甘 暉，米 強，韋愷麗，楊明偉，盧小花，陳世富，呂 敏,*，馬華威,*

（1.廣西水產(chǎn)畜牧學校，廣西 南寧 530031；2.廣西水產(chǎn)科學研究院，廣西 南寧 530021）

南美白對蝦（Penaeus vannamei），又名凡納對蝦，是世界及我國重要經(jīng)濟海水蝦類，由于肌肉水分和蛋白質(zhì)量分數(shù)分別高達74%和20%，保鮮不當會導致其在加工、貯藏、銷售和流通過程中極易引起微生物繁殖和體內(nèi)自溶，造成腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生異味和肉質(zhì)惡化[1-2]。微生物生長和代謝是蝦類加工過程中造成腐敗變質(zhì)的主要原因，主要在蝦體表面和腸道繁殖[3]。致腐微生物區(qū)系的改變能引起了蝦類腐敗形態(tài)和化學性質(zhì)變化，特別是優(yōu)勢腐敗菌繁殖所產(chǎn)生的代謝物能造成蝦類體內(nèi)大分子破壞和肌肉自溶，導致組織失去彈性和產(chǎn)生異味[4]。

新一代測序技術不斷應用為深入研究水產(chǎn)品貯藏過程的微生物區(qū)系提供了基礎。當前，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的食品腐敗菌占總菌群的比例小，不足以揭示導致食品腐敗的總菌群，而高通量測序的獨特優(yōu)勢能實現(xiàn)這一目標，篩選出更多腐敗菌類，為研究食品微生物區(qū)系提供技術支撐[5]。16S rRNA高通量測序是當前研究食品腐敗或食品發(fā)酵的常用方法，可獲得易于分析的數(shù)千個序列，能快速、可靠地識別數(shù)量較多的食品微生物[6-7]。研究和分析微生物區(qū)系在時間軸演變規(guī)律是研究食品微生態(tài)學的首要任務，為研究與食品貯存條件相關的腐敗菌群及抑制食品腐敗變質(zhì)提供有價值的信息[8-10]。因此，研究蝦類貯藏過程中微生物區(qū)系，分析其腐敗菌群演變規(guī)律，有針對性地實施有效保鮮技術，對品質(zhì)控制具有重要研究價值。

天然生物保鮮劑是指提取于生物機體并可用于食品的綠色安全防腐劑，如溶菌酶、茶多酚、殼聚糖、Nisin、藍莓葉多酚、金針菇提取物等，能夠起到殺菌抑菌作用，保證產(chǎn)品品質(zhì)[11-13]。殼聚糖具有廣譜抗菌性，能選擇性螯合微生物關鍵生長因子（如金屬離子等），從而抑制微生物生長，抗菌效果好，廣泛應用于食品保鮮[14-16]。茶多酚是食品保鮮常用天然活性物，抗菌活性高，且對人體有保健功能[17-20]。這兩種天然生物保鮮劑已經(jīng)廣泛應用于水產(chǎn)品貯藏保鮮，并且研究表明選擇合適劑量制備而成的復合保鮮劑，抑菌效果更強[21-22]。關于殼聚糖-茶多酚復合物對南美白對蝦微生物區(qū)系演變和與微生物區(qū)系變化所產(chǎn)生的相關化學變化的影響報道很少。因此，本實驗參考前人配制殼聚糖-茶多酚復合物的基礎上，通過配制復合復合物（3 g/100 mL殼聚糖＋3 g/100 mL茶多酚），同時，用3 g/100 mL殼聚糖、3 g/100 mL茶多酚和無菌水分別處理南美白對蝦后于0 ℃冷藏8 d，采用16S rRNA illumina-MiSeq高通量測序研究冷藏過程中南美白對蝦微生物學區(qū)系在時間軸演變規(guī)律，分析感官指標、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、ATP復合物、K值、生物胺和菌落總數(shù)（total viable count，TVC）變化，以期為南美白對蝦冷藏中的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活南美白對蝦由廣西鮮之益水產(chǎn)股份有限公司提供，平均體長為（9.37±0.63）cm，平均體質(zhì)量為（8.37±1.23）g。

