袁 康，胡振陽，陳可欣，盧 臣，都立輝*

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

稻谷作為我國主要儲備糧之一，在收獲與儲運過程中易受到微生物的侵染而產(chǎn)生霉變，其侵染霉菌種類較多，主要是曲霉屬和青霉屬[1-2]。糧食霉變的實質(zhì)是霉菌分解利用糧食中的有機物質(zhì)進行生長和產(chǎn)毒活動[3]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因霉變和儲糧害蟲造成的糧食產(chǎn)后損失占糧食總量的10%～15%[4]。霉變會導致糧食品質(zhì)下降，一方面影響水稻的感官特性和營養(yǎng)價值；另一方面霉菌的次生代謝產(chǎn)物給人和牲畜帶來安全隱患[5]?；揖G曲霉是稻谷儲藏過程中的優(yōu)勢霉菌之一，在儲藏后期過程中，優(yōu)勢霉菌會演替為儲藏霉菌[6]。

隨著人們對食品安全與健康日益重視，天然植物精油在食品行業(yè)中的應用已經(jīng)成為近年來的研究熱點。紫蘇作為唇形科草本植物，是我國衛(wèi)生部首批頒布的藥食兩用植物之一，其莖葉中富含精油；紫蘇精油（perilla essential oil，PEO）的主要成分為紫蘇醛[7-8]。紫蘇醛別名二氫枯茗醛，分子式為C10H14O，是一種具有辛香香氣的光學活性萜類化合物。常溫下，PEO是一種無色至淺黃色液體，不溶于水，溶于乙醇、氯仿、苯和石油醚等。PEO具有重要的生理保健功能，如抗菌、抗癌、抗氧化、抗衰老、舒張血管等，在食品工業(yè)、化妝品、醫(yī)藥、煙草等行業(yè)均有廣泛應用[9]；無論在食品的增香、防腐、抗菌、增色方面，還是在特效藥物的研發(fā)和臨床治療的推廣方面，均帶來了可觀的經(jīng)濟效益，具有重大的科研價值[10]。研究表明，將PEO應用于倉儲玉米中可以預防玉米品質(zhì)下降[11]。已有研究利用適量濃度PEO提高稻谷在儲藏期間的整精米率，并預防不完善粒率及微生物數(shù)量的增長[12-14]；紫蘇醛與檸檬烯對絲狀真菌有協(xié)同抑制作用[15]。還有研究將不同植物精油應用于大米防霉，發(fā)現(xiàn)復配精油對青霉和黑曲霉的抑菌效果極佳[16]。基于PEO在食品中微生物抑制領(lǐng)域的應用，本實驗主要測定了PEO對灰綠曲霉的最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），研究不同劑量PEO的抑菌活性，探討PEO抑制灰綠曲霉的抑菌機理，為PEO對灰綠曲霉的控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

灰綠曲霉由南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院重點實驗室儲藏，經(jīng)28S rDNA測定為灰綠曲霉。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）北京陸橋技術(shù)股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖水（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基 青島海博公司；PEO（其組分經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜測定，主要含有38.85%的1-環(huán)己烯-1-甲醛、9.84%的1-(2,5-二甲基苯基)-乙酮、9.72%的8-羥基羧基丙酮、9.19%的庚-2-烯-2-甲醛、8.99%的辛烷、4.51%的雙環(huán)辛烷和3.85%的庚-2-酮）南京丁貝生物技術(shù)公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備公司；TM3000掃描電子顯微鏡 日本株式會社日立制作所；Scope A1正置熒光顯微鏡 德國蔡司公司；傅里葉變換紅外光譜儀德國布魯克公司；BD FACSVerse流式細胞儀 上海微速生物科技有限公司；UV-1700紫外-可見分光光度計日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)及孢子液的制備

將灰綠曲霉接種于新鮮的PDA培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，待霉菌生長良好再次接種于新鮮的PDA培養(yǎng)基上，重復數(shù)次后，將霉菌接種于PDB培養(yǎng)液中，于30 ℃培養(yǎng)3～5 d，將菌液與滅菌后的30%（體積分數(shù)）甘油以體積比1∶1混合后保存在-70 ℃冰箱中?；罨瘯r將凍存的菌液解凍后以1%（體積分數(shù)）接種于馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)1 d，備用。

灰綠曲霉孢子液的制備：將灰綠曲霉接種PDA培養(yǎng)基上30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用無菌水沖洗霉菌，經(jīng)紗布過濾制得孢子懸浮液，并用血球計數(shù)板在400 倍顯微鏡下觀察計數(shù)；-4 ℃暫存，備用。

