.45 cm。

2.6 氮源對(duì)菌核青霉菌菌絲生長、產(chǎn)孢的影響

由表6可知，栗仁菌核青霉菌在以牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨為基礎(chǔ)氮源的培養(yǎng)基上生長的好，其中以牛肉膏的利用率最高，14 d時(shí)的菌落直徑為 7.68 cm;該病菌在以酵母浸粉和硝酸鈉為基礎(chǔ)氮源的培養(yǎng)基上菌落擴(kuò)展相對(duì)較慢。供試氮源培養(yǎng)基中以蛋白胨和酵母浸粉的產(chǎn)孢數(shù)量大，14 d時(shí)產(chǎn)孢量分別為4.79×105、4.80×105個(gè)/皿，二者之間無顯著差異。

2.7 通氣狀況對(duì)菌核青霉菌生長的影響

由圖1可知，菌核青霉菌在不同通氣狀況下菌絲生長有較為顯著的差異，該病菌在24 h振蕩條件下菌絲生長的最好，培養(yǎng)5 d菌絲干質(zhì)量可達(dá) 0.40 g;在24 h靜止和12 h振蕩/12 h靜止下該病菌菌絲生長相對(duì)較慢，5 d時(shí)菌絲干質(zhì)量分別為0.21 g和0.16 g，由此可見菌核青霉菌在通氣良好的條件下更適宜生長。

2.8 致死溫度測(cè)定結(jié)果

將栗仁菌核青霉菌菌餅分別在40、45、50、55、60、65 ℃不同溫度的水浴鍋中處理10 min后，轉(zhuǎn)移到PDA平板中央25 ℃培養(yǎng)48 h，結(jié)果（圖2）表明，在40 ℃和45 ℃條件下處理的菌絲均可繼續(xù)生長，在50、55、60、65 ℃條件下處理過的菌絲則停止生長。因此可確定栗仁菌核青霉菌菌絲的致死溫度為50 ℃。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)合菌絲生長量和產(chǎn)孢量2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來衡量菌核青霉菌的適宜培養(yǎng)條件。研究發(fā)現(xiàn)，沙堡弱培養(yǎng)基最適合菌核青霉菌菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基最適合產(chǎn)孢;最適宜菌絲生長和產(chǎn)孢的溫度為25 ℃，pH值為6，光照條件為全黑暗;栗仁菌核青霉菌對(duì)木糖醇的利用率最高，在以木糖醇為基礎(chǔ)碳源的培養(yǎng)基上菌絲最適宜生長、產(chǎn)孢量最大;氮源中最適宜菌絲生長的為牛肉膏，但最適宜產(chǎn)孢的為酵母浸粉和蛋白胨;在24 h連續(xù)振蕩培養(yǎng)條件下最適合菌絲生長，培養(yǎng)5 d后菌落干質(zhì)量達(dá)0.40 g。

郜海燕等指出，最適合擴(kuò)展青霉生長的pH值為8，最適宜菌絲生長的碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母浸粉，這與菌核青霉略有不同[12]。王俊鳳等認(rèn)為小刺青霉菌最適宜的生長溫度為20 ℃，pH值為7，最適宜菌絲生長和產(chǎn)孢的碳源分別為可溶性淀粉和甘露醇;同時(shí)適宜菌絲生長和產(chǎn)孢的氮源為酵母浸粉[5]。菌核青霉菌和小刺青霉菌雖同為青霉屬，且均為腐爛病的致病菌，但二者適宜生長條件具有一定差異，可能因病菌生長環(huán)境和種間差異所引起。丁仁惠等研究發(fā)現(xiàn)指狀青霉和意大利青霉的致死溫度分別為80 ℃和75 ℃，與菌核青霉的致死溫度50 ℃略有不同，此差異可能是因生長環(huán)境不同或因寄主不同所導(dǎo)致[13]。本研究明確了栗仁菌核青霉菌對(duì)環(huán)境和營養(yǎng)條件的需求，為有效預(yù)防和防治由菌核青霉菌引起的栗仁腐爛病提供理論支撐，具體防腐方法還需進(jìn)一步研究探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]梁麗松，王貴禧. 不同產(chǎn)區(qū)板栗病原菌的種類及其致病力研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2003，16（3）：284-288.

[2]王海霞，劉正坪，朱曉清，等. 板栗貯藏期致腐病原真菌種類鑒定及其侵染特性[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21（4）：33-36.

[3]吳光金，易潤華. 板栗致腐微生物種群鑒定[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，20（4）：58-61.

[4]趙學(xué)平，貝亞維，王 強(qiáng)，等. 板栗貯藏期病害發(fā)生規(guī)律研究[J]. 植物保護(hù)，2000，26（4）：29-31.

[5]王俊鳳，溫曉蕾，孫偉明，等. 板栗腐爛病小刺青霉菌（Penicillium spinulosum）培養(yǎng)條件及藥劑篩選[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2020，22（3）：79-84.

[6]侯保林，張志銘，楊興民，等. 河北板栗種仁斑點(diǎn)類病害研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，11（2）：11-22.

[7]梁宗琦，韓燕峰，劉愛英，等. 擬青霉（Paecilomyces Bainier），一類應(yīng)用前景廣闊的真菌資源[J]. 菌物系統(tǒng)，2003，22（增刊1）：17-23.

[8]曹星星.鐵皮石斛病原真菌分離與鑒定及印度梨形孢促生作用研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2015.

[9]李愛華，岳思君，馬海濱. 真菌孢子三種計(jì)數(shù)方法相關(guān)性的探討[J]. 微生物學(xué)雜志，2006，26（2）：107-110.

[10]楊成前，吳中寶，余中蓮，等. 重慶市白術(shù)根腐病發(fā)生危害及其病原菌生物學(xué)特性[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（8）：1561-1567.

[11]姜小玉，臺(tái)蓮梅，劉鳳艷，等. 水稻谷粒褐變致病菌禾谷鐮孢菌絲生長特性研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，21（18）：70-72.

[12]郜海燕，肖尚月，陳杭君，等. 藍(lán)莓采后主要病原真菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2017，48（5）：327-334.

[13]丁仁惠，何小娥，王文龍，等. 柑橘采后主要病原菌的生物學(xué)特性研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018（12）：76-81.