牛延菲，曹紅云，徐 怡，張曉南，王 鵬，蘇 鈦

(1 西南林業(yè)大學化學與工程學院，云南 昆明 650224；2 云南省藥物研究所，云南 昆明 650111)

雪上一枝蒿為毛茛科植物短柄烏頭的干燥塊根(拉丁名：AconitumbrachypodumDiels.)[1]。其味苦、辛，性溫，有大毒[1]，主產(chǎn)于云南北部的東川、會澤等地，具有祛風鎮(zhèn)痛的功效，用于治療風濕疼痛、跌打損傷等癥[2]。其化學成份包括生物堿和非生物堿兩大類[3-4]，其生物堿成分主要為二萜類生物堿[5-8]，國內(nèi)外學者[9-14]對雪上一枝蒿中生物堿成分進行了充分研究，發(fā)現(xiàn)了包括烏頭堿、雪上一枝蒿甲素等在內(nèi)的數(shù)十種生物堿；王洪云[4]、楊立國等[12]發(fā)現(xiàn)其非生物堿類成分有：β-谷甾醇、胡蘿卜苷、多糖等其他成分?，F(xiàn)代藥理試驗表明[15-17]，雪上一枝蒿具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗炎以及局部麻醉的藥理作用，另外還有抗生育[18]、抑制呼吸系統(tǒng)興奮的作用。

雪上一枝蒿為大毒藥材，《云南中藥志》言其：“本品有毒，未經(jīng)炮制，不宜內(nèi)服?！陛^準確地記載了其毒性。烏頭類中藥材毒性較強，須經(jīng)炮制后入藥。炮制后，烏頭類中藥材中的雙酯型烏頭堿會水解成毒性較小的單酯型烏頭堿[5]，雪上一枝蒿除含有烏頭堿等雙酯型生物堿外，雪上一枝蒿甲素亦是其主要化學成分，目前鮮有雪上一枝蒿炮制前后雪上一枝蒿甲素含量測定的相關文獻報道。

雪上一枝蒿甲素為二萜生物堿，作為雪上一枝蒿的主要活性成分，能夠抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗心律失常、強心、抗生育[19-21]。從化學結構分析，雪上一枝蒿甲素為醇胺型二萜生物堿。為考察雪上一枝蒿甲素受地理因素和炮制方法的影響程度，在建立準確可行的測定方法基礎上，對不同產(chǎn)地和不同炮制方式的雪上一枝蒿甲素含量進行測定和分析。此方法的開發(fā)，可為雪上一枝蒿的炮制工藝及飲片的質(zhì)量標準提高提供更加有利的依據(jù)和參考價值。

1 儀器與材料

美國Agilent 1100高效液相色譜儀：四元泵；DAD檢測器；自動進樣器；在線真空脫氣機；智能化柱溫箱及Agilent化學工作站；DHG-9037A電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；AB204-N型電子天平，梅特勒-托利多；AG285型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SK250HP超聲儀，上?？茖?。

雪上一枝蒿甲素(批號：110895-200404，純度以100%計)，購自中國食品藥品檢定研究院；色譜甲醇(批號：JA025830，色譜純)，德國默克；氨水，甲醇，三氯甲烷，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀均為分析純。

雪上一枝蒿藥材采自云南東川、會澤、麗江，由云南省研究所正高級工程師高麗鑒定為毛茛科植物短柄烏頭的干燥塊根。

2 方法與結果

2.1 方法建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xterra C18柱(5 μm，4.6×250 mm)；流動相：pH 7.3磷酸鹽緩沖溶液為流動相A，以甲醇為流動相B，按表1洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度

2.1.2 對照品溶液的制備

精密取甲素對照品適量，置于25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備

取本品粉末1.5 g，精密稱定，置150 mL錐形瓶中，加1 mL氨試液，再精確移入50 mL三氯甲烷，回流2小時(80 ℃)，放至室溫，用快速濾紙過濾，殘渣洗滌4次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓蒸干(40 ℃以下)，殘渣用甲醇定容至25 mL量瓶，混勻后，濾過，即得。

2.1.4 專屬性與系統(tǒng)適用性

取供試品溶液和對照品溶液，同時準備空白溶液和加標溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣。結果見圖1。由圖1可以看出供試品溶液與對照品溶液中雪上一枝蒿甲素在相同位置出峰，且空白溶液對含量測定無干擾，色譜峰的理論塔板數(shù)，分離度，對稱因子均符合要求，表明本法具有良好的專屬性和系統(tǒng)適用性。

圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

2.1.5 線性關系

精密稱取雪上一枝蒿甲素對照品適量(10.30 mg)，置25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL含0.1030 mg的儲備液。精密吸取該儲備液，逐級稀釋，稀釋濃度見表2，按“2.1.1”色譜條件進樣，記錄峰面積。以含量(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，得回歸方程Y=674.37X+13.588，r =0.9999。結果表明，在上述色譜條件下，雪上一枝蒿甲素在0.0515～10.3000 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 線性關系考察結果

2.1.6 儀器精密度

取同一對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣，連續(xù)進樣6針，記錄峰面積計算相對標準偏差(RSD)，RSD值為0.5%(n=6)，結果表明儀器具有良好的精密度。

