閆學敏 吳英華 史艷 武喆 侯雷平 李梅蘭

摘要：胡蘿卜是重要的根菜類蔬菜之一，根部性狀影響最終的產(chǎn)量和品質。YUCCA基因通過介導生長素調控植物根部發(fā)育，是生長素合成途徑中的關鍵基因。利用生物信息學方法對胡蘿卜YUCCA基因家族成員進行鑒定，對其理化性質、染色體定位、系統(tǒng)進化樹、蛋白質的二級和三級結構以及保守基序進行分析。結果表明，在胡蘿卜的5條染色體上共鑒定到了14個YUCCA基因家族成員，其大部分基因含有3～4個外顯子;該家族編碼的蛋白質為富含堿性氨基酸的親水性蛋白質，氨基酸數(shù)量為290～424個，其蛋白質結構主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，通過構建系統(tǒng)進化樹可將其分為3個亞族，且亞細胞定位結果顯示，YUCCA基因家族蛋白質大部分被定位在細胞質中。這為YUCCA基因家族在調控胡蘿卜根發(fā)育和膨大機制研究奠定了理論基礎。

關鍵詞：胡蘿卜;生長素;YUCCA基因家族;生物信息學;蛋白質結構;染色體定位

中圖分類號：S631.201? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0052-06

收稿日期：2021-07-16

基金項目：山西省重點研發(fā)計劃重點項目子課題（編號：201703D211001-04-01）;山西省重點研發(fā)計劃（編號：201903D221063）。

作者簡介：閆學敏（1997—），女，山西呂梁人，碩士研究生，主要從事蔬菜育種及生物技術應用研究。E-mail：464679520@qq.com。

通信作者：李梅蘭，博士，教授，主要從事蔬菜育種及生物技術應用研究。E-mail：15935485975@163.com。

植物根系的生長發(fā)育存在著復雜的調控網(wǎng)絡，受到環(huán)境、生理、激素等多種因素的影響[1]。近年來，植物激素作為調控生長發(fā)育的一大類物質而被研究者廣泛關注，生長素是最早發(fā)現(xiàn)的植物生長類激素，其代謝調控和信號轉導機制研究較為廣泛[2]。其中，YUCCA基因家族已經(jīng)被證明調控植物的根系發(fā)育，在生長素生物合成的吲哚丙酮酸途徑中YUCCA基因家族是重要酶之一，其基因編碼黃素單加氧酶（flavin-containing monooxygenase，簡稱FMOs）[3-4]。YUCCA基因首次被鑒定是在擬南芥生長素過量的突變體研究中[5]，目前該基因家族已經(jīng)在煙草[6]、擬南芥[7]、水稻[8]、草莓[9]等作物中進行了全基因組鑒定分析，但在胡蘿卜中還未見類似的報道。

胡蘿卜（Daucus carota var. sativa DC.）是以肉質根為食用器官的二年生草本植物，是全球性十大蔬菜中的一種。根是植物在進化過程中適應陸地生活而發(fā)展起來的營養(yǎng)器官，胡蘿卜作為重要的根菜類蔬菜之一，研究其根部的生長發(fā)育對提高胡蘿卜的品質和產(chǎn)量至關重要。有研究表明，生長素在植物根尖形成的梯度濃度調控其合成和運輸，從而影響植物的根際發(fā)育[10]。因此，本試驗利用生物信息學方法鑒定胡蘿卜YUCCA基因家族，對其理化性質、染色體定位、系統(tǒng)進化樹、蛋白質的二級結構和三級結構以及保守基序進行分析，進一步為胡蘿卜YUCCA基因功能驗證提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 胡蘿卜YUCCA基因家族數(shù)據(jù)獲取與鑒定

通過擬南芥官網(wǎng)TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）獲取已報道過的YUCCA基因家族成員的蛋白質序列，在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BlastP檢索，設置E-value值為10-5，獲得擬南芥、煙草、玉米和胡蘿卜中的YUCCA基因家族候選基因的蛋白質序列和基因序列的fasta格式。通過CDD和SMART數(shù)據(jù)庫比對驗證候選基因的蛋白質序列結構域[11]，最終獲得11個擬南芥YUCCA基因、20個煙草YUCCA基因、30個玉米YUCCA基因和14個胡蘿卜YUCCA基因，并對其分別命名。

1.2 胡蘿卜YUCCA蛋白質理化性質分析

將篩選出的14個胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質序列通過ExPASy（https：//web.expasy. org/protparam/）在線網(wǎng)站分析其理化性質[12]。

