康慧芳，喬勇進(jìn)*，劉晨霞，張 怡，孫大鵬

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.上海農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工工程技術(shù)研究中心，上海 201403）

葡萄是一種高營養(yǎng)水果，果實富含大量的糖、有機酸、維生素、各種礦物質(zhì)以及人體所需的氨基酸等，集食療、醫(yī)用、美容和商業(yè)價值于一身[1]，深受廣大消費者的青睞。然而葡萄是不耐貯藏的水果之一，果實皮薄、汁多、肉軟，采后極易受病原微生物侵染[2]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，交鏈孢霉腐病是最為突出的采后病害之一，其主要致病菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata），其對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)能力強，生長繁殖快，嚴(yán)重影響寄主的質(zhì)膜透性、酶活性、激素平衡及其他生理代謝過程，從而造成果實大量腐爛[3-4]。

目前，已有許多研究者將L-半胱氨酸應(yīng)用于葡萄交鏈孢霉腐病的防治，例如那他霉素可以抑制葡萄采后交鏈孢菌引起的腐爛變質(zhì)[5]；二氧化硫可以抑制交鏈孢菌的孢子萌發(fā)、菌落生長及其所引起的葡萄腐爛率[6]；臭氧處理可導(dǎo)致互隔交鏈孢菌菌絲的干癟萎縮和孢子凹陷褶皺，導(dǎo)致其致病力減弱[7]；芽孢桿菌發(fā)酵液產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體亦能明顯抑制鏈格孢菌的生長[8]；L-谷氨酸對番茄果實的交鏈孢霉腐病也有防治作用[9]。但現(xiàn)階段仍然需要尋找更安全、更有效、更經(jīng)濟(jì)、更便捷的新型殺菌劑替代品來控制由交鏈孢霉腐病引起的采后果實爛果現(xiàn)象。

L-半胱氨酸是組成體蛋白質(zhì)的氨基酸中唯一一種含有巰基的親水性氨基酸[10]，也是一種還原劑，能夠通過改變蛋白質(zhì)分子之間和內(nèi)部的二硫鍵減弱蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)伸展開，具有多種藥理功效[11]，包括抗氧化和抗炎作用，在生物化學(xué)、醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等行業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用[12]，國內(nèi)外需求量也逐年增長。Kyung等研究表明S-甲基-L-半胱氨酸亞砜能夠有效清除蕓苔屬蔬菜中的氧自由基，具有殺菌作用[13]。Zhou Xiran等認(rèn)為L-半胱氨酸是一種非競爭性的有效抑制劑，能夠有效抑制黃果梨多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性，防止梨汁加工過程中的酶褐變反應(yīng)[14]。廖春麗等研究表明，L-半胱氨酸對馬鈴薯、蘋果和甘薯PPO活性抑制作用明顯，且隨著L-半胱氨酸濃度增大，酶活力降低幅度越大[15]。Hamza等研究表明L-半胱氨酸對氧化組織損傷具有保護(hù)作用，能夠提高脂質(zhì)的水平，增加酶的抗氧化活性，降低脂質(zhì)過氧化程度[16]。但關(guān)于L-半胱氨酸應(yīng)用于葡萄交鏈孢霉腐病的研究還鮮有報道。本研究旨在探討L-半胱氨酸處理對離體鏈格孢菌的抑制作用及抑菌機理，并在葡萄果實上接種驗證，為L-半胱氨酸處理在葡萄貯藏保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

葡萄鏈格孢菌來源于華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，于PDA培養(yǎng)基中4 ℃冰箱保存。

‘巨峰’葡萄購自上海市奉賢區(qū)嘉園路87號水果店，挑選色澤、大小一致，且無機械損傷、無病蟲害的果實，購買當(dāng)天裝在水果泡沫箱中運回（4.0±0.5）℃的冷庫中預(yù)冷并貯藏保存。

L-半胱氨酸、乙酸、無水乙酸鈉、領(lǐng)苯二酚、過氧化氫、愈創(chuàng)木酚、吐溫-80、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose ager，PDA）培養(yǎng)基、無水乙醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 美國安馬西亞公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 日本托米公司；CA-1480超凈工作臺 上海上凈凈化設(shè)備有限公司；D37520 Osterode高速冷凍離心機德國Biofuge公司；水浴鍋 上海一恒科技有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海益恒實驗儀器有限公司；打漿機 廣東美的生活電器制造有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；血球計數(shù)板 上海求精生化儀器有限公司；倒置顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備

