付學鵬 沈童飛 孫曉波 劉曉涵 楊曉杰

（1齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，161006，黑龍江齊齊哈爾；2黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室，161006，黑龍江齊齊哈爾；3泰來縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，162400，黑龍江泰來）

水稻是我國主要的糧食作物之一，在我國北方地區(qū)，水稻育苗時常因溫度、濕度、光照和病蟲害等原因出現(xiàn)種子萌發(fā)率低、根系生長緩慢、苗弱、抗逆性差等現(xiàn)象，從而影響水稻苗后期的生長及產(chǎn)量。在提倡“減肥減藥”的現(xiàn)階段，植物根際促生菌（PGPR）在作物促生、抗逆、防病中的作用越來越受到人們的重視[1-2]。前人已篩選出了許多對水稻有促生和防病功能的促生菌[3]，如芽孢桿菌屬（Bacillus）[4]、固氮菌屬（Azotobacter）[5]、腸桿菌屬（Enterobacter）[6]、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）[6]和鏈霉菌屬（Streptomyces）[7]等。在眾多根際促生菌中，鏈霉菌屬是革蘭氏陽性放線菌中種類最多的一個屬（超過500種），已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多種鏈霉菌能夠提高植物的抗病和抗逆性，促進植物生長[7]。在水稻促生菌篩選方面，鏈霉菌株702[8]和鏈霉菌株JD211[9-12]都能促進水稻種子萌發(fā)及其幼苗生長；從蚯蚓糞中篩選到的鏈霉菌株CAI-85和CAI-93能夠使水稻分蘗數(shù)、花序數(shù)、根長、根體積及根干重增加[13]。由于受到宿主種屬范圍、根際定殖、作用方式、根際生態(tài)和接種方式等因素的影響，鏈霉菌在不同地區(qū)、土壤和作物中的促生和抗病效果存在差異[7]。為了進一步促進更多鏈霉菌在農(nóng)業(yè)中的應用，需要嘗試從更多介質(zhì)中采用更多方法篩選更優(yōu)質(zhì)高效的促生菌株。黑龍江省是我國水稻主產(chǎn)區(qū)之一，其高寒氣候和黑土特性也亟待開發(fā)更多適應性強的促生菌株。

本課題組在前期研究中從黑龍江省齊齊哈爾市馬鈴薯根際土中篩選到1株鏈霉菌，經(jīng)形態(tài)學和16S rRNA鑒定，命名為Streptomycessp. FXP04，該菌株能促進馬鈴薯幼苗生長，降低晚疫病病情指數(shù)，但其對水稻種子萌發(fā)及幼苗生長的影響尚不清楚。本研究用不同濃度的Streptomycessp. FXP04發(fā)酵液和菌液分別對“中組4號”水稻種子進行處理，研究該菌株對水稻種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，明確該菌株對水稻的促生作用及適宜接種方式，研究結(jié)果可為該菌株作為生物肥的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用土為黑龍江省泰來縣水稻田土，土壤基本理化性質(zhì)：堿解氮343mg/kg，有效磷258.34mg/kg，速效鉀90.2mg/kg，有機質(zhì)29.78g/kg，pH值7.03，電導率1.22mS/cm。水稻品種為“中組4號”，菌株為Streptomycessp. FXP04。

1.2 培養(yǎng)基配方及發(fā)酵培養(yǎng)

LB培養(yǎng)液（1L）：酵母浸出汁5.0g，NaCl 8.0g，蛋白胨10g，pH值7.2，經(jīng)121℃高壓滅菌20min，在無菌條件下接種Streptomycessp. FXP04菌株，置于恒溫搖床，28℃、120r/min黑暗條件培養(yǎng)。待發(fā)酵液渾濁（4～6d，視接種量而定）后，使用分光光度計測定發(fā)酵液在600nm處的OD值，測定后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗設(shè)計及指標測定

挑選飽滿的水稻種子，于30℃條件下用無菌水浸種催芽24h。將菌液經(jīng)5 000r/min離心15min后棄沉淀，保留上清液，將上清液抽濾，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，得到不含Streptomycessp. FXP04菌體的發(fā)酵液。