2.1.7 重復性試驗

精密稱取飲片6份，按供試品制備方法制備，按“2.1.1”項色譜條件進樣。記錄峰面積計算相對標準偏差(RSD)，RSD值為0.7%(n=6)，結果表明本法的重復性較好。

2.1.8 檢測限和定量限試驗

取“2.1.5”項下雪上一枝蒿甲素對照品溶液適量，以甲醇稀釋配制成一系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，分別以3倍和10倍信噪比作為指標，考察檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，結果檢測限為0.02575 μg，定量限為0.0515 μg。

2.1.9 準確度試驗

精密取雪上一枝蒿甲素對照品適量(26.00 mg)，置入25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含1.04 mg的溶液，即得。

精密稱取9份供試品(已知含量為0.2859%)，每份約0.75 g，分別加上述對照品溶液1 mL、1 mL、1 mL、2 mL、2 mL、2 mL、3 mL、3 mL、3 mL，然后按供試品制備方法制備，按“2.1.1”項色譜條件進樣，計算回收率。結果見表3，回收率在93.57%～100.55%之間，RSD值為3.0%(n=9)，回收率良好。

表3 加樣回收試驗

2.1.10 溶液穩(wěn)定性試驗

對溶液穩(wěn)定性做了考察，取制備好的供試品溶液，按“2.1.1”項分別于0、2、6、8、16、24小時進樣，以峰面積計算，RSD值為2.9%(n=6)，說明樣品在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 樣品測定

2.2.1 不同產(chǎn)地藥材含量測定

取不同產(chǎn)地的15批藥材，按“2.1.3”項制備，按“2.1.1”項測定，結果見表4。結果表明，云南東川、會澤、麗江產(chǎn)區(qū)的雪上一枝蒿甲素含量在0.09%～0.33%之間，不同產(chǎn)地不同批次藥材雪上一枝蒿甲素含量存在一定差異。

表4 15批樣品測定結果

2.2.2 不同炮制方式含量測定

雪上一枝蒿為大毒藥材，《云南中藥志》言其：“本品有毒，未經(jīng)炮制，不宜內(nèi)服?！陛^準確地記載了其毒性。國內(nèi)外學者對其炮制進行了大量研究，江林等對不同產(chǎn)地和不同炮制方法的雪上一枝蒿的總堿含量作了實驗對比，發(fā)現(xiàn)水煮是最優(yōu)的炮制方式。在實際生產(chǎn)中，考慮到安全和提取效果，多在投料前進行蒸煮炙，雪上一枝蒿藥材中含有大量的雙酯型生物堿，在進行蒸煮炙時，會轉(zhuǎn)變成單酯型生物堿，以達到減毒增效的目的。

為考察不同炮制方式對雪上一枝蒿甲素含量的影響，對藥材進行蒸(蒸至透心)、煮(煮至透心)、高壓(121 ℃炮制15 min)炮制，使用不同溫度(50 ℃、60 ℃、75 ℃、100 ℃、130 ℃、150 ℃)進行干燥，得18批雪上一枝蒿飲片，使用經(jīng)驗證的方法測定雪上一枝蒿甲素含量。

檢測結果見表5。根據(jù)檢測結果炮制前后含量變化不顯著，說明雪上一枝蒿甲素不易受炮制工藝影響，該結論與其化學性質(zhì)相吻合(醇胺型二萜生物堿，無酯基，不易水解)。

表5 不同炮制方法含量測定結果

3 結 論

雪上一枝蒿中主要化學成分為二萜生物堿，也是其毒性成分，生物堿在煎煮后毒性也會顯著變小，其過程為烏頭堿在煎煮條件下可水解生成毒性更小的次烏頭堿，若繼續(xù)煎煮次烏頭堿可進一步發(fā)生水解成具有更小毒性的烏頭原堿。雪上一枝蒿甲素屬于二萜生物堿，能夠抗炎鎮(zhèn)痛，為雪上一枝蒿的主要活性成分。目前，全國沒有統(tǒng)一的雪上一枝蒿炮制規(guī)范工藝，為考察雪上一枝蒿甲素是否會受到地理因素和炮制方法的影響，研究建立了準確可行的飲片中雪上一枝蒿甲素測定方法，比較了云南東川、會澤、麗江三個產(chǎn)區(qū)的藥材含量差異，同時考察民間常用的炮制方式對其含量的影響。

研究結果表明，所建立的雪上一枝蒿甲素的測定方法，專屬性、線性、準確度、精密度、檢測限及耐用性均符合規(guī)定，易操作，準確度高；使用經(jīng)方法學驗證的檢測方法，對采自云南東川、會澤、麗江的不同批次藥材進行了甲素含量測定，數(shù)據(jù)結果表明，不同產(chǎn)地不同批次藥材中的雪上一枝蒿甲素含量存在一定差異；考察了蒸、煮、高壓炮制后不同溫度干燥的雪上一枝蒿甲素含量變化，數(shù)據(jù)結果表明，不同炮制方式雪上一枝蒿甲素無顯著變化，說明雪上一枝蒿甲素不易受炮制工藝影響，該結論與其化學性質(zhì)相吻合(醇胺型二萜生物堿，無酯基，不易水解)。