茶多酚、殼聚糖（生化試劑） 北京博奧拓達科技有限公司；EX1800瓊脂糖凝膠（純度99%） 北京金克隆生物技術有限公司；ATP復合物 美國Sigma公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 美國Axygen生物科學公司；QuantiFluor?-ST微型熒光劑 美國Promega公司。

1.2 儀器與設備

1100 高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Mastercycler X50梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 Eppendorf中國有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；2016AB01型數(shù)顯pH計廣西小研人生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理

制備無菌水（CG）、3 g/100 mL茶多酚（TP）、3 g/100 mL殼聚糖（CH）、復合試劑（3 g/100 mL殼聚糖＋3 g/100 mL茶多酚）（CP）。鮮活南美白對蝦加氧?；钏椭翆嶒炇?，淘汰死蝦。制備冰水漿（冰水料液比為3∶1），冰水漿猝死后浸泡30 min，清洗去污，隨機均勻分為4 組，每組50 只蝦，即無菌水（對照）、茶多酚、殼聚糖、復合處理組。每組蝦樣品分別在對應處理組和對照組按2∶1（m/V）的比例浸泡10 min，隨后將4 組蝦樣品從溶液中取出，分別用聚氯乙烯袋包裝后冰箱0 ℃冷藏，隨機在0、2、4、5、6、7、8 d選取樣品進行指標測定。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 感官評價

本實驗由9 名有經(jīng)驗的感官評定人員（6 名男性和3 名女性）組成感官評定小組，評估冷藏過程蝦顏色、氣味、質(zhì)地、可接受性。本實驗采用Amerine等感官保質(zhì)期9 分制評分標準[23]，4 種指標滿分均是9 分，每組樣品采樣后，按照顏色、氣味、質(zhì)地、可接受性進行單項評分，得分為9表示品質(zhì)優(yōu)，4.0～6.9表示品質(zhì)良好，1.0～3.9表示蝦腐敗。

1.3.2.2 TVB-N含量、TVC和pH值測定

用半微量水蒸氣蒸餾法測定TVB-N含量[24]，將5 g蝦肉和50 mL蒸餾水倒入勻漿機，勻漿破碎30 min獲得混合液體，混合液在1 600 r/min離心3 min后收集上清液，以凱氏定氮儀測定其中的氮含量，并以此表示TVB-N含量，單位為mg/100 g。

采用Hong Hui等[25]的方法測定TVC，取5 g肉樣品，加入50 mL無菌0.9 g/100 mL NaCl溶液，勻質(zhì)器均化30 s，以0.9 g/100 mL NaCl溶液再次稀釋10 倍，取100 μL稀釋樣品均勻涂抹平板計數(shù)瓊脂上，30 ℃下孵化72 h后計數(shù)，以lg（CFU/g）表示。

取5 g蝦肉經(jīng)勻漿破碎蝦肉于錐形瓶中，加入45 mL無菌蒸餾水，靜置30 min過濾，用數(shù)顯pH計測定pH值。

1.3.2.3 ATP復合物和K值測定

采用Huang Zhan等[26]的方法提取三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、次黃嘌呤核苷酸（inosine 5’-monophosphate，IMP）、肌苷（hypoxanthine riboside，HxR）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）。取蝦肉1 g，加入2 mL、體積分數(shù)10%高氯酸（perchloric acid，PCA）溶液在勻漿機進行勻漿，4 ℃下5 000 r/min離心3 min后收集上清液，沉淀物再重復上述操作。所有上清液pH值用1、10 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)整至6.5，4 ℃下5 000 r/min離心3 min，隨后上清液用PCA溶液（0.6 mmol/L，pH 6.4，下同）定容至10 mL，-20 ℃保存。采用高效液相色譜儀（內(nèi)置SPD-10A檢測器和COSMOSIL 5C18-PAQ柱（4.6 mm I.D.×250 mm）分析ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx含量，K值按下式計算。

