鐘宇辰 王詩淳 趙 峰 張婷婷 陳 萌 施 萍 龐希寧

(1.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,沈陽 110122)(2.沈陽艾米奧生物工程技術研發(fā)中心有限公司,沈陽 110015)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)作為一種常見的多因素老年骨關節(jié)慢性退行性病變,其主要的病L過程包括關節(jié)軟骨破壞,滑膜炎癥,軟骨下骨破壞和骨贅形成,由其產生的功能障礙和疼痛,嚴重影響了中老年人的健康與生活質量。有研究顯示,80%～90%的65歲以上老年人都會存在骨關節(jié)炎樣軟骨改變[1]。流行病學數據顯示[2],美國大于60歲的老年人群中,有癥狀的OA患者大約占總人群數的10%,成為美國老年人群中最多發(fā)的骨關節(jié)疾病。隨著我國人口老齡化[3]與肥胖率[4]的不斷提高,OA患病率將會逐步升高。

由于損壞的膝關節(jié)軟骨本身血管稀少,再生能力弱[5],導致非手術治療主要目的在于控制疼痛和保護僅剩的關節(jié)功能,等到疾病晚期,外科手術關節(jié)置換成為唯一的治療方法,而對于引導膝關節(jié)修復的治療還未開展,有很大的研究前景[6]。利用哺乳動物的制作骨關節(jié)炎模型的方法已經相對成熟,如大鼠的Hulth法,碘乙酸(monoiodoacetic acid,M IA)注射,單純前交叉韌帶切斷法等[7]。由于這些方法主要是通過機械磨損的方法獲得OA模型,其造模時間就相對較長,并且還存在術后感染、手術創(chuàng)傷等易影響模型生化代謝的因素。M IA作為3-磷酸脫氫酶抑制劑,可以誘導軟骨細胞迅速死亡,因此MIA注射作為大鼠骨關節(jié)造模的快速方法,廣泛應用于大鼠骨關節(jié)炎疼痛方面的研究[8],但尚缺少在小鼠關節(jié)腔內注射的實驗數據。為更好地研究OA的病L生L過程,為臨床治療OA給予參考。本實驗初步探討了通過關節(jié)腔內注射MIA建立小鼠OA模型的可能性,并對不同劑量的MIA構建的小鼠OA模型進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

本實驗通過中國醫(yī)科大學動物倫L委員會審批。所有實驗操作根據中國醫(yī)科大學實驗動物處L操作進行。自遼寧長生生物有限公司購買6～8周齡雄性 C57BL/6小鼠 52只(合格證號211002300041841),體質量(20±1.1)g,SPF 級動物房室溫飼養(yǎng),晝夜規(guī)律交替(12 h/12 h),給予充足水,食物,給予自由活動空間。適應性飼養(yǎng)3 d后進行OA造模。

使用試劑:MIA、戊巴比妥鈉、HE染色試劑盒、番紅O-固綠染色試劑盒、75%酒精、10%多聚甲醛。

1.2 方法

C57BL/6小鼠隨機分為 4組,每組 13只:①0.025 mg/0.05 mg組;②0.1 mg/PBS組;③0.2 mg/空白組;④0.5 mg/空白組[9]。戊巴比妥鈉麻醉后應用眼科剪剔除膝關節(jié)處毛發(fā),行關節(jié)腔內注射術,注射前用游標卡尺測量小鼠初始膝關節(jié)寬度。將不同質量MIA溶于10μL的 PBS中注入膝關節(jié),在右側外方髕韌帶與髕骨旁韌帶中間縫隙處進針,直至針頭碰到股骨內上髁時,回退2 mm,然后注入MIA溶液,PBS對照組注入10μL PBS,空白對照組將針刺入關節(jié)腔內不做注射。注射完畢后,確保麻醉蘇醒和動物存活的情況下將小鼠放回籠內,保證充足食物飲水和活動空間。

1.3 組織取樣與數據測量

分別于膝關節(jié)注射后1 d、4 d、1周、2周和 4周測量小鼠膝關節(jié)寬度,并于1周、2周、4周測量各組小鼠質量,同時每組各取3只小鼠,脫頸致死,解剖膝關節(jié)進行大體觀察評分(表1)[9]。評分時脛骨內外側髁狀突均進行評分,取兩側中分數高者作為此關節(jié)的大體評分。