1.3.1 發(fā)酵液浸種處理對水稻種子萌發(fā)的影響 用發(fā)酵液原液及其無菌去離子水稀釋的10倍（1/10）、50倍（1/50）和100倍（1/100）溶液分別對催芽后的水稻種子進行浸種處理；以無菌去離子水對LB培養(yǎng)液作上述倍數(shù)稀釋作為對照（CK1）；以無菌去離子水處理作為兩者的共同對照（CK2）。每個處理3次重復，每次重復50粒種子。將種子放入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中分別加入各處理溶液10mL，每隔2d更換1次對應的浸種溶液（各溶液不用時于4℃保存），28℃黑暗條件下培養(yǎng)，自種子浸種當日起每天觀察種子發(fā)芽情況，以種子露白作為發(fā)芽標準。

1.3.2 菌液噴灑土壤對水稻種子萌發(fā)和幼苗生長的影響 將菌液用無菌去離子水按照1/50和1/100的倍數(shù)稀釋，分別取100mL均勻噴撒在土壤表面，然后將100粒種子均勻撒播在土壤表面，覆土，用噴壺灑水浸濕土壤。室內(nèi)培養(yǎng)（光照/黑暗：16h/8h），室溫25℃±2℃。記錄種子萌發(fā)情況及幼苗生長情況；播種20d后取樣，測定幼苗干重及根冠比。使用根系掃描儀分析根系生長情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007對數(shù)據(jù)進行記錄和整理，使用SPSS 16.0軟件和Turkey HSD檢驗對數(shù)據(jù)進行oneway ANOVA分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液浸種對水稻種子萌發(fā)的影響

3次重復試驗的發(fā)酵液原液OD600值分別為1.689、1.986和1.859，經(jīng)生長曲線分析，3次發(fā)酵都處于穩(wěn)定期，且結(jié)果相似，因此本文展示其中1次（OD600=1.859）的數(shù)據(jù)。

從表1和圖1可以看出，發(fā)酵液原液和LB培養(yǎng)液處理組都沒有種子萌發(fā)。在所有稀釋倍數(shù)中，1/50倍發(fā)酵液處理的種子萌發(fā)率最高，并顯著高于1/50倍LB培養(yǎng)液處理（P＜0.05）。1/10倍發(fā)酵液在處理初期和后期（6d和10d）顯著高于1/10倍LB培養(yǎng)液（P＜0.05）；1/100倍發(fā)酵液處理與1/100倍LB培養(yǎng)液處理的種子萌發(fā)率無顯著差異（P≥0.05）。在所有稀釋倍數(shù)中，在處理初期和后期（6d和10d）只有1/50倍發(fā)酵液處理高于清水處理的萌發(fā)率（P＜0.05）。

表1 發(fā)酵液對水稻種子萌發(fā)率的影響Table 1 Effect of fermentation liquid on rice seed germination percentage %

圖1 發(fā)酵液對水稻種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of fermentation liquid on rice seeds germination

2.2 菌液對土培水稻種子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，播種后7d時，1/100倍菌液和LB培養(yǎng)液處理的種子萌發(fā)率較高，但是兩者間無顯著差異；1/50倍菌液和1/100倍菌液處理的種子萌發(fā)率無顯著差異（P≥0.05），但顯著高于1/50倍LB培養(yǎng)液處理的種子（P＜0.05）。播種18d后時，1/50倍菌液處理的種子萌發(fā)率最高，顯著高于1/50倍LB培養(yǎng)液處理的種子（P＜0.05）；1/100倍菌液處理的種子萌發(fā)率顯著高于1/100倍培養(yǎng)液處理的種子。

表2 土培條件下菌液對水稻種子發(fā)芽率的影響Table 2 Effect of cell suspension on rice seed germination percentage in soil %

2.3 菌液對土培水稻幼苗株高和根長的影響

播種20d時，選擇長勢一致的水稻幼苗20株測量株高和主根長。從表3和圖2可以看出，1/50倍和1/100倍菌液處理的水稻幼苗株高和主根長顯著高于1/50倍和1/100倍LB培養(yǎng)液處理的幼苗（P＜0.05），1/50倍和1/100倍菌液處理間幼苗株高和主根長無顯著差異（P≥0.05）。

表3 土培條件下發(fā)酵液對水稻幼苗生長的影響Table 3 Effects of cell suspension on rice seedlings growth in soil

2.4 菌液對土培水稻幼苗根系生長的影響

播種20d時，使用根系掃描儀分析水稻幼苗根總長度、須根數(shù)、根表面積和根總體積。由圖3可知，與1/50倍LB培養(yǎng)液相比，經(jīng)1/50倍菌液處理后水稻根直徑≤0.5mm的根總長度、根總體積、根表面積和須根數(shù)都顯著升高（P＜0.05）；1/100倍菌液處理后的水稻根總長度、根總體積、根表面積和須根數(shù)也呈現(xiàn)出相同趨勢；與1/50倍菌液相比，1/100倍菌液處理顯著提高了水稻根總長度和根表面積，但對根總體積和須根數(shù)無顯著影響。