1.3 胡蘿卜YUCCA基因的染色體定位

從NCBI上獲取基因的染色體位置信息，使用在線網(wǎng)站MG2C_V2.0（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）對基因進行染色體定位繪圖并簡單修飾。

1.4 擬南芥、煙草、玉米和胡蘿卜YUCCA基因家族系統(tǒng)進化樹分析

在軟件MEGA 7.0中對比4個物種的蛋白質序列，采用鄰接法構建進化樹，bootstrap設為1 000[13]。用在線網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）對進化樹進行環(huán)化。

1.5 胡蘿卜YUCCA蛋白質二、三級結構預測及亞細胞定位

通過在線網(wǎng)站SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）分別對胡蘿卜YUCCA基因家族的蛋白質序列進行二級結構預測和亞細胞定位。通過在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/）對胡蘿卜YUCCA基因家族的蛋白質序列進行三級結構模型分析[14]。

1.6 胡蘿卜YUCCA基因家族的基因結構及蛋白質保守基序分析

將14個基因的CDS和FASTA文件導入在線網(wǎng)站GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/index.php）進行胡蘿卜YUCCA基因結構分析[15]。使用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）和TBtools對胡蘿卜YUCCA蛋白質的保守基序進行分析[16]。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜YUCCA蛋白質理化性質

通過對胡蘿卜YUCCA基因家族的蛋白質進行理化性質分析（表1）可知，YUCCA蛋白質的氨基酸數(shù)為290～424個，相對分子質量為32.14～47.32 ku，氨基酸數(shù)和分子質量最大的均為蛋白質DcYUCCA3b，最小的均為蛋白質DcYUCCA6;等電點為6.61～935;不穩(wěn)定系數(shù)為31.98～50.25，其中蛋白質DcYUCCA5a、DcYUCCA5b、DcYUCCA5c、DcYUCCA5d、DcYUCCA10a和DcYUCCA10b均為穩(wěn)定蛋白，其余的蛋白質（DcYUCCA2、DcYUCCA3a、DcYUCCA3b、 DcYUCCA6、 DcYUCCA8a、 DcYUCCA8b、DcYUCCA8c和DcYUCCA9）為不穩(wěn)定蛋白;親水性均為負值，說明胡蘿卜中YUCCA蛋白質均為親水性蛋白。

2.2 胡蘿卜YUCCA基因的染色體定位

胡蘿卜共有9條染色體。染色體定位結果（圖1）顯示，胡蘿卜YUCCA基因家族中有7個基因被定位在1號染色體上，分布最多，基因存在聚集現(xiàn)象，說明這類基因功能具有一定的相似性。其次，有2個基因被定位在3號染色體上，2個基因被定位在5號染色體上，2個基因被定位在8號染色體上，1個基因被定位在9號染色體上。

2.3 擬南芥、煙草、玉米和胡蘿卜YUCCA基因家族系統(tǒng)進化樹

為進一步了解胡蘿卜YUCCA基因家族進化情況，選用擬南芥（11個）、煙草（20個）、玉米（30個）YUCCA基因家族基因為參考序列構建系統(tǒng)進化樹（圖2），結果分為6個亞族。其中胡蘿卜YUCCA基因家族主要分布在Ⅵ亞族中，有10個基因，其次為Ⅲ和Ⅴ亞族中。

2.4 胡蘿卜YUCCA蛋白質二、三級結構預測及亞細胞定位

對胡蘿卜YUCCA蛋白質的二級結構預測結果（表2）顯示，14個蛋白質主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成。為了驗證二級結構的結果準確性，對14個蛋白質的三級結構進行模型預測（圖3），結果顯示三級結構與二級結構基本一致。蛋白質的亞細胞定位結果顯示大多數(shù)的蛋白質均被定位在細胞質中（13個），還有少部分的蛋白質被定位在周質和外膜上。

2.5 胡蘿卜YUCCA基因結構

為了分析胡蘿卜YUCCA基因家族的功能，對14個基因進行基因結構分析（圖4），結果得出基因的長度不同，外顯子和內含子也存在差別。基因DcYUCCA2、DcYUCCA6、DcYUCCA10a和DcYUCCA10b均含有4個外顯子和3個內含子，其中基因DcYUCCA10a無上下游;基因DcYUCCA3a、DcYUCCA3b、DcYUCCA5a、DcYUCCA5b、DcYUCCA5c、DcYUCCA5d、DcYUCCA8a、DcYUCCA8b和DcYUCCA8c含有3個外顯子和2個內含子，其中基因DcYUCCA5a、DcYUCCA5b、DcYUCCA5c、DcYUCCA5d和DcYUCCA8b無上下游;基因DcYUCCA9含有2個外顯子和1個內含子。