將在冰箱保存的鏈格孢菌取出，于25 ℃ PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用含0.05%吐溫-80的無菌水沖洗平板洗下孢子，并用血球計數(shù)板調(diào)整至濃度為1.0×106個/mL的孢子懸浮液備用。

1.3.2 實驗處理

1.3.2.1 離體實驗

將PDA經(jīng)滅菌后冷卻至45 ℃左右，加入量的L-半胱氨酸混勻，制成L-半胱氨酸質(zhì)量濃度為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 g/L和3.0 g/L的PDA培養(yǎng)基，以不加入任何藥劑的PDA培養(yǎng)基為對照組。每組處理設(shè)置3 個重復(fù)，平板凝固后，移液槍取20 μL菌懸液滴在PDA培養(yǎng)基中央，室溫條件下放置4 h后放入25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測定一組數(shù)據(jù)，直至對照組菌落長滿培養(yǎng)皿。

1.3.2.2 活體接種實驗

選擇外觀整齊、無病蟲害和機械損傷的葡萄果實，先用自來水將果面沖洗干凈，然后用體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，接著用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液浸泡1 min，再用無菌水沖洗3 次，晾干后用無菌剪刀剪下葡萄果實（保留果梗）。無菌接種針在葡萄赤道部刺深約3 mm，滴入10 μL菌懸液，室溫（25±1）℃條件下放置4 h后，以離體菌菌落生長的研究結(jié)果為依據(jù)，選取質(zhì)量濃度分別為1.6、2.0、2.4、2.8 g/L的無菌L-半胱氨酸溶液用移液槍攝入10 μL至上述針刺部位，并于室溫（25±1）℃條件下放置4 h，之后放置在25 ℃培養(yǎng)箱中貯藏。每3 d測定葡萄果實病斑直徑和病斑率，直至病原菌布滿果面，其他指標(biāo)在貯藏結(jié)束時測定。每個處理組取50 粒葡萄，設(shè)置3 個重復(fù)。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1L-半胱氨酸對離體鏈格孢菌菌落生長的抑制作用

用十字交叉法統(tǒng)計每天鏈格孢菌的菌落直徑，并計算第6天的菌落生長抑制率，具體計算見公式（1）。

1.3.3.2 鏈格孢菌菌絲形態(tài)的觀察

分別在含不同質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基上滴20 μL濃度為1.0×106個/mL的鏈格孢菌菌懸液，以不加任何藥劑為對照處理。室溫下放置2 h待菌懸液晾干，然后放置在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用無菌刀在中央位置取2 cm×2 cm×2 cm的培養(yǎng)基小塊，制成玻片在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每一個玻片取不同的7 個視野觀察并拍照，每組設(shè)置3 個重復(fù)。

1.3.3.3 鏈格孢菌芽管伸長抑制率的測定

按1.3.3.2節(jié)相同方法取2 cm×2 cm×2 cm的培養(yǎng)基小塊，在倒置顯微鏡下觀察并用顯微鏡上的測量尺測量每一組芽管的長度并記錄。芽管伸長抑制率計算見公式（2）。

1.3.3.4 鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制率的測定

將1.0×106個/mL鏈格孢菌菌懸液接種到L-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d后，用直徑為0.6 cm的打孔器在培養(yǎng)皿邊緣取3 個菌碟，無菌水洗下孢子并用托馬計數(shù)池進(jìn)行計數(shù)，每組處理重復(fù)3 次，通過公式（3）計算孢子萌發(fā)抑制率。

1.3.3.5 葡萄果實發(fā)病率、質(zhì)量損失率和落果率的測定

病斑直徑采用十字交叉法測定，取平均值；病斑直徑若大于0.5 mm則確定為發(fā)病，發(fā)病率計算見公式（4）。在貯藏前后稱果實質(zhì)量，并按公式（5）計算果實的質(zhì)量損失率。統(tǒng)計果梗的腐爛程度，果梗發(fā)生霉變?yōu)楦癄€，未發(fā)生霉變?yōu)檎?，果梗腐爛率的計算見公式（6）。另外，果實在貯藏期會出現(xiàn)落果現(xiàn)象，即果梗和果實發(fā)生分離的現(xiàn)象，落果率計算見公式（7）。