圖2 土培條件下菌液對水稻幼苗生長的影響Fig.2 Effect of cell suspension on rice seedling growth in soil

圖3 菌液對水稻根系生長的影響Fig.3 Effects of cell suspension on rice root growth

與1/50倍LB培養(yǎng)液相比，經(jīng)1/50倍菌液處理后水稻0.5mm＜根直徑≤1.0mm的根總長度和須根數(shù)顯著升高；與1/100倍LB培養(yǎng)液相比，經(jīng)1/100倍菌液處理后水稻0.5mm＜根直徑≤1.0mm的根總體積和根表面積顯著升高，根總長度和須根數(shù)無顯著差異。與1/50倍菌液相比，1/100倍菌液處理顯著提高了水稻幼苗根總體積和根表面積，根總長度和須根數(shù)無顯著差異。

對于直徑≥1.5mm的根來說，相對于1/50倍LB培養(yǎng)液，1/50倍菌液處理使得根總長度、根總體積、根表面積和須根數(shù)都顯著升高（P＜0.05）；對于1/100的LB培養(yǎng)液和菌液處理，對根總長度、根總體積和根表面積都表現(xiàn)出相同的影響效果；與1/100倍菌液相比，1/50倍菌液處理的根總長度和須根數(shù)顯著提高（P＜0.05），根體積和根表面積沒有顯著差異。

2.5 菌液對土培水稻幼苗干重和根冠比的影響

從圖4可以看出，與1/50和1/100倍LB培養(yǎng)液相比，1/50和1/100倍菌液處理的水稻幼苗地上部干重、地下部干重和總干重都顯著提高（P＜0.05）。1/50菌液和1/100倍菌液對水稻幼苗干重和根冠比的影響無顯著差異（P≥0.05）。

圖4 菌液對水稻幼苗干重和根冠比的影響Fig.4 Effects of cell suspension on dry weight and root-shoot ratio of rice seedlings

3 討論

植物根際促生菌是一類能夠促進植物生長、防治病害、誘導抗性、增加產(chǎn)量的一類有益微生物[1-2]。根際促生菌種類很多，其中很多種鏈霉菌對水稻均具有促生和提高抗逆抗病的效果[7-13]。在棉花田土壤及珙桐植株內(nèi)分離出對水稻種子萌發(fā)和幼苗生長有促進作用的促生菌[8-12]；在蚯蚓糞中篩選出對水稻分蘗數(shù)、花序數(shù)、根長、根體積及根干重有顯著促進作用的鏈霉菌株[13]。目前，尚未見在我國東北高寒黑土中分離出對水稻具有促生作用的鏈霉菌的報道。

本研究利用前期從黑龍江省馬鈴薯根際土中篩選到的能夠促進馬鈴薯幼苗生長和降低馬鈴薯晚疫病病情指數(shù)的鏈霉菌-Streptomycessp. FXP04菌株，通過3次獨立試驗明確了該菌株對水稻種子萌發(fā)和幼苗生長的促進作用。在水稻種子培養(yǎng)皿萌發(fā)試驗中，將處于生長穩(wěn)定期的Streptomycessp.FXP04發(fā)酵液稀釋不同倍數(shù)后浸種，發(fā)現(xiàn)其中發(fā)酵液原液及LB培養(yǎng)液原液（未接種Streptomycessp.FXP04的對照）完全抑制了種子萌發(fā)，說明二者對水稻種子的萌發(fā)有抑制作用。發(fā)酵液經(jīng)無菌水稀釋后表現(xiàn)出對種子萌發(fā)的促進作用，其中1/50倍發(fā)酵液的促萌發(fā)效果顯著高于1/10和1/100倍的發(fā)酵液，并且只有1/50倍發(fā)酵液的促萌發(fā)效果顯著高于清水處理的種子。李張等[9]用篩選到的鏈霉菌JD211菌株濾液處理水稻種子，在稀釋1/1000倍的條件下對種子萌發(fā)有促進作用。本研究中，發(fā)酵液中沒有Streptomycessp. FXP04菌體，發(fā)酵液對水稻種子有促萌發(fā)作用，說明Streptomycessp. FXP04可能產(chǎn)生了具有促進種子萌發(fā)的次生代謝物，如生長素（IAA）和細胞分裂素等[7]。Gopalakrishnan等[13]在蚯蚓糞中分離到的6株鏈霉菌都能產(chǎn)生并分泌IAA；麻金金[14]在玫瑰黃鏈霉菌NKZ-259菌株的次生代謝物中檢測到IAA；Goudjal等[15]從阿爾及利亞貧瘠沙漠中生存的植物內(nèi)篩選到的內(nèi)生鏈霉菌Streptomycessp. PT2也能夠分泌IAA。這些研究證明，鏈霉菌具有分泌IAA的潛能。值得注意的是，這些研究是在體外試驗中檢測到鏈霉菌分泌的IAA，至于鏈霉菌在定殖植物的根際能否產(chǎn)生IAA還需要通過突變體進行更深入的研究[7，16-17]。