2.6 胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質保守基序

對胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質序列進行保守基序分析（圖5），發(fā)現(xiàn)14個蛋白質的保守結構域為6～10個。蛋白質DcYUCCA3a、DcYUCCA3b、DcYUCCA5a、DcYUCCA5b、DcYUCCA5c、DcYUCCA5d、DcYUCCA8c和DcYUCCA9含有10個motif，結構和功能最為相似，14個YUCCA蛋白質中均含有motif 1、motif 7和motif 3。蛋白質DcYUCCA2不含motif 9、motif 6和motif 10;蛋白質DcYUCCA6不含motif 5、motif 4、motif 6和motif 10;蛋白質DcYUCCA10a和DcYUCCA10b結構基本一致，均不含motif 8、motif 9和motif 10;蛋白質DcYUCCA8a不含motif 9、motif 4和motif 10;蛋白質DcYUCCA8b不含motif 2、motif 5和motif 6。

3 討論與結論

植物根部的生長發(fā)育是一個動態(tài)變化的過程，是由根尖分生區(qū)細胞的分裂和伸長區(qū)細胞的伸長而生長的，在這個過程中植物激素發(fā)揮了重要的作用[17]。生長素是其中一類生長調節(jié)激素，可以促進細胞的伸長、木質部和韌皮部的分化，從而使根部增粗[18]。在胡蘿卜中，研究根部膨大增粗可以提高其品質和產(chǎn)量，提高經(jīng)濟效益。YUCCA基因家族蛋白是植物中第一個被鑒別的FMO類超家族，調控生長發(fā)育和植物的耐受性[19]。有研究證實YUCCA基因介導生長素的生物合成，在擬南芥中抑制YUCCA表達會抑制生根，調控根器官發(fā)育[20]。

本研究利用生物信息學方法鑒定胡蘿卜YUCCA基因家族成員共14個，與擬南芥YUCCA基因家族的11個成員數(shù)量較接近。通過理化性質分析得出，胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質基本為堿性氨基酸（除了蛋白質DcYUCCA8a），且14個蛋白質均為親水性蛋白質，基因分別定位在5條染色體上（1、3、5、8、9號），其中在1號染色體上較聚集，結構和功能最為相似。系統(tǒng)進化樹中聚集在一起的亞族具有相似的進化源和基因功能，通過構建系統(tǒng)進化樹將胡蘿卜YUCCA基因家族分為3個亞族（Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ亞族），與煙草和擬南芥的親緣關系較近，其中，Ⅲ亞族中的DcYUCCA2和DcYUCCA6與擬南芥的ArYUCCA2和ArYUCCA6親緣關系最近，推測可能通過調控生長素信號轉導介導植物的生長發(fā)育和早期花粉發(fā)育[21]。

蛋白質的結構決定其生物學功能，結構相似其功能相似，在分析蛋白質的二級結構和三級結構模型時發(fā)現(xiàn)，YUCCA基因家族蛋白質主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，位于同一家族成員的結構具有一致性。在亞細胞定位中發(fā)現(xiàn)大部分的蛋白質被定位在細胞質中，表明這些基因合成生長素基本上是在細胞質中完成的，這與王仁漢等的結果[6，22]一致。通過分析胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質的保守基序發(fā)現(xiàn)，14個蛋白質的motif有6～10個不等，說明基因家族功能的多樣性，但其中有大部分YUCCA蛋白質的motif數(shù)量均為10個，說明基因家族的功能具有相似性?？傮w來看，位于同一基因家族的成員在植物中的結構和功能均具有相似性，為進一步研究基因家族提供參考，為胡蘿卜根部膨大形成機制的研究奠定了理論基礎。

本研究在胡蘿卜的5條染色體上共鑒定到了14個YUCCA基因家族成員，其大部分基因含有3～4個外顯子;該家族編碼的蛋白質為富含堿性氨基酸的親水性蛋白質，氨基酸數(shù)量為290～424個，其蛋白質結構主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，通過構建系統(tǒng)進化樹可將其分為3個亞族，且亞細胞定位結果顯示，YUCCA基因家族蛋白質大部分被定位在細胞質中。這為YUCCA基因家族在調控胡蘿卜根發(fā)育和膨大機制研究奠定了理論基礎。

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