表1 評分標準Table 1 Scoring Standard

1.4 組織學測量

取出膝關節(jié)后,剔除多余肌肉組織,4%多聚甲醛固定后14%EDTA脫鈣21 d,每4 d換液一次,30%蔗糖溶液脫水24 h,然后進行OCT膠包埋冰凍切片,行矢狀位切片后HE染色與番紅O-固綠染色,番紅O-固綠染色切片請2位實驗員分開采用國際OA研究學會(Osteoarthritis Research Society Internation,OARSI)分級制度評分(表2)[10]

1.5 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行兩組實驗資料的統(tǒng)計學檢驗,實驗數據以平均數±標準差(±s)表示,進行t檢驗,P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 OARSI評分標準Table 2 OARSI Scoring Standard

2 結果

2.1 造模后小鼠的基本情況

經過注射后0.5～1 h后,所有小鼠均蘇醒,能自由在籠內活動、飲食。小鼠平均體質量從注射前(22.079±1.50)g增加為 28 d之后的(22.713±1.50)g(表3)。 28 d后小鼠均存活,活動基本正常,無特殊體態(tài)。

表3 小鼠平均體質量Table 3 Average w eight of m ice

2.2 膝關節(jié)寬度

經過注射后,各組的膝關節(jié)均有腫脹,膝關節(jié)寬度測量結果見表4所列。其中較大劑量組(≥0.1 mg)膝關節(jié)與較小劑量組(<0.1 mg)相比腫脹明顯(P<0.05),1 d后關節(jié)腫脹開始消退,直到1周后除0.5 mg組以外其余各組差異不顯著。給藥后1 d,0.5 mg組關節(jié)寬度顯著高于0.1 mg組與0.2 mg組(P<0.05);給藥2周后,各組之間膝關節(jié)寬度差異不顯著(P>0.05)。給藥4周后,較小劑量組(<0.1 mg)也分別有所上升,但并不存在統(tǒng)計學差異,可能與小鼠本身發(fā)育增長有關。

表4 膝關節(jié)寬度Table 4 Knee joint width

2.3 大體觀察評分

注射MIA 1周、2周、4周之后,獲取小鼠膝關節(jié)進行拍照并對其大體評分進行分析,由圖1可知,破壞主要居中在靠中心位置的骨關節(jié)面上,以小的軟骨缺損為主。由表5可知,除PBS組外各組的評分都有所增加,1周時0.2 mg組與0.5 mg組大體破壞較大(P<0.05),2周時0.1 mg組也出現(xiàn)了較大的損傷(P<0.05),4周時0.05 mg組也出現(xiàn)較大損傷(P<0.05),從變化趨勢來看,各組初始1周時評分差距大,2周之后各組的破壞程度差異明顯縮小,組間差異不明顯(P>0.05),但總體變化趨勢為2周大體損傷最大,4周之后大體損傷放緩。

表5 膝關節(jié)大體評分Table 5 Knee joint score

2.4 組織學觀察評分

圖1 膝關節(jié)損壞照片F(xiàn)ig.1 Photos of the knee joint dam age

注射MIA 1周、2周、4周后,獲取小鼠的膝關節(jié)切片進行HE染色和番紅O-固綠染色(表6、圖2和圖3)。較小劑量組(<0.1 mg)MIA在1周與2周時主要表現(xiàn)為關節(jié)面的粗糙和連續(xù)性中斷,而較大劑量組(≥0.1 mg)MIA對于關節(jié)面的破壞主要表現(xiàn)為軟骨的缺失和破碎。相較于PBS組的關節(jié)面,MIA注射后關節(jié)面軟骨細胞明顯紊亂、分布不均,番紅無法染色。從組織學評分來看(表6),0.5 mg組在1周時即表現(xiàn)出明顯破損,而0.2 mg組與0.1 mg組也在2周時表現(xiàn)出明顯損傷?？傮w看來,早期各個劑量之間損傷變化差異不大,但在4周之后劑量較小組(<0.1 mg)與較大劑量組(≥0.1 mg)差異明顯(P<0.05),同時,2～4周中較大劑量組(≥0.1 mg)在評分上差異不大,而較小劑量組(<0.1 mg)與PBS組的差距開始顯現(xiàn