楊敏芬，盤振杰

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣西 崇左 532200)

大豆苷元是一種天然性的植物雌性激素的異黃酮類化合物。主要具有降低腫瘤、抗血栓、抗缺氧缺血、骨骼保護(hù)、抗心血管病、抑制癌細(xì)胞的生長和促進(jìn)骨細(xì)胞的生成等生理活性方面藥理作用。因此大豆苷元常常作為藥品用藥和食品補(bǔ)充劑被廣泛的應(yīng)用[1-2]。但是因?yàn)榇蠖管赵@類異黃酮化合物自身的水溶性和脂溶性是比較相對較差，其自身的穩(wěn)定性也是比較低，而且其口服吸收的能力較差，體內(nèi)吸收的效果也是不太理想，從而導(dǎo)致了大豆苷元這類異黃酮化合物在生活方面的利用率不高，大大地影響了大豆苷元這類異黃酮化合物在醫(yī)藥制劑上和食品補(bǔ)充劑上的應(yīng)用[3-4]。

環(huán)糊精(Cyclodextrins)又可以被稱為Schardinger糊精是一類環(huán)狀型寡糖的總糖，研究表明環(huán)糊精基本的分子結(jié)構(gòu)的形狀呈截形圓筒。環(huán)糊精這一種環(huán)狀低聚糖主要是由1→4糖苷鍵(主要以6-8個(gè)葡萄糖分子為主)鏈接而成的從而具有“內(nèi)疏水外親水”這種特殊的結(jié)構(gòu)性質(zhì)[5-7]。其中β-環(huán)糊精有著非常特殊的包合作用在許多藥物上，所以在藥物輔料中有著非常重要的應(yīng)用。

本文以大豆苷元、β-環(huán)糊精和1,4-丁二胺為原料，制備大豆苷元-1,4-丁二胺單修飾β-環(huán)糊精包合物，并借助掃描電鏡(SEM)、紅外光譜(IR)等方法對成功制備出的包合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。通過紫外可見分光光度計(jì)測定大豆苷元與1,4-丁二胺單修飾β-環(huán)糊精的結(jié)合常數(shù)以及大豆苷元-1,4-丁二胺單修飾β-環(huán)糊精包合物的溶解性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

β-環(huán)糊精(BR級)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；對甲苯磺酰氯(AR級)，上海精純生化科技股份有限公司；1,4-丁二胺(98%)，上海精純生化科技股份有限公司；大豆苷元，上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

DHG-9140A干燥箱，上海元析儀器有限公司；UV-6102S紫外光譜儀，上海元析儀器有限公司；EVO-18掃描電鏡，上海恒球儀器設(shè)備有限公司；IR PerkinElmer-65紅外光譜，鉑金埃爾默儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 修飾β-環(huán)糊精的制備

準(zhǔn)確量取10 mL 1,4-丁二胺與2.5000～3.0000 g Tosylate于三頸燒瓶中在60 ℃條件下用磁力攪拌下攪拌6～7 h后，停止反應(yīng)。將上述溶液加入丙酮溶液中攪拌，產(chǎn)生大量的白色沉淀，重復(fù)上述過程三次可得到最終產(chǎn)品。即得到1,4-丁二胺單修飾β-環(huán)糊精(修飾環(huán)糊精)。合成的路線如圖1所示。

圖1 修飾β-環(huán)糊精的合成路線

1.2.2 大豆苷元與修飾環(huán)糊精包合物的制備

在室溫下稱取76.0 mg(0.3 mmol)大豆苷元于100 mL三頸燒瓶中，用6 mL的無水乙醇溶液使之完全溶解，同時(shí)滴加1,4-丁二胺單修飾β-環(huán)糊精180.8 mg (0.15 mmol)水溶液至三頸燒瓶中，使兩種溶液充分混合。攪拌約5 h之后，用0.45 μm微孔濾膜將溶液過濾之后將濾液置于40～45 ℃真空烘箱中烘大約24 h左右，即得到固體包合物。

1.2.3 大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

稱取1.3 mg溶于無水乙醇溶，定容于10 mL容量瓶。分別移取上述已經(jīng)配制好的溶液70、140、210、280、350、420 μL于5 mL的容量瓶中并用無水乙醇溶液進(jìn)行定容。得到溶液的溶度分別為0.7、1.4、2.1、2.8、3.5、4.2(10-5mol/L)，采用紫外光譜分別測定上述配制好的溶液在200～600 nm處的吸光度值。取λdaidzein=250 nm處的吸光度值(Abs)作為橫坐標(biāo)，大豆苷元溶液的濃度(Cdaidzein)作為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.4 主客體之間穩(wěn)定常數(shù)的測定

稱取6.1 mg修飾β-環(huán)糊精溶于蒸餾水中，定容于10 mL容量瓶。得到所需主體溶液。移取主體溶液210、280、350、420、490、560、630、700 μL于5 mL的容量瓶后，向其加入已經(jīng)配制好的大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液200 uL，并用已經(jīng)配制好的乙醇溶液(無水乙醇溶液：水=3：2)定容至5 mL，用紫外光譜分別測定上述配制好的溶液在200～600 nm處的吸光度值。

1.2.5 水溶性的測定

往離心管中加入0.5 mL二次蒸餾水，逐漸加入包合物直至形成飽和溶液。用紫外可見光譜測定其吸光度值。取λdaidzein=250 nm時(shí)的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)的工作曲線并計(jì)算出其溶解度。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖2可知，在同一波長下吸光度值隨著大豆苷元乙醇溶液濃度的增大是逐漸增大的。取波長λ(daidzein)=250 nm處的吸光度值(Abs)作為縱坐標(biāo)，大豆苷元的濃度(Cdaidzein)作為為橫坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。由圖2可知，大豆苷元的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為Adaidzein=0.4137S-0.0248(R2=0.99476)。