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx表示相應物質(zhì)的含量/（μmol/g）。

1.3.2.4 生物胺含量測定

按照Jia Shiliang等[27]的高效液相色譜法測定生物胺含量，分析冷藏過程中其含量變化。取5 g蝦肉，與50 mL蒸餾水勻漿混合，加入10 mL PCA溶液，10 000 r/min離心10 min，重復離心2 次，收集所有上清液，用PCA溶液定容至25 mL。

1.3.2.5 Illumina-MiSeq技術分析微生物區(qū)系組成

參考Liu Xiaochang等[7]的方法提取細菌DNA，用PCR方法擴增了16S rRNA基因的V3～V4區(qū)，PCR條件：95 ℃變性3 min；95 ℃退火30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循環(huán)27 次；72 ℃延伸10 min。引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3′）。用質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠提取擴增產(chǎn)物后，AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒進行純化，QuantiFluor?-ST微型熒光劑定量分析DNA含量。然后，等物質(zhì)的量樣品利用Illumina-MiSeq配對測序（2×300 bp），初始讀數(shù)導入NCBI序列讀取存檔（SRA）數(shù)據(jù)庫，利用QIIME（version 1.17）對初始fastq文件進行多路分解和質(zhì)量過濾。隨后用UPARSE（version 7.1）（http://drive5.com/uparse/）以97%的相似性進行聚類分析可操作分類單位（operational taxonomic units，OTUs），再采用UCHIME識別和刪除嵌合序列，基于Silva（SSU115），置信閾值設為70%，用RDP分類器（http://rdp.cme.msu.edu/）對每個16S rRNA基因序列進行分類。最后采用Unifrac距離加權法進行主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA），研究菌群差異。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗平行3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，利用采用Origin 9.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析和作圖，采用單因素方差分析和Duncan’s多組極差法檢驗差異性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 冷藏過程中南美白對蝦感官評價結果

表1 冷藏過程中南美白對蝦感官評分Table 1 Sensory scores of Penaeus vannamei during refrigerated storage

如表1所示，隨貯藏時間的延長，所有樣品感官評分均顯著下降（P＜0.05）。第2天，復合、茶多酚、殼聚糖處理組顏色、氣味、質(zhì)地、可接受性評分顯著高于無菌水處理組（P＜0.05），復合處理組在顏色、質(zhì)地、可接受性方面評分顯著高于茶多酚、殼聚糖處理組（P＜0.05），而復合、茶多酚、殼聚糖處理組在氣味上無顯著差異。在第7天，復合處理組的氣味評分顯著高于茶多酚、殼聚糖處理組（P＜0.05）。無菌水、茶多酚、殼聚糖、復合處理組的感官評價貨架期分別是5、7、7、8 d。

2.2 冷藏過程中南美白對蝦TVC變化

圖1 冷藏過程中南美白對蝦TVC變化Fig.1 Changes in TVC of Penaeus vannamei during refrigerated storage

如圖1所示，無菌水、茶多酚、殼聚糖、復合處理組的初始TVC分別為4.24、4.11、4.13、4.05（lg（CFUg）），隨著冷藏時間延長，各組TVC呈增加趨勢。第2天，復合處理組的TVC顯著低于無菌水、茶多酚、殼聚糖處理組（P＜0.05），而茶多酚、殼聚糖、無菌水處理組之間沒有顯著差異，至第4天，茶多酚、殼聚糖處理組顯著低于無菌水處理組（P＜0.05）。在無菌水、茶多酚、殼聚糖、復合處理組貯藏的第5、7、7、8天（貨架期結束時），TVC分別為5.07、4.26、4.24、3.93（lg（CFUg）），且復合處理組比無菌水、茶多酚、殼聚糖處理組分別減少1.14、0.33、0.31（lg（CFUg））。

2.3 冷藏過程中南美白對蝦微生物區(qū)系分析結果

圖2 冷藏過程中南美白對蝦菌群相對豐度（A）和主坐標分析（B）Fig.2 Relative abundance of bacteria (A) and principal co-ordinates analysis (PCoA) (B) of microbiota in Penaeus vannamei during refrigerated storage

