潘東明，劉磊

（深圳市第三人民醫(yī)院/南方科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院1.兒科；2.醫(yī)院辦公室，廣東 深圳 518112）

膽道閉鎖（biliary atresia,BA）是新生兒期發(fā)生的嚴(yán)重肝膽系統(tǒng)疾病，以肝內(nèi)和肝外膽管的進(jìn)行性炎癥和纖維性梗阻為特征，是目前兒童肝臟移植的重要原因之一。膽道閉鎖發(fā)病率具有種族和地區(qū)差異，亞洲發(fā)病率高于歐美，中國大陸相關(guān)BA 發(fā)病率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不全面，中國臺(tái)灣地區(qū)為1.78/10000［1］。根據(jù)2018 版膽道閉鎖診斷及治療指南［2］，肝門空腸吻合術(shù)（Kasai 手術(shù)）應(yīng)當(dāng)作為膽道閉鎖的首選治療方案，Kasai 手術(shù)后出現(xiàn)肝衰竭或者肝功能失代償需要進(jìn)行肝移植手術(shù)治療。

膽道閉鎖目前病因尚不明確，遺傳因素、病毒感染、環(huán)境因素等都在其中發(fā)揮作用。本文將從遺傳角度系統(tǒng)梳理膽道閉鎖的病因?qū)W最新研究進(jìn)展，包括表觀、基因多態(tài)性、單基因突變?nèi)齻€(gè)方面。

1 DNA 甲基化與膽道閉鎖

DNA 甲基化是表觀遺傳的主要形式之一，其主要參與基因表達(dá)調(diào)控、重金屬修飾、蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)以及核糖核酸加工，基因組DNA 甲基化狀態(tài)改變會(huì)引起基因表達(dá)異?；蛉旧w結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定［3］。大量研究證實(shí)DNA 甲基化與多種疾病如癌癥、印記基因疾病、自身免疫疾病、代謝疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［4-5］。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的甲基化與膽道閉鎖存在關(guān)聯(lián)，如Foxp3、Alu 與長散在重復(fù)序列-1（LINE-1）、ITGAL、γ-干擾素（IFN-γ）、ATX。

Foxp3 是控制Treg 細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其在多種肝臟疾病中存在異常表達(dá)修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)Treg 細(xì)胞的功能影響疾病的發(fā)生發(fā)展［6-7］。LI 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，相比正常對(duì)照，膽道閉鎖患者與小鼠模型中Treg 細(xì)胞的Foxp3 啟動(dòng)子區(qū)CpG 島存在顯著高甲基化。在恒河猴輪狀病毒感染的膽道閉鎖小鼠模型中，通過注射甲基化抑制劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine,5-Aza）可以一定程度緩解膽道閉鎖癥狀。并且注射5-氮雜胞苷小鼠相比未注射的感染模型，其Treg 細(xì)胞具有更好的抑制功能。因此推測Treg 細(xì)胞中Foxp3 啟動(dòng)子區(qū)異常的甲基化狀態(tài)將損傷Treg 細(xì)胞抑制功能，進(jìn)一步加重膽道閉鎖的炎癥損傷程度。

Alu 和LINE-1 元件是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，在人類基因組中普遍存在，會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，特別是與端粒長度有關(guān)。UDOMSINPRASERT 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖患者相比健康對(duì)照，其外周血Alu 與LINE-1 顯著低甲基化。LINE-1 甲基化與患者肝纖維化程度相關(guān)，并且膽道閉鎖患者中Alu和LINE-1 的甲基化與端粒長度呈正相關(guān)，低甲基化的患者端粒長度更短，其轉(zhuǎn)錄活性升高的同時(shí)增加機(jī)體氧化應(yīng)激對(duì)DNA 的損傷。

CD4+T 細(xì)胞的ITGAL 啟動(dòng)子調(diào)控元件低甲基化引起表達(dá)升高在很多自身免疫疾病患者中廣泛出現(xiàn)［10］。DONG 等［11］通過測量膽道閉鎖患者與健康對(duì)照的CD4+T 細(xì)胞ITGAL 的基因表達(dá)與甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，ITGAL 在膽道閉鎖患者CD4+T 細(xì)胞中顯著下調(diào)，這與其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化相關(guān)。通過DNA 甲基化抑制劑治療后，ITGAL 啟動(dòng)子甲基化下調(diào)，其基因表達(dá)上調(diào)。