1.3.3.6 抗性酶活力的測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力測定采用愈創(chuàng)木酚法[17]；PPO活力的測定采用鄰苯二酚比色法[17]；丙二醛含量、CAT活力、SOD活力采用試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，并用Origin 8.0軟件作圖，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著分析（方差分析），P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-半胱氨酸處理對鏈格孢菌菌落生長的影響

由表1可以看出，與對照組相比，各質(zhì)量濃度L-半胱氨酸處理對鏈格孢菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，且在0～2.8 g/L范圍內(nèi)，隨著L-半胱氨酸質(zhì)量濃度的增加，對鏈格孢菌菌絲生長的抑制效果逐漸增強，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組菌絲生長抑制率最大，L-半胱氨酸質(zhì)量濃度超過2.8 g/L后，其對鏈格孢菌菌絲生長的抑制效果減弱。另外，對照組鏈格孢菌菌絲基本長滿培養(yǎng)基表面，菌絲顏色較深，偏向暗褐色，且隨著L-半胱氨酸質(zhì)量濃度的增大，鏈格孢菌菌落直徑減小，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的菌餅直徑最小。培養(yǎng)第6天時，與其他各組比較，2.8 g/LL-半胱氨酸處理組菌落直徑僅為0.25 cm，抑制率最高（95.96%）。由此表明L-半胱氨酸能夠有效抑制鏈格孢菌菌絲生長，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理的效果最好。

表1 L-半胱氨酸對鏈格孢菌菌落生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of L-cysteine on colony growth of Alternaria alternate

2.2 L-半胱氨酸處理對鏈格孢菌孢子萌發(fā)及芽管伸長的抑制作用

將鏈格孢菌菌懸液滴入含有不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察，含0.4～1.0 g/LL-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基中可以清晰觀察到鏈格孢菌孢子萌發(fā)且有芽管伸長現(xiàn)象，而L-半胱氨酸質(zhì)量濃度大于1.0 g/L的PDA培養(yǎng)基中均未明顯觀測到孢子萌發(fā)及芽管伸長。由圖1可知，L-半胱氨酸對鏈格孢菌的孢子萌發(fā)具有顯著抑制作用，0.4、0.6、0.8 g/L和1.0 g/LL-半胱氨酸處理組的孢子萌發(fā)抑制率分別為6.73%、11.68%、21.64%和37.87%，1.0 g/LL-半胱氨酸處理組孢子萌發(fā)抑制率顯著高于其他處理組（P＜0.05），說明高質(zhì)量濃度L-半胱氨酸對鏈格孢菌的孢子形成抑制率效果顯著。由圖2可知，與對照組相比，不同質(zhì)量濃度（0.4～1.0 g/L）的L-半胱氨酸對鏈格孢菌芽管伸長均有不同程度的抑制作用。其中，1.0 g/L的L-半胱氨酸處理組芽管長度僅為16.31 μm，抑制率高達(dá)81.30%，顯著高于其他各組（P＜0.05）。由此可得，L-半胱氨酸質(zhì)量濃度越高，對鏈格孢菌芽管伸長的抑制效果越好。

圖1 L-半胱氨酸質(zhì)量濃度對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of L-cysteine on spore germination of A.alternata

圖2 L-半胱氨酸質(zhì)量濃度對鏈格孢菌芽管伸長的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of L-cysteine on germ tube elongation of A.alternate

2.3 L-半胱氨酸處理對鏈格孢菌菌絲形態(tài)的影響

圖3 鏈格孢菌經(jīng)L-半胱氨酸處理后倒置顯微鏡觀察結(jié)果Fig.3 Inverted microscopic observation of A.alternate treated with L-cysteine