菌群相對豐富度如圖2A所示，無菌水（5 d）、茶多酚（7 d）、殼聚糖（7 d）、復合（8 d）處理組主要受到19 類細菌屬污染。在第0天，各組的優(yōu)勢腐敗菌豐度差異不大，主要是弧菌屬（Vibrio）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）和擬桿狀假絲酵母屬（CandidatusBacilloplasma），分別占總菌群的41.7%～48.2%、8.97%～11.1%和5.7%～2.2%。在保質(zhì)期結束時，復合（CP8）、無菌水（CG5）、茶多酚（TP7）和殼聚糖（CH7）處理組的Photobacterium和Vibrio相對豐度均較低，其在復合處理組的相對豐度分別為0.3%和0.2%，在茶多酚處理組分別為0.6%和0.5%，在殼聚糖處理組分別為0.5%和0.5%，在無菌水處理組分別為0.7%和0.8%，CG5的優(yōu)勢菌是假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、CandidatusBacilloplasma和假單胞菌屬（Psychromonas），分別占總菌群41.3%、17.2%和17.1%，CP8的優(yōu)勢菌為CandidatusBacilloplasma（17.8%）、變性菌屬（Aliivibrio）（17.6%）、Pseudoalteromonas（27.7%）和Psychromonas（19.1%）。TP7和CH7的優(yōu)勢菌均是Aliivibrio、嗜冷菌屬（Moritella）和Pseudoalteromonas，分別占總菌群61.9%和61.1%、11.4%和11.8%、19.8%和19.4%。CandidatusBacilloplasma在TP7和CH7組中的相對豐度分別為3.4%和3.5%。

圖2B所示為微生物區(qū)系組成相似性和差異性。本實驗基于PCoA的β-多樣性分析，利用加權unifrac距離法描述所有樣品的PCoA相似性，距離越大表示相似性差。結果發(fā)現(xiàn)，復合、無菌水、茶多酚和殼聚糖處理組在初始貯藏（0 d）的微生物區(qū)系組成相似性相對高。與初始貯藏0 d相比，各處理組在貨架期終點時的微生物區(qū)系組成完全改變。

2.4 冷藏過程中南美白對蝦TVB-N含量的變化

圖3 冷藏過程中南美白對蝦TVB-N含量的變化Fig.3 Changes in TVB-N content of Penaeus vannamei during refrigerated storage

由圖3可知，所有樣品組的TVB-N含量在冷藏期間不斷增加，無菌水、茶多酚、殼聚糖和復合處理組的初始TVB-N含量差別不大，分別為5.12、4.83、4.91、4.76 mg/100 g，自第2天起，復合處理組的TVB-N含量整體上顯著低于其他處理組，自第4天起，茶多酚、殼聚糖和復合處理組的TVB-N含量顯著低于無菌水處理組（P＜0.05）。

2.5 冷藏過程中南美白對蝦pH值變化

圖4 冷藏過程中南美白對蝦pH值變化Fig.4 Changes in pH of Penaeus vannamei during refrigerated storage

如圖4所示，各樣品組在冷藏期間的pH值趨于堿性，無菌水、茶多酚、殼聚糖和復合處理組的初始pH值無顯著差異，分別是6.79、6.81、6.82和6.81，自第2天起，復合處理組的pH值顯著低于茶多酚、殼聚糖和無菌水組（P＜0.05），而茶多酚、殼聚糖處理組自第5天起，顯著低于無菌水組（P＜0.05），但殼聚糖、茶多酚處理組之間無顯著差異。

2.6 冷藏過程中南美白對蝦ATP化合物降解變化

圖5 冷藏過程中南美白對蝦IMP（A）、HxR（B）、Hx（C）和K值（D）變化Fig.5 Changes in IMP (A), HxR (B), Hx (C), K value (D) of Penaeus vannamei during refrigerated storage