IFN-γ 是機(jī)體發(fā)揮固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)中重要的細(xì)胞因子，IFN-γ 異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致一些自身炎癥和免疫性疾病的發(fā)生。DONG等［12］研究發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖患者CD4+T 細(xì)胞IFN-γ 表達(dá)相比健康對(duì)照顯著增高，IFN-γ 基因啟動(dòng)子區(qū)域存在顯著低甲基化。YANG 等［13］進(jìn)一步研究膽道閉鎖患者中miR-29b/142-5p 對(duì)IFN-γ 基因甲基化的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，患者中miR-142-5p、DNMT1 高表達(dá)，miR-29b 與DNMT3a/DNMT3b 的表達(dá)在膽道閉鎖的肝臟中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，并且LINE-1、Alu、SAT2 和IFN-γ 啟動(dòng)子區(qū)域存在低甲基化，IFN-γ 的表達(dá)上調(diào)。最終，研究推斷miRNA-29b/142-5p 的高表達(dá)可以抑制DNMTs 表達(dá)，導(dǎo)致甲基化降低，進(jìn)而IFN-γ 基因過表達(dá)。

UDOMSINPRASERT 等［14］通過對(duì)65 個(gè)膽道閉鎖患者與65 個(gè)正常對(duì)照的外周血ATX 基因進(jìn)行甲基化檢測與表達(dá)量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽道閉鎖患者ATX 基因的啟動(dòng)子區(qū)特定的CpG 島存在低甲基化，并且膽道閉鎖晚期相比早期患者甲基化程度更低。并且，啟動(dòng)子低甲基化、ATX 過表達(dá)與膽道閉鎖患者的黃疸狀態(tài)、肝功能障礙以及肝臟僵硬程度相關(guān)聯(lián)。

綜上，F(xiàn)oxp3 啟動(dòng)子CpG 島的高甲基化會(huì)損傷Treg 細(xì)胞抑制功能，加重膽道閉鎖發(fā)生的炎癥損傷。Alu 和LINE-1 低甲基化，可能增加機(jī)體氧化應(yīng)激對(duì)DNA 的損傷，導(dǎo)致肝纖維化程度加重。TGAL 啟動(dòng)子區(qū)低甲基化，可能引起T 細(xì)胞功能異常。IFN-γ 啟動(dòng)子區(qū)低甲基化，可能誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)膽道閉鎖的發(fā)展。以上研究可以看到DNA 甲基化在膽道閉鎖中發(fā)揮重要作用，特別是影響免疫細(xì)胞功能或者參與機(jī)體氧化應(yīng)激造成炎性損傷。ATX 啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化導(dǎo)致其蛋白過表達(dá)，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。目前還沒有對(duì)膽道閉鎖全基因組層面的相關(guān)研究，新的組學(xué)技術(shù)的發(fā)展特別是單細(xì)胞甲基化測序技術(shù)的發(fā)展如scRRBS、scBS-seq、scWGBS 等將進(jìn)一步推動(dòng)領(lǐng)域的研究［15］。

2 基因多態(tài)性與膽道閉鎖

基因的多態(tài)性可能導(dǎo)致肝臟的炎癥以及纖維化的易感性增強(qiáng)，通過不同的SNP 基因分型技術(shù)可以研究特定基因的分型與膽道閉鎖的關(guān)聯(lián)［16］。目前已經(jīng)報(bào)道與膽道閉鎖相關(guān)的基因多態(tài)性基因包 括 EFEMP1［17］、ADIPOQ［18］、ITGB2［19］、VEGF［20］、USF2［21-22］、ADD3［23-28］、GPC1［29］、ARF6［30］、IFNG［31］、MIF［32］、ICAM1［33］等。