將培養(yǎng)24 h的各處理組培養(yǎng)基置于倒置顯微鏡下觀察，質(zhì)量濃度高于1.0 g/L的L-半胱氨酸處理組均未清晰觀察到鏈格孢菌菌絲的形態(tài)，而質(zhì)量濃度低于1.0 g/L的L-半胱氨酸處理組均能不同程度觀察到菌絲形態(tài)的變化。如圖3所示，與對照組相比，經(jīng)L-半胱氨酸培養(yǎng)的鏈格孢菌菌絲密集程度下降，且隨著L-半胱氨酸質(zhì)量濃度的增加，菌絲密集程度下降越明顯，經(jīng)0.8、1.0 g/LL-半胱氨酸處理的鏈格孢菌菌絲表面粗糙且出現(xiàn)溝壑。說明L-半胱氨酸處理對鏈格孢菌菌絲造成了損傷，且高質(zhì)量濃度L-半胱氨酸可以更明顯抑制鏈格孢菌菌絲生長。

2.4 L-半胱氨酸處理對接種鏈格孢菌后葡萄病害和貯藏品質(zhì)的影響

如圖4所示，貯藏到第15天時，對照組果實表面被一層灰色菌絲覆蓋，病斑直徑顯著大于各處理組（P＜0.05），且能明顯看出病斑邊緣軟化腐爛以及果梗表面有菌絲環(huán)繞的現(xiàn)象，而2.8 g/L處理組果實感染病害的程度很小，只能看到少量的菌絲出現(xiàn)，且葡萄果實保持色澤鮮亮，果梗緊緊銜接果實，沒有出現(xiàn)脫落及病害現(xiàn)象。由此說明，高質(zhì)量濃度L-半胱氨酸處理能夠有效抑制葡萄交鏈孢霉腐病的感染。

圖4 L-半胱氨酸處理15 d后葡萄交鏈孢霉腐病的發(fā)病情況Fig.4 Morbidity of Alternaria alternata rot at 15 days after L-cysteine treatment

圖5 L-半胱氨酸對葡萄交鏈孢霉腐病病斑直徑（A）和發(fā)病率（B）的影響Fig.5 Effect of L-cysteine on lesion diameter (A) and incidence (B) of Alternaria alternata

由圖5A可知，葡萄果實病斑直徑隨貯藏時間的延長而迅速擴(kuò)展，呈逐漸上升的趨勢。接種鏈格孢菌第3天開始，各處理組病斑直徑均顯著低于對照組（P＜0.05），其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的病斑直徑最小，在第15天時僅為0.66 cm，顯著低于其他各組（P＜0.05），說明質(zhì)量濃度為2.8 g/L的L-半胱氨酸處理的抑制效果最好。

如圖5B所示，巨峰葡萄接種鏈格孢菌后逐漸開始染病，接種第3～6天，各L-半胱氨酸處理組的發(fā)病率顯著低于對照組（P＜0.05），接種第15天，對照組和1.6、2.0 g/LL-半胱氨酸處理組的發(fā)病率均達(dá)到100%，而質(zhì)量濃度為2.8 g/LL-半胱氨酸處理組僅為75%，顯著低于其他各組（P＜0.05），綜上說明質(zhì)量濃度為2.8 g/L的L-半胱氨酸能顯著降低葡萄采后交鏈孢霉腐病的發(fā)病率。

圖6 L-半胱氨酸處理對葡萄貯藏品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of L-cysteine treatment on storage quality of grapes

由圖6可以看出，不同質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸均能顯著抑制果實品質(zhì)的下降，且2.8 g/LL-半胱氨酸處理的效果最好，該組的果梗腐爛率、落果率、質(zhì)量損失率分別僅為20.83%、4.2%、2.54%，對照組果實質(zhì)量損失率達(dá)到5.25%。

2.5 L-半胱氨酸處理對接種鏈格孢菌的葡萄果實中MDA含量的影響

圖7 L-半胱氨酸處理對葡萄果實中MDA含量的影響Fig.7 Effect of L-cysteine treatment on MDA content of grape fruit

如圖7所示，接種鏈格孢菌后，葡萄果實內(nèi)的MDA含量均呈上升趨，這是由于果實損傷導(dǎo)致。經(jīng)L-半胱氨酸處理的果實MDA含量均低于對照組，經(jīng)2.8 g/LL-半胱氨酸處理的葡萄果實在第15天MDA含量僅為41.39 nmol/g，顯著低于其他處理組（P＜0.05），說明高質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸處理能夠有效減緩果實內(nèi)部自由基對細(xì)胞膜的損傷。