1.3.2 PEO對灰綠曲霉MIC測定

將PEO溶于質(zhì)量分數(shù)為5%的Tween-80溶液中得到初始劑量為4 μL/mL的溶液。調(diào)整活化好菌液的濃度，按體積比1∶1加入PEO溶液中進行2 倍稀釋后，分別得到終劑量為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μL/mL和0.031 25 μL/mL的體系，并使初始霉菌孢子數(shù)為5×105CFU/mL，以不加PEO的菌液為陰性對照，以培養(yǎng)基為陽性對照。于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48、60 h和72 h時檢測各劑量的OD600nm，其中與陽性對照組OD600nm相近的最低PEO劑量即為PEO對其的MIC[17]。

1.3.3 PEO對灰綠曲霉最小殺菌濃度測定

按上述方法分別制得PEO劑量為4、2、1、0.5 μL/mL和0.25 μL/mL的體系，并使灰綠曲霉孢子數(shù)為5×105CFU/mL，以不加PEO的菌液為對照。置于30 ℃培養(yǎng)箱中處理24 h后，吸取50 μL處理好的菌液于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察其生長情況，拍照記錄[18]。

1.3.4 PEO對菌絲生長的抑制作用測定

通過測定精油對霉菌菌絲生長的抑制率來評價精油對霉菌的抑菌活性[19]。用上述辦法配制不同劑量的PEO加入PDB培養(yǎng)基中，并調(diào)整50 mL總體系中孢子終濃度為5×105CFU/mL；沒有PEO處理的樣品為對照組。在30 ℃下培養(yǎng)3 d后收集菌絲體，在60 ℃下干燥24 h并稱其干基質(zhì)量；與對照組相比，按式（1）計算菌絲生長的抑制率。

式中：mC是對照板中的菌絲體平均質(zhì)量/g；mS是含有PEO培養(yǎng)基中的菌絲體平均質(zhì)量/g。

1.3.5 PEO對孢子萌發(fā)的抑制作用測定

根據(jù)林春花等測定真菌孢子萌發(fā)的方法[20]稍作調(diào)整：在培養(yǎng)皿中用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，用無菌水沖洗過濾分別制得兩種霉菌孢子懸浮液；將50 μL的霉菌孢子懸浮液滴加到含0（對照）、0.25、0.5 μL/mL和1 μL/mL PEO的PDB培養(yǎng)基中。通過顯微鏡觀察，當孢子萌芽的長度比孢子直徑長時，即判定為孢子萌發(fā)。當對照組的孢子萌發(fā)量約達到總孢子量的80%以上時，將乳酚棉藍滴入培養(yǎng)基中以終止孢子萌發(fā)。記錄萌發(fā)和未萌發(fā)孢子的數(shù)量并計算孢子萌發(fā)的百分比，每次測定處理約200 個單孢子，實驗重復3 次。

1.3.6 質(zhì)膜中麥角固醇質(zhì)量分數(shù)的測定

灰綠曲霉麥角固醇質(zhì)量分數(shù)的測定方法如下：將灰綠曲霉孢子懸浮液按5×105CFU/mL接種于含0、0.25、0.5 μL/mL和1 μL/mL PEO的PDB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)5 d，收集菌絲體并用蒸餾水洗滌兩次。為避免影響麥角固醇在質(zhì)膜中的含量，將菌絲體樣品用濾紙過濾。向每個樣品中加入5 mL質(zhì)量分數(shù)25%的氫氧化鉀醇溶液，漩渦混合5 min，然后在85 ℃下孵育4 h。加入2 mL無菌蒸餾水和5 mL正庚烷，然后漩渦振蕩2 min。收集正庚烷層，并通過UV-1700紫外-可見分光光度計在230～300 nm之間掃描。正庚烷層中麥角固醇（282 nm）和麥角固醇的中間產(chǎn)物（脫氫麥角固醇（230～282 nm））存在導致產(chǎn)生特征曲線[21]。將未經(jīng)PEO處理的樣品視為對照。麥角固醇質(zhì)量分數(shù)按式（2）、（3）計算。

式中：ω脫氫麥角固醇為脫氫麥角固醇質(zhì)量分數(shù)/%；ω麥角固醇為麥角固醇質(zhì)量分數(shù)/%；m菌絲體為菌絲體濕質(zhì)量/g。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察PEO對灰綠曲霉形態(tài)的影響