GARCIA-BARCELó 等［23］在包含200 中國膽道閉鎖患者與481 個(gè)健康對(duì)照的隊(duì)列中采用全基因組關(guān)聯(lián)分析尋找膽道閉鎖的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含XPNPEP1 與ADD3 的區(qū)域的多個(gè)突變與膽道閉鎖風(fēng)險(xiǎn)較高。CHENG 等［24］擴(kuò)展了先前的研究，在包含339 個(gè)膽道閉鎖患者與401 個(gè)健康對(duì)照的隊(duì)列對(duì)10q24.2 的107 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)rs17095355 位點(diǎn)最顯著相關(guān)，10q24.2 區(qū)域的SNP 位點(diǎn)通過調(diào)節(jié)肝中ADD3 的表達(dá)，可能在一定程度引起膽道閉鎖。在先前的研究中［27］，漢族人群隊(duì)列（134 膽道閉鎖患者與618 個(gè)健康對(duì)照）中對(duì)ADD3 的兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)也進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP rs17095355 在共顯性模型中與膽道閉鎖相關(guān)，rs10509906 在加性模型下與膽道閉鎖相關(guān)。并且T(a)-G(b)（a 為rs17095355,b 為rs10509906）基因型相比C(a)-C(b)基因型風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。WANG 等［25］選擇了ADD3 的三個(gè)SNP 風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)在510 個(gè)膽道閉鎖患者與1 473 個(gè)健康對(duì)照的隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。分析結(jié)果顯示，rs17095355 與rs2501577 兩個(gè)位點(diǎn)在該隊(duì)列證實(shí)與膽道閉鎖相關(guān)聯(lián)。LAOCHAREONSUK 等［26］在泰國嬰兒隊(duì)列（56 個(gè)膽道閉鎖患者與166 個(gè)健康對(duì)照）中對(duì)ADD3 的三個(gè)位點(diǎn)（rs2501577,rs11194981,rs12268910）進(jìn)行驗(yàn)證。分析結(jié)果支持三個(gè)位點(diǎn)在膽道閉鎖患者中顯著高于對(duì)照，并且rs17095355與rs2501577 累加具有更高風(fēng)險(xiǎn)。

CHEN 等［17］對(duì)歐美隊(duì)列343 個(gè)散發(fā)膽道閉鎖患者與1716 個(gè)健康對(duì)照進(jìn)行GWAS 分析，Meta分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)與膽道閉鎖高度相關(guān)的SNP 位點(diǎn)，位于2p16.1（rs10865291,rs6761893,and rs 727878；P<5×10-8），這些SNP 位于EFEMP1 基因的5 號(hào)內(nèi)含子?；虮磉_(dá)檢測發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖患者的EFEMP1 表達(dá)量更高，免疫組化結(jié)果顯示，EFEMP1 在膽道閉鎖患者的肝臟標(biāo)本中的膽管細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，但在正常對(duì)照肝臟樣本中的膽管細(xì)胞中則沒有表達(dá)。因此，EFEMP1 是膽道閉鎖的潛在風(fēng)險(xiǎn)基因。

HUANG 等［21］在包含52 個(gè)膽道閉鎖患者與96個(gè)健康對(duì)照的隊(duì)列研究USF2 rs916145 與疾病的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs916145 的C 等位基因在膽道閉鎖患者中頻率更高。但是該結(jié)論在更大隊(duì)列并未得到證實(shí)。CHEN 等［22］在中國南方人群隊(duì)列中研究USF2 rs916145 與膽道閉鎖的關(guān)聯(lián)，該隊(duì)列包含506 個(gè)膽道閉鎖患者與1 473 個(gè)健康對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因型不存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，USF2 rs916145 多態(tài)性與膽道閉鎖不存在關(guān)聯(lián)。

通過以上研究可以看到，采用全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫，可以為諸如膽道閉鎖之類疾病的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)研究提供全局線索。而針對(duì)同一SNP 位點(diǎn)，不同遺傳背景、甚至樣本數(shù)量都可能影響對(duì)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的評(píng)估。因此，要闡明膽道閉鎖的病因，全基因組關(guān)聯(lián)研究以及相關(guān)的數(shù)據(jù)共享將尤為重要。