2.6 L-半胱氨酸處理對接種鏈格孢菌的葡萄果實POD和PPO活力的影響

由圖8A可知，各組葡萄在貯藏過程中POD活力均呈上升趨勢，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組急劇上升，且總體上顯著高于其他各組（P＜0.05），在接種的第15天達(dá)到1.60 U/g，是對照組的3.56 倍，說明2.8 g/LL-半胱氨酸能夠促使果實保持較高的POD活力。

由圖8B可知，接種鏈格孢菌后，各組葡萄果實的PPO活力在前6 d上升較快，基本為直線上升趨勢，6～9 d略微下降后又逐漸上升，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的PPO活力貯藏期間一直顯著高于其他各組（P＜0.05），在接種第15天為2.00 U/g，是對照組的1.87 倍；綜上說明高質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸能夠更快誘導(dǎo)果實PPO活力的上升，并促使PPO活力保持在較高水平。

圖8 L-半胱氨酸處理對葡萄果實中POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig.8 Effect of L-cysteine treatment on peroxidase (A) and polyphenol oxidase (B) activities of grape fruit

2.7 L-半胱氨酸處理對接種鏈格孢菌的葡萄果實CAT和SOD活力的影響

SOD是漿果中普遍存在的抗氧化酶類，它能將超氧陰離子歧化為過氧化氫和氧氣，從而起到清除活性氧、維持活性氧平衡、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用[18-19]。如圖9A所示，接種鏈格孢菌后，各組葡萄果實SOD活力在貯藏期間均出現(xiàn)了不同程度的升降變化，且都在第6天時達(dá)到了高峰，但2.8 g/LL-半胱氨酸處理組果實中的SOD活力始終保持最高水平，第6天時達(dá)到61.95 U/g，顯著高于其他各組（P＜0.05），貯藏期第15 天時，L-半胱氨酸處理組的SOD活力達(dá)到48.57 U/g，是對照組的1.47 倍。綜上說明，高質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸能保持葡萄較高的SOD活力。

CAT是果實后熟衰老中的保護(hù)性酶類，它能催化果蔬體內(nèi)積累的H2O2分解，從而減少H2O2對果蔬組織造成的傷害[20-21]。由圖9B可知，接種鏈格孢菌后，各組葡萄果實CAT活力前期（0～6 d）均呈先下降后上升的趨勢，第6天時，2.8 g/LL-半胱氨酸處理組CAT活力顯著高于其他各組（P＜0.05），達(dá)到0.89 U/g。貯藏6 d后，各組CAT活力開始緩慢下降，其中對照組下降速度最快，而2.8 g/LL-半胱氨酸處理組下降速度相對較慢，第15天時，2.8 g/L處理組的CAT活力仍最高（0.59 U/g），是對照組的3.11 倍。由此表明，質(zhì)量濃度為2.8 g/L的L-半胱氨酸能夠有效促進(jìn)H2O2的清除效率。

圖9 L-半胱氨酸處理對葡萄果實SOD（A）和CAT（B）活力的影響Fig.9 Effect of L-cysteine treatment on superoxide dismutase (A) and catalase (B) activities of grape fruit