將灰綠曲霉孢子液在PDB中培養(yǎng)3 d后，4 000 r/min離心10 min，吸去上清液并收集菌絲體，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）反復沖洗除去培養(yǎng)基，用劑量為0、0.25、0.5 μL/mL和1 μL/mL的PEO于37 ℃處理24 h后，PBS反復沖洗除去PEO溶液。用質(zhì)量分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液浸泡2 h固定，用PBS漂洗3 次，接下來用體積分數(shù)為30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇梯度脫水各15 min，離心后固定在鏡片上，放入通風櫥風干，噴金后鏡檢拍照[22]。

1.3.8 灰綠曲霉線粒體ATP酶活力的測定

用上述方法收集0、0.25、0.5 μL/mL和1 μL/mL的PEO處理的菌絲體，重懸于10 mL含有50 mmol/L Tris（pH 7.5）、2 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L苯基甲磺酰氟的緩沖液中后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，以10 000×g離心30 min，通過質(zhì)量分數(shù)2%的葡萄糖溶液破壞細胞獲得線粒體，并以2 000×g離心5 min，然后以10 000×g離心30 min。最后，將線粒體重懸于10%初始體積的緩沖液中并儲存于4 ℃?zhèn)溆肹23]。使用A016-1-1 ATP酶試劑盒檢測PEO處理灰綠曲霉中的線粒體ATP酶活力。

1.3.9 流式細胞術(shù)測定灰綠曲霉孢子完整性

將灰綠曲霉孢子液在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，5 000 r/min離心10 min，用PBS沖洗3 次，分別用劑量為0.25、0.5 μL/mL和1 μL/mL的PEO在振蕩培養(yǎng)器中30 ℃處理孢子24 h，空白組為對照。用PBS沖洗3 次，隨后將孢子重懸于PBS中，用PI染液染色30 min，用流式細胞儀檢測孢子完整性。

1.3.10 灰綠曲霉菌絲體的傅里葉變換紅外光譜測定

按上述方法，將灰綠曲霉菌絲體分別用0、0.25、0.5 μL/mL和1 μL/mL的PEO處理24 h后，用PBS沖洗3 次除去PEO溶液后，置于冷凍干燥機中凍干。將所得凍干菌絲體研缽磨粉，將菌絲粉末與光譜級溴化鉀混合均勻制片，在傅里葉變換紅外光譜中檢測，測試的波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1。每組實驗重復5 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗至少重復3 次，采用Origin 2018軟件處理所得數(shù)據(jù)并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEO對灰綠曲霉的MIC

圖1 不同劑量PEO處理對灰綠曲霉的生長抑制作用Fig.1 Growth inhibition of Aspergillus glaucus by different concentrations of PEO

從圖1可以看出，不同劑量的PEO溶液對灰綠曲霉均有一定的抑制效果，隨著PEO劑量的增加，OD600nm逐漸下降，PEO對灰綠曲霉的抑制作用隨PEO劑量的增加而增強，表現(xiàn)出一定的劑量效應；當精油劑量在0.5 μL/mL及以上時，灰綠曲霉受抑制效果明顯，由此可推測，PEO對灰綠曲霉的MIC為0.5 μL/mL。

2.2 PEO對灰綠曲霉的最小殺菌濃度

從圖2可以看出，隨PEO劑量提高，灰綠曲霉在PDA培養(yǎng)基上的生長明顯減少。1 MIC PEO處理過的灰綠曲霉孢子液可以在新鮮的PDA培養(yǎng)基上生長，可以推測1 MIC可以抑制或殺死部分孢子，卻并不能殺死全部孢子。而當PEO的劑量為4 μL/mL時，灰綠曲霉在PDA培養(yǎng)基上沒有生長，由此可以推測PEO對灰綠曲霉的最小殺菌劑量為4 μL/mL，灰綠曲霉孢子經(jīng)8 MIC PEO處理后完全失活，且PEO對灰綠曲霉的損傷不可逆。

圖2 不同劑量PEO處理對灰綠曲霉在PDA培養(yǎng)基上生長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of PEO on the growth of Aspergillus glaucus on potato dextrose agar medium

2.3 PEO對灰綠曲霉菌絲生長的影響

圖3 不同劑量PEO處理后灰綠曲霉的菌絲干質(zhì)量Fig.3 Dry mycelial mass of Aspergillus glaucus treated with different concentrations of PEO