由圖5可知，隨著冷藏時間延長，整體上所有樣品組IMP和HxR含量先增加后減少，K值和Hx含量不斷增加。其中，無菌水、茶多酚和殼聚糖處理組的IMP含量最大值位于第4天，而復合處理組位于第5天，無菌水、茶多酚、殼聚糖和復合處理組的最大值分別為5.25、5.21、5.23 μmol/g和4.11 μmol/g；自第5天開始，茶多酚、殼聚糖和復合處理組的IMP含量顯著高于無菌水處理組（P＜0.05），從第6天起，復合處理組的IMP含量顯著高于其他處理組（P＜0.05），說明復合處理更能抑制IMP降解。隨著冷藏時間延長，IMP轉(zhuǎn)變成HxR和Hx，各樣品組的HxR含量在貯藏的前4 d沒有顯著差異，無菌水處理組的HxR含量在第5天達到最大值（1.63 μmol/g），而茶多酚、殼聚糖和復合處理組在第6天達到最大值，分別是1.91、1.88、2.55 μmol/g，且6 d后復合處理組HxR含量顯著高于其他處理組。從第4天開始，復合處理組的Hx含量顯著低于茶多酚、殼聚糖和無菌水處理組（P＜0.05），K值顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

2.7 冷藏過程中南美白對蝦腐胺和尸胺含量變化

表2 冷藏過程中南美白對蝦生物胺含量變化Table 2 Changes in biogenic amine contents of Penaeus vannamei during refrigerated storage

如表2所示，各處理組腐胺含量隨冷藏時間延長而不斷增加。自第2天起，復合處理組的腐胺均含量顯著低于無菌水、茶多酚、殼聚糖處理組（P＜0.05），第5天，無菌水、茶多酚、殼聚糖、復合處理組的腐胺含量分別為2.11、1.36、1.29、0.99 mg/kg，在第8天分別高達7.27、3.46、3.51、2.36 mg/kg。所有樣品在第0天未檢測出尸胺，第2、4天，復合、茶多酚、殼聚糖處理組的尸胺含量均顯著低于無菌水處理組（P＜0.05），而復合、茶多酚、殼聚糖處理組之間無顯著差異，第5、8天，復合處理組的尸胺含量顯著最低（P＜0.05），無菌水、茶多酚、殼聚糖、復合處理組在第5天的尸胺含量分別為5.66、1.78、1.75、1.10 mg/kg。

3 討 論

食品腐敗主要是腐敗菌滋生造成食品品質(zhì)下降，主要是顏色、氣味、質(zhì)地、可接受性下降。無菌水處理組南美白對蝦的TVC在第5天為5.07（lg（CFUg）），與Jia Shiliang[28]、劉金昉[29]等的研究結果相似。無菌水、茶多酚、殼聚糖和復合處理組的感官評價貨架期分別為5、7、7 d和8 d，復合處理組的TVC比無菌水、茶多酚、殼聚糖處理組分別減少1.14、0.33、0.31（lg（CFUg））。Cai Luyun等[6]研究發(fā)現(xiàn)，貯藏8 d后，3%殼聚糖＋2.5%茶多酚配制的復合物能使鱸魚貯藏8 d后的Lateolabrax japonicas總量比空白對照組減少1.35（lg（CFUg））。Liu Xiaochang等采用2.5%殼聚糖＋3.0%茶多酚配制成的復合保鮮劑處理鳙魚Aristichthys nobilis，8 d后其TVC比空白對照組減少1.27（lg（CFUg））[7]。這些結果表明復合處理具有顯著抑菌保鮮效果。