3 討 論

研究不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸對離體鏈格孢菌的抑制效果，結(jié)果表明L-半胱氨酸的質(zhì)量濃度越大，抑菌效果越好。令陽等[22]研究發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸處理可以顯著延緩褐腐菌孢子的萌發(fā)，抑制菌絲體生長，增加褐腐菌菌絲體胞外電導(dǎo)率和核酸物質(zhì)的釋放量，破壞褐腐菌孢子細(xì)胞膜的完整性。本實驗采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法測定了不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸對鏈格孢菌的影響，結(jié)果表明，高質(zhì)量濃度L-半胱氨酸能夠顯著抑制鏈格孢菌的菌絲生長和芽管伸長，延緩孢子萌發(fā)，培養(yǎng)24 h后，1.0 g/LL-半胱氨酸處理組的芽管長度僅為16.31 μm，芽管伸長抑制率高達(dá)81.30%，而質(zhì)量濃度高于1.0 g/L的L-半胱氨酸處理組均未能清晰觀察到鏈格孢菌孢子的萌發(fā)狀態(tài)，且培養(yǎng)到第6天，2.8 g/LL-半胱氨酸組的菌落生長抑制率高達(dá)95.96%。另外，從菌絲生長形態(tài)來看，1.0 g/LL-半胱氨酸處理組的鏈格孢菌菌絲密集程度很小，在顯微鏡下菌絲內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)凝集，菌絲空洞化、發(fā)黑變粗、萎縮，原生質(zhì)體滲漏，而高于1.0 g/LL-半胱氨酸處理組均未觀察到菌絲形態(tài)的變化。綜上表明，相比對照組，2.8 g/LL-半胱氨酸處理組孢子萌發(fā)的時間最晚，且培養(yǎng)到第6天，菌落直徑才僅為0.25 cm，由此可得2.8 g/LL-半胱氨酸組能夠有效抑制葡萄鏈格孢菌的離體菌的生長。

SOD、CAT、POD以及與電子傳遞相關(guān)的PPO在果實體內(nèi)組成了一個有效的活性氧自由基清除系統(tǒng)，當(dāng)病原菌侵染漿果后，其能有效維持自由基在植物體內(nèi)產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，保持膜結(jié)構(gòu)的完整性，增強果實抵抗病害的能力[23-24]?？拙S寶[25]、張恒[26]等研究表明PPO催化多酚類化合物氧化形成的相應(yīng)醌類物質(zhì)能迅速殺死侵入點周圍的細(xì)胞，增強組織的抗氧化能力，抑制果實病變腐爛。本研究表明，經(jīng)L-半胱氨酸處理的葡萄在接種鏈格孢菌后能夠保持較高的PPO活力，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的PPO活力最高，這與Jia Haifeng等[27]研究草莓果實中PPO基因過表達(dá)對真菌感染過程的影響結(jié)果相似，說明高質(zhì)量濃度的半胱氨酸能夠有效抑制葡萄漿果貯藏期間PPO活力的降低。POD作為病原真菌抗氧化防御系統(tǒng)的主要組分，能夠清除來源于植物體產(chǎn)生的過氧自由基，增強植物體的抗性能力[28-29]。本實驗應(yīng)用不同質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸處理鏈格孢菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各處理組果實在貯藏過程中POD活力上升，其中2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的POD活力最高，說明2.8 g/LL-半胱氨酸能夠有效促進(jìn)POD活力的上升。且2.8 g/LL-半胱氨酸處理能夠有效減緩果實內(nèi)部自由基對細(xì)胞膜的損傷，貯藏到第15天時，該處理組果實MDA含量顯著低于其他處理組（P＜0.05）。另外，CAT作為果實中的一種防御系統(tǒng)，能有效清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，減緩細(xì)胞衰老[30]，本實驗應(yīng)用不同質(zhì)量濃度的L-半胱氨酸溶液處理接種鏈格孢菌后的葡萄，結(jié)果表明2.8 g/LL-半胱氨酸處理組中的CAT活力在貯藏期間均處于最高水平。果實內(nèi)SOD可減少因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細(xì)胞，2.8 g/LL-半胱氨酸處理組的SOD活力顯著高于其他各組。綜上表明接種鏈格孢菌的果實經(jīng)2.8 g/LL-半胱氨酸溶液處理后能夠有效增強果實抗性，抵抗病害發(fā)生。

綜上，L-半胱氨酸處理能有效抑制離體鏈格孢菌的菌落生長、芽管伸長以及孢子萌發(fā)，并對鏈格孢菌菌絲造成損傷，其中對離體鏈格孢菌抑制效果最好的是質(zhì)量濃度為2.8 g/L。L-半胱氨酸處理能降低接種鏈格孢菌的葡萄的發(fā)病率和病斑直徑，降低果實MDA的積累，維持了較高的PPO和POD活力，能有效維持活性氧自由基在植物體內(nèi)產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，增強果實抵抗鏈格孢菌的侵染能力，其中效果最好的質(zhì)量濃度為2.8 g/L。