3 單基因突變與膽道閉鎖

膽道閉鎖患兒出生時(shí)約20%存在肝膽系統(tǒng)形態(tài)學(xué)發(fā)育異常，并且常伴有多發(fā)畸形，提示膽道閉鎖可能與染色體異常、膽管發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因有關(guān)。GIRARD 等［28］對(duì)目前在膽道閉鎖患者中報(bào)道的染色體異常、基因突變與相關(guān)綜合征進(jìn)行了總結(jié)。對(duì)于染色體異常，多數(shù)報(bào)道為染色體重復(fù)如18 三體、貓眼綜合征相關(guān)的22 三體或者四體。CHENG 等［34］對(duì)包含89 個(gè)三期非綜合征膽道閉鎖患者隊(duì)列開展全基因組拷貝數(shù)突變分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)29 個(gè)膽道閉鎖相關(guān)的拷貝數(shù)變異，這些拷貝數(shù)變異區(qū)域包含的基因富集在炎癥相關(guān)通路，提示免疫-炎癥在膽道閉鎖中的重要作用。但是目前沒有發(fā)現(xiàn)與膽道閉鎖明確相關(guān)的單一致病染色體異常。

對(duì)于單基因疾病，目前案例報(bào)道較多［28］，部分基因與肝臟疾病相關(guān)，如JAG1［35］、PKHD1［36］等。JAG1 是Alagille 綜合征的致病基因，該疾病為常染色體顯性遺傳，并且存在外顯不全。PKHD1 為常染色體隱性多囊性腎病的致病基因，該疾病與肝囊腫以及纖維化相關(guān)。SANGKHATHAT 等［35］對(duì)20 個(gè)膽道閉鎖患者進(jìn)行全外顯子測序，重點(diǎn)分析19 個(gè)嬰兒膽汁淤積癥相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8 個(gè)基因存在雜合突變（MYO5B、ABCC2、ABCB11、UGT1A1、MLL2、ERCC4、KCNH1、JAG1），但是這些患者并不存在相關(guān)疾病癥狀，提示這些突變可能是偶發(fā)，并不一定與膽道閉鎖相關(guān)聯(lián)。與此同時(shí)，部分案例報(bào)道了膽道閉鎖中與肝臟無關(guān)的基因的突變，如CFC1、ZIC3，這些基因與膽道閉鎖的關(guān)聯(lián)需要更多研究［28］。

在以上不同的案例報(bào)道和研究中，部分基因突變導(dǎo)致疾病與膽道閉鎖存在一定關(guān)聯(lián)，但是其作用更像是一種累加因素，并不是膽道閉鎖的決定原因。部分結(jié)果由于是基于散發(fā)案例的報(bào)道，其更可能是偶發(fā)因素，基于現(xiàn)有結(jié)果無法判斷其與膽道閉鎖的關(guān)聯(lián)。隨著全外顯子/全基因組測序在臨床診斷中的應(yīng)用普及，利用其在拷貝數(shù)變異、結(jié)構(gòu)變異分析中的分析優(yōu)勢，相信未來對(duì)于膽道閉鎖的致病基因?qū)?huì)不斷加深，發(fā)掘出更多的相關(guān)基因。

除了以上表觀與基因組層面，microRNA 與膽道閉鎖的關(guān)聯(lián)也存在大量研究。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a/b、miR-21、miR-29、miR-222 在膽道閉鎖肝纖維化中發(fā)揮重要作用，且多項(xiàng)研究證實(shí)，microRNA 可協(xié)同多個(gè)基因，形成復(fù)雜的纖維化網(wǎng)絡(luò)途徑［37］。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，基于臨床隊(duì)列的研究不斷發(fā)掘新的膽道閉鎖相關(guān)基因，這些基因從免疫反應(yīng)、炎癥、遺傳易感性、纖維化等諸多方面，揭示膽道閉鎖的致病機(jī)制，這些研究將可能為膽道閉鎖的診斷、治療提供更多新的視角，與此同時(shí)為膽道閉鎖的臨床精準(zhǔn)治療提供新的可能靶點(diǎn)。