食品腐敗主要由微生物繁殖生長所造成，微生物區(qū)系的變化導致食品變質(zhì)模式與化學性質(zhì)發(fā)生變化[6]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，4 個處理在初始貯藏時間（0 d）的優(yōu)勢腐敗菌是Vibrio、Photobacterium和CandidatusBacilloplasma，其中Vibrio相對豐度最高，可能是因為一些Vibrio屬常出現(xiàn)于水中[27]，在出水時被水產(chǎn)品攜帶。Photobacterium屬于革蘭氏陰性菌弧菌科，適合在冷溫環(huán)境中繁殖生長，與海產(chǎn)品腐敗有關[2,6]。Dalgaard等[30]研究發(fā)現(xiàn)Photobacterium是氣調(diào)包裝鱈魚片的優(yōu)勢腐敗菌，應用茶多酚、殼聚糖等有效保鮮劑能抑制Photobacterium生長，延長鱈魚片感官保質(zhì)期。Photobacterium也是挪威龍蝦Nephrops norvegicus的主要腐敗菌，在貯藏過程中可將三甲胺還原為三甲，并產(chǎn)生H2S，造成異味[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，冷鮮鮭魚Salmo salar上Photobacterium繁殖生長最快，冷藏期能產(chǎn)生胺類和異味[32]。Photobacterium是蝦類水產(chǎn)品形成腐胺和尸胺的主要因素，在蝦類消化腺內(nèi)繁殖引起腐敗，所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)和胺類擴散至體表[33-34]，這可能是導致無菌水處理組的蝦樣在短冷藏時間出現(xiàn)異味的原因。本實驗發(fā)現(xiàn)，復合處理組的蝦樣品的腐胺和尸胺含量增加最慢，可能是由于而復合處理組貯藏8 d的Photobacterium豐度相當于無菌水、殼聚糖、茶多酚處理組分別貯藏5、7、7 d的水平（圖2A），推測可能復合處理使該菌生長受到抑制導致兩種胺類生成較慢，但是具體原因需要進一步研究。本研究中，CandidatusBacilloplasma在所有樣品組冷藏期間內(nèi)均存在，南美白對蝦（P.vannamei）[6]、七鰓鰻（Lampetra morii）[35]和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[36]在0 ℃冷藏下也發(fā)現(xiàn)類似結果，可能該菌在0 ℃條件下的生存能力較強。本研究發(fā)現(xiàn)，CandidatusBacilloplasma的生長受茶多酚、殼聚糖處理抑制，而復合處理不能抑制該菌生長繁殖，具體原因需要進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，無菌水處理組貯藏5 d時的優(yōu)勢腐敗菌是Pseudoalteromonas，其次是CandidatusBacilloplasma和Psychromonas。Pseudoalteromonas能夠產(chǎn)生與水產(chǎn)品腐敗密切相關的TMA、H2S、氨和乙酸等有害物質(zhì)[37]。Broekaert[37]和Tirloni[38]等證實了Pseudoalteromonas是引起蝦褐變的主要優(yōu)勢腐敗菌，通過降解蝦肉脂質(zhì)，水解氨基酸與蛋白質(zhì)，導致蝦腐敗。Paarup等[34]研究發(fā)現(xiàn)，魷魚（Todaropsis eblanae）在0 ℃冷藏期間，Pseudoalteromonas數(shù)量最多。Iijima等[39]報道，Pseudoalteromonas在食品貯藏過程中通過形成較厚的生物膜并產(chǎn)生胞外蛋白酶引起食品變質(zhì)。同時，Pseudoalteromonas根據(jù)環(huán)境變化產(chǎn)生各種胞外化合物，進而用于調(diào)節(jié)對食物基質(zhì)適應性以適應變化，最終大量繁殖生長，成為主要優(yōu)勢腐敗菌[40]。本研究中復合處理組貯藏8 d后的Pseudoalteromonas豐度高于初始時，可能是茶多酚、殼聚糖和精油不能抑制該菌生長。一些腐敗菌CandidatusBacilloplasma由于難以在培養(yǎng)過程中存活，其對水產(chǎn)品的致腐作用研究較少[41]。如本研究初始貯藏時4 個處理組之間的CandidatusBacilloplasma、Leucothrix、Winogradskyella的相對豐度均存在較大差異，說明初始值統(tǒng)計不穩(wěn)定。國際食品微生物標準委員會[42]提出水產(chǎn)品變質(zhì)的TVC閾值是7.0（lg（CFUg））。本研究中，無菌水處理組在貨架期結束時的TVC僅為5.07（lg（CFUg）），大大低于閾值，可能由于上述3 類菌難以培養(yǎng)造成實際統(tǒng)計的TVC較低。Psychromonas是嗜冷性高鹽菌屬，廣泛分布在水生環(huán)境，是深海和極地微生物區(qū)系的重要組成部分[3]。研究美國龍蝦Homarus americanus在0 ℃冷藏過程腐敗變質(zhì)發(fā)現(xiàn)，Psychromonas具有分解脂質(zhì)和蛋白質(zhì)能力，且脂質(zhì)分解能力強[43]。Chen Huibin等[44]研究發(fā)現(xiàn)，Psychromonas是牡蠣（Crassostrea gigas和Crassostrea virginica）在4 ℃貯藏中的主要優(yōu)勢腐敗菌。本研究中，相比初始貯藏時間，8 d后，CandidatusBacilloplasma、Pseudoalteromonas和Psychromonas未被復合處理抑制，Vibrio和Photobacterium被抑制，復合處理組對優(yōu)勢腐敗菌的抑制機制需要進一步研究。