從圖3可以看出，隨著PEO劑量的增加，灰綠曲霉菌絲干質(zhì)量明顯減少。與對照組對比，在0.25、0.5 μL/mL和1 μL/mL劑量下灰綠曲霉菌絲抑制率分別為81.75%、88.05%、93.07%，PEO抑制灰綠曲霉菌絲體生長的效果明顯；由此可見，PEO可以高效抑制PDB中灰綠曲霉孢子生長為成熟的菌絲。

2.4 PEO對灰綠曲霉孢子萌發(fā)的影響

圖4 不同劑量PEO處理對孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Inhibitory effect of different concentrations of PEO on spore germination

如圖4所示，對照組在6、9 h和12 h時的孢子萌發(fā)率分別為44%、72.67%和97.67%，在培養(yǎng)12 h后幾乎所有孢子都萌發(fā)；當PEO劑量達到1 μL/mL時，處理過的灰綠曲霉在6、9 h和12 h的孢子萌發(fā)率分別為0%、5.33%和11.77%。PEO處理過的孢子在培養(yǎng)6 h時均沒有萌發(fā)；隨著PEO劑量的增加，灰綠曲霉的孢子萌發(fā)率明顯降低；當PEO劑量達到1 MIC和2 MIC時，孢子萌發(fā)率大大減少。

2.5 PEO對灰綠曲霉質(zhì)膜中麥角固醇質(zhì)量分數(shù)的影響

麥角固醇是絲狀真菌細胞壁的主要成分，被認為是評價不同基質(zhì)中真菌生物量并維持膜完整性的標準[24]。麥角固醇除了調(diào)節(jié)細胞膜的流動性、不對稱性和完整性外，還有助于維持膜結(jié)合酶的正常功能和質(zhì)膜蛋白的定位。由圖5可知，當PEO劑量為0、0.25、0.5 μL/mL和1 μL/mL時，質(zhì)膜中麥角固醇質(zhì)量分數(shù)分別為80.96%、16.37%、11.13%和8.03%。隨著灰綠曲霉中麥角固醇質(zhì)量分數(shù)的減少，PEO的抑制作用可能會影響某些膜結(jié)合蛋白的完整性和功能，導致滲透性增強并破壞霉菌細胞生長。

圖5 不同劑量PEO處理后霉菌中麥角固醇質(zhì)量分數(shù)Fig.5 Content of ergosterol in Aspergillus glaucus mycelia treated with different concentrations of PEO

2.6 PEO對灰綠曲霉細胞形態(tài)的影響

圖6 經(jīng)不同劑量PEO處理后的霉菌掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.6 SEM images of Aspergillus glaucus mycelia treated by different concentrations of PEO

由圖6可知，空白對照組灰綠曲霉圓潤飽滿、菌絲形態(tài)完整、表面光滑。而用0.25 μL/mL劑量的PEO處理后，灰綠曲霉表面變得不光滑，有細微凹陷產(chǎn)生，且有些菌絲體出現(xiàn)干癟與褶皺，表明霉菌受到一定損傷；當劑量增加到0.5 μL/mL時，菌絲體嚴重扭曲變形，灰綠曲霉表面出現(xiàn)明顯的褶皺與凹陷；當PEO劑量增加到1 μL/mL時，菌絲體出現(xiàn)大量孔洞，由此推測可能導致菌絲體內(nèi)含物流出，細胞通透性改變[25]。

2.7 PEO對灰綠曲霉線粒體ATP酶活力的影響

圖7 不同劑量PEO處理對灰綠曲霉細胞線粒體ATP酶活力的影響Fig.7 Different concentrations of PEO inhibit mitochondrial ATPase activity in Aspergillus glaucus cells

由圖7可知，當PEO劑量增加，灰綠曲霉的線粒體ATP酶活力隨之降低。當PEO劑量為1/2 MIC時，其抑制效果并不明顯；當PEO劑量增加到1 MIC和2 MIC時可以有效地抑制線粒體ATP酶的活性。PEO劑量為0.5、1 MIC和2 MIC時，灰綠曲霉的ATP酶活力抑制率分別為15.39%、53.60%和67.05%。結(jié)果表明PEO可以有效抑制灰綠曲霉線粒體ATP酶活力。線粒體ATP酶是細胞代謝所必需的，線粒體ATP酶的消耗將導致細胞內(nèi)ATP水平降低，并導致細胞死亡[26]。作為ATP的主要來源，線粒體ATP酶的抑制將導致質(zhì)膜ATP酶的抑制并進一步降低培養(yǎng)基酸化的pH值。這與細胞膜滲透性和細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。