圖2 大豆苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 修飾β-環(huán)糊精與大豆苷元之間穩(wěn)定常數(shù)的分析

由圖3可知，隨著修飾β-環(huán)糊精濃度的不斷增加，大豆苷元的吸光度值也隨之逐漸增大，表明修飾β-環(huán)糊精與大豆苷元形成了包合物。取λ=250 nm處的吸光度值作擬合曲線，線性關(guān)系較好，擬合曲線方程為y=4.1442S+0.5323(R2=0.99637)。根據(jù)線性擬合曲線方程，可以求出修飾β-環(huán)糊精與大豆苷元的結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)Ks。

圖3 穩(wěn)定常數(shù)圖

因?yàn)橹黧w(修飾β-環(huán)糊精)與客體(大豆苷元)之間的包合比為1：1，所以修飾β-環(huán)糊精與大豆苷元的反應(yīng)過程滿足下列計(jì)算公式：

(1)

式中，[H]0為主體的初始濃度；[G]0為客體大豆苷元的初始濃度；α為紫外可見光譜的敏感因子；ΔIA為加入主體前后客體大豆苷元的相對熒光強(qiáng)度。以[H]0[G]0/ΔIA作為縱坐標(biāo)，[H]0作為橫坐標(biāo)作圖，作出的圖形如圖3所示的線性擬合曲線。由圖3的線性擬合曲線可知主體與客體大豆苷元的包合過程呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系，這表明了主體與客體大豆苷元之間的包合比為1：1。

根據(jù)圖3的線性擬合曲線的斜率與截距并結(jié)合式(1)，可以計(jì)算得出主體與客體大豆苷元之間的結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)為：Ks=1.6×105(M-1)。

2.3 紅外光譜分析(IR)

在圖4中，a為主體(修飾β-環(huán)糊精)，b為客體(大豆苷元)，c為包合物(大豆苷元-修飾β-環(huán)糊精包合物)。如圖4a所示，主體的主要特征吸收峰呈現(xiàn)在3400 cm-1、2930 cm-1和1640～950 cm-1處，如圖4b所示，在3415 cm-1、2912 cm-1和1600～930 cm-1三處出現(xiàn)了客體大豆苷元的主要特征吸收峰，如圖4c所示大豆苷元-4修飾β-環(huán)糊精包合物在3400 cm-1的特征峰產(chǎn)生了比較微弱的藍(lán)移，且在2912 cm-1處出現(xiàn)了客體大豆苷元的特征吸收峰。形成包合物后，客體大豆苷元在2912 cm-1處的特征吸收峰的強(qiáng)度比之前的稍微減弱，在1300～1200 cm-1處原來存在的特征吸收峰消失了，綜合以上所述的現(xiàn)象均可以表明主體已經(jīng)和客體大豆苷元形成包合物。

圖4 紅外光譜

2.4 掃描電鏡分析(SEM)

如圖5所示，大豆苷元、修飾β-環(huán)糊精、大豆苷元-修飾β-環(huán)糊精包合物的SEM圖。從圖5a中可以看出客體大豆苷元分布比較集中，主要呈現(xiàn)出不規(guī)則的條狀形結(jié)構(gòu)；圖5b中修飾β-環(huán)糊精分布比較散亂，主要呈現(xiàn)出粘稠感的球狀形結(jié)構(gòu)(有小塊狀依附著)；圖5c中明顯可以看出大豆苷元-修飾β-環(huán)糊精包合物是既不同于客體大豆苷元的不規(guī)則的條狀形結(jié)構(gòu)，也不是同于主體修飾β-環(huán)糊精粘稠狀的球狀形結(jié)構(gòu)的棱角分明的大塊狀結(jié)構(gòu)(如圖5c所示)，并且也不是主體與客體兩種物質(zhì)簡單混合后的形狀外貌。綜合以上現(xiàn)象所述證明大豆苷元-修飾β-環(huán)糊精包合物已經(jīng)形成。

圖5 掃描電鏡圖(SEM)

2.5 大豆苷元-1,4-丁二胺單修飾β-環(huán)糊精包合物水溶性的測定

根據(jù)25 ℃時(shí)，客體大豆苷元的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：

Adaidzein=0.4137S-0.0248(R2=0.99476)

3 結(jié) 論

本文首先以β-環(huán)糊精和對甲苯磺酰氯為原料制備出Tosylate；然后以1,4-丁二胺對Tosylate進(jìn)行修飾，形成1,4-丁二胺單修飾β-環(huán)糊精，采用溶液攪拌法，成功制備出了大豆苷元-1,4-丁二胺單修飾β-環(huán)糊精包合物，并借助掃描電鏡(SEM)、紫外光譜儀和紅外光譜(IR)等方法對包合進(jìn)行表征。從而確定了我們成功制備出包合物。其次運(yùn)用紫外光譜研究了主體與客體大豆苷元之間的相互作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在25 ℃時(shí)，主體與客體大豆苷元的結(jié)合常數(shù)為Ks=1.6×105M-1。最后，大豆苷元-修飾β-環(huán)糊精包合物的水溶性進(jìn)行了探究。根據(jù)水溶性的實(shí)驗(yàn)研究表明，形成包合物之后，大豆苷元的水溶性明顯提高了8.48倍。