復合、茶多酚和殼聚糖處理組對微生物區(qū)系的影響導致了蝦類腐敗模式及過程的變化，最終可通過生化指標反映出來。TVB-N產(chǎn)生于蛋白質(zhì)被分解成堿性含氮化合物，如微生物和酶作用下蛋白質(zhì)分解成氨、二甲胺和三甲胺[26]。這些物質(zhì)的含量是評價海鮮品質(zhì)的重要生化指標。本研究發(fā)現(xiàn)，各樣品組的初始TVB-N含量為7.88～8.01 mg/100 g，與Okpala[45]和Jia Shiliang[24]等的研究結果一致。無菌水處理組的TVB-N含量在0～5 d增加緩慢，之后迅速升高。自第4天起，茶多酚、殼聚糖和復合處理組的TVB-N含量顯著低于無菌水組，復合處理組的TVB-N含量從第6天后顯著低于茶多酚和殼聚糖組。Gon?alves等[46]報道稱TVB-N含量為20 mg/100 g是水產(chǎn)品新鮮度的限含量。本實驗中，僅無菌水處理組樣品的TVB-N含量在第6天超過限含量，說明茶多酚、殼聚糖和復合處理能顯著抑制TVB-N含量增加，且復合處理作用最好。

各樣品組的初始pH值為6.88～6.91，與黑虎蝦Penaeus monodon結果一致[47]。各樣品組的pH值在冷藏期間不斷增加，自第2天起，無菌水處理組的pH值顯著低于無菌水、茶多酚、殼聚糖組。Varlik等[48]認為新鮮蝦類的pH值范圍為7.0～8.0。Mehmet等[49]研究發(fā)現(xiàn)，當pH值不超過7.7時蝦保持良好品質(zhì)。水產(chǎn)品的pH值上升較小與冷藏過程中樣品的微生物增長較低有關[28]。水產(chǎn)品在貯藏過程中pH值的增加主要是由于蛋白質(zhì)和其他含氮物質(zhì)在微生物和內(nèi)源酶的作用下分解成揮發(fā)性堿，如胺和三甲胺[50]。

魚蝦類死亡后的ATP降解途徑為：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，ATP向IMP的轉(zhuǎn)化被認為是一個完全自溶的過程[28]。本研究中，茶多酚、殼聚糖和復合處理能抑制蝦的IMP進一步降解，使蝦保持較好口感。在自溶酶和細菌酶作用下，IMP轉(zhuǎn)化為HxR和Hx，Hx的積累導致良好口感逐漸消失，產(chǎn)生苦味[28]。研究發(fā)現(xiàn)，貯藏前2 d所有樣品組的Hx含量無顯著差異，自第4天開始復合處理組的Hx含量顯著低于其他處理組，而自第6天起茶多酚、殼聚糖、復合處理組的HxR高于無菌水處理組，這可能是由于茶多酚、殼聚糖和復合處理改變了蝦樣品中微生物區(qū)系，抑制了HxR降解為Hx，與Hernández-Cázares等[51]也認為Hx的形成與腐敗菌產(chǎn)生的核苷磷酸化酶有關的觀點一致。