2.8 PEO對灰綠曲霉孢子細胞膜完整性的影響

圖8 不同劑量PEO處理對灰綠曲霉孢子細胞膜完整性的影響Fig.8 Effect of different concentrations of PEO on cell membrane integrity

如圖8所示，經(jīng)不同劑量PEO處理后，PI標記的灰綠曲霉的熒光水平發(fā)生明顯變化，隨著PEO劑量的增加，被染色的細胞數(shù)量增加。當用0.5、1 MIC和2 MIC劑量的PEO處理時，灰綠曲霉細胞滲透率較對照組分別增加55.11%、63.96%和69.91%。PI是一種不滲透膜的染料，當細胞膜通透性發(fā)生變化時，PI才可以進入細胞。當PEO劑量增加到2 MIC時，PI染色細胞數(shù)量明顯增加，這也進一步驗證了PEO對灰綠曲霉細胞膜功能的影響。

2.9 PEO對灰綠曲霉菌絲體傅里葉變換紅外光譜的影響

圖9 不同劑量PEO處理灰綠曲霉的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.9 FTIR spectra of Aspergillus glaucus mycelia treated with different concentrations of PEO

由圖9可知，不同劑量PEO處理后的菌絲體經(jīng)傅里葉變換紅外光譜掃描后，在不同的波數(shù)具有不同的表征。隨著PEO劑量從0增加至2 MIC，在不同的特征峰均呈現(xiàn)出不同程度的變化。波數(shù)3 384 cm-1附近的吸收峰反映羥基（—OH）伸縮振動，波數(shù)2 924 cm-1附近的吸收峰反映甲基和亞甲基碳氫鍵（C—H）伸縮振動，1 083 cm-1附近的吸收峰反映芳香族面內(nèi)彎曲。在波數(shù)1 548～1 744 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)的吸收峰歸屬于芳香族骨架的動態(tài)振動，吸收峰存在一定的差異，1 548 cm-1附近為苯環(huán)的碳骨架振動。結(jié)果表明PEO可能會影響灰綠曲霉菌絲體化合物（如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物等）的變化。

3 討 論

近年來，鑒于化學合成殺菌劑與防腐劑存在的安全隱患，亟需開發(fā)高效抑菌且環(huán)保的食品防護劑，其中天然植物代謝產(chǎn)物已被廣泛研究用于抗真菌污染，植物代謝產(chǎn)生的芳香揮發(fā)性產(chǎn)物作為高效率和低耐藥性的環(huán)保型抗真菌劑具有很大的應用潛力與前景。

PEO作為綠色、健康的天然抑菌劑，越來越受到廣泛的關(guān)注和青睞。本研究顯示PEO對灰綠曲霉的菌絲體生長、孢子萌發(fā)、麥角固醇質(zhì)量分數(shù)及線粒體ATP酶活力均有一定程度的抑制效果。當PEO劑量在1 MIC及以上時，霉菌菌體變形，細胞表面完整性與通透性改變。由此推測PEO的抑菌機理可能與其理化性質(zhì)有關(guān)[27]，PEO可能作用于霉菌細胞，導致細胞膜特性的改變，從而影響菌體的生長。PEO還可能進一步穿透細胞膜，進入細胞內(nèi)部，降低細胞內(nèi)ATP水平，從而降低霉菌細胞整體的活性[28-29]。

精油的抑菌機制通常歸因于一些低分子質(zhì)量和高度親脂性成分對膜的破壞，這些成分可能會穿透細胞質(zhì)膜并最終導致真菌細胞死亡[30]。在一項評估肉桂醛對枯萎鐮孢鐮刀菌效果的研究中發(fā)現(xiàn)了明顯的細胞質(zhì)膜破裂[31]。因此，精油能夠?qū)毎ぴ斐梢欢ǔ潭鹊膿p害，破壞細胞膜完整性，從而阻礙細胞生長。

本實驗將PEO作用于灰綠曲霉，結(jié)果表明不同劑量的PEO對灰綠曲霉均有一定的抑制作用，且一定程度上PEO對這種霉菌的抑菌效果與其劑量成正比。從灰綠曲霉的麥角固醇含量和PI染色結(jié)果看，PEO破壞了霉菌孢子的細胞膜完整性；從掃描電子顯微鏡的結(jié)果可以看出PEO處理后霉菌細胞變形，細胞明顯受損。由此可知，PEO對灰綠曲霉的作用方式主要是通過影響麥角固醇的合成，使細胞膜通透性增加，導致內(nèi)含物流出，使線粒體ATP酶活性降低，破壞其表面官能團結(jié)構(gòu)，最終達到抑菌效果。