鏈霉菌的接種方式影響促生效果[7]。Bonaldi等[18]研究表明，生菜種子用StreptomycesZEA17L菌株包衣比在基質(zhì)中直接接種更能促進該菌株在生菜根際的定殖；Gopalakrishnan等[13]采用定殖前菌液蘸根，定殖后定期澆灌菌液的方式處理水稻幼苗，能夠促進水稻分蘗數(shù)、花序數(shù)、根長、根體積及根干重，提高產(chǎn)量等；用固體發(fā)酵和土壤拌菌的方式分別將鏈霉菌株702[8]和JD211[10-11]接種到水稻種子，也促進了水稻種子萌發(fā)和幼苗生長。本研究使用育苗盤模擬田間水稻育苗，將鏈霉菌液噴灑在苗床上，使種子能夠接觸到鏈霉菌株。結(jié)果表明，在播種后18d時，1/50和1/100倍菌液處理的種子萌發(fā)率顯著高于對應的LB培養(yǎng)液及清水處理，說明采用菌液噴灑的方式在1/50和1/100倍濃度下該菌株能促進水稻種子萌發(fā)，此種菌液施用方式及濃度可為該菌應用于水稻田間育苗提供理論參考。

在幼苗生長時期，1/50倍和1/100倍的Streptomycessp. FXP04菌液處理都能促進水稻幼苗株高、根長和幼苗干重提高，但兩者間無顯著差異。鏈霉菌株JD211對水稻幼苗生長有極顯著的促進作用[11]，且能促進水稻幼苗的根數(shù)、根長及根體積[12]。根系的生長對于水稻吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)具有重要的作用[19]，本研究中Streptomycessp. FXP04菌液對水稻株高和干重的促進效應可能是通過改善水稻根系生長實現(xiàn)的，如根長、根表面積和根體積。土壤中施入Streptomycessp. FXP04促進水稻種子萌發(fā)和幼苗生長的原因，除了Streptomycessp. FXP04可能分泌IAA，還可能與Streptomycessp. FXP04會溶磷、解鉀或產(chǎn)鐵載體有關(guān)[7]。有研究表明，白網(wǎng)鏈霉菌株P(guān)SPSA1能夠溶磷，提高牡丹根際土壤有效磷含量[20]；淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A有較強的產(chǎn)IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體的促生活性[21]；申枚靈等[22]從光果甘草（Glycyrrhiza glabra）分離的多株內(nèi)生鏈霉菌株能夠分泌IAA、具有產(chǎn)鐵載體的能力和溶磷能力；陳宇豐等[23]從香蕉根際分離到的鏈霉菌株M3-4解鉀率能達到20%。本研究中Streptomycessp.FXP04能否溶磷、解鉀或產(chǎn)鐵載體有待進一步研究。

從盆栽效果看，在生長處于穩(wěn)定期的Streptomycessp. FXP04菌液稀釋50倍和100倍對水稻種子萌發(fā)和幼苗生長具有相似的促進作用，說明該鏈霉菌株對水稻幼苗的生長有促進作用，可以作為潛在的生物菌肥。如果用該菌株制成生物菌肥，稀釋100倍有利于降低生產(chǎn)成本，但實踐應用中采用的稀釋倍數(shù)還需要進一步試驗。

4 結(jié)論

鏈霉菌株Streptomycessp. FXP04發(fā)酵液和菌液在合適的濃度下可提高水稻種子萌發(fā)率，其菌液在合適的濃度下能夠提高水稻幼苗的株高、干重、主根長、根總長度、須根數(shù)、根表面積和根總體積，說明Streptomycessp. FXP04對水稻種子萌發(fā)和幼苗生長有促進作用，可作為水稻的候選促生菌株開展后續(xù)研究和應用。