生物胺是一種非揮發(fā)性的低分子量含氮化合物，主要由細菌通過游離氨基酸脫羧而形成，海產(chǎn)品中最常見的生物胺是腐胺和尸胺[28]。腐胺含量是指示蝦類在不同溫度貯藏下肌肉蛋白質(zhì)降解程度的最佳指標，尸胺的產(chǎn)生與腐胺有類似規(guī)律[52]。本研究在P.vannamei中發(fā)現(xiàn)了與腐敗相關的腐胺和尸胺，自第2天起復合處理組的腐胺含量均顯著低于無菌水、茶多酚、殼聚糖處理組。Lakshmanan等[33]發(fā)現(xiàn)在冷藏條件下存活的Photobacterium可能與魚蝦類的腐胺和尸胺形成有關。本研究發(fā)現(xiàn)，冷藏過程中P.vannamei產(chǎn)生腐胺和尸胺被茶多酚、殼聚糖和復合處理抑制，可能因為茶多酚和殼聚糖能直接修飾脫羧酶或在冷藏期間抑制腐敗菌Photobacterium。有研究表明，茶多酚和殼聚糖能通過靜電或疏水相互作用與某些蛋白質(zhì)、核酸結合，進而抑制微生物的生理功能[53]。茶多酚和殼聚糖作為一種可逆抑制劑可抑制脂肪酶活性，其抑制能力隨聚合度的增加而增大[28]。生物胺是氨基酸被多種氨基酸脫羧酶脫羧產(chǎn)生，篩選脫羧酶抑制劑對于抑制由水產(chǎn)品腐敗所產(chǎn)生的生物胺具有重要意義[33]。然而，關于茶多酚和殼聚糖聯(lián)合使用是否能影響脫羧酶的活性，以及茶多酚和殼聚糖能影響哪種脫羧酶活性的研究較少。因此，需要進一步解決這些問題。

感官評分是反映蝦貯藏過程中最重要的品質(zhì)指標之一。食品腐敗由細菌大量繁殖生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物引起[28]，具體表現(xiàn)為變色、理化性質(zhì)劣變、結構破壞、黏液和形成異味，從而導致感官評分下降。本研究中，隨著冷藏時間延長，各樣品組的顏色、氣味、質(zhì)地和可接受性的感官評分均顯著降低。第5天，無菌水處理組不能被感官評價小組接受食用。Pseudoalteromonas是無菌水處理組樣品腐敗的核心菌屬，能產(chǎn)生大量的硫化物和丙酮，可水解蛋白質(zhì)，導致質(zhì)地劣化[37]。本研究中，在冷藏第2天復合、茶多酚和殼聚糖處理組氣味、顏色和質(zhì)地評分顯著高于無菌水處理組，這可能是由于殼聚糖和茶多酚抑制了Pseudoalteromonas的生長繁殖。蝦肌肉的質(zhì)地軟化也與組織蛋白酶B或L、組織蛋白酶D、堿性蛋白酶和鈣依賴蛋白酶等內(nèi)源性蛋白酶引起的蛋白質(zhì)水解有關[54]。因此，殼聚糖和茶多酚對內(nèi)源性蛋白酶的影響也有待進一步研究。無菌水處理組顏色得分偏低的另一個原因是多酚氧化酶介導了酶促褐變形成的黑變[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，復合處理組黑變程度較低，殼聚糖和茶多酚協(xié)同抑制黑變機制需要進一步研究，比如黑變率低是否與兩者協(xié)同對蝦類微生物的修飾作用或?qū)Χ喾友趸傅囊种谱饔糜嘘P?？偟貋碇v，在冷藏過程中，復合處理組的感官質(zhì)量更優(yōu)，感官保質(zhì)期較長。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)，無菌水、茶多酚、殼聚糖和復合處理組的感官保質(zhì)期分別為5、7、7 d和8 d。自第2天起，復合處理組的TVC、TVB-N含量、pH值、腐胺含量均顯著低于無菌水、茶多酚和殼聚糖處理組（P＜0.05），并且抑制IMP化合物降解效果最好。在貯藏0 d時，各組的優(yōu)勢腐敗菌是Vibrio、Photobacterium和CandidatusBacilloplasma，而隨著貯藏時間延長，保質(zhì)期結束時，優(yōu)勢腐敗菌區(qū)系發(fā)生明顯改變。通過對各樣品組的南美白對蝦對比分析，結果發(fā)現(xiàn)復合保鮮組的南美白對蝦品質(zhì)最佳，感官保質(zhì)期最長。南美白對蝦在0 ℃冷藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌引起品質(zhì)變化的潛在機制和復合保鮮組抑菌機理需進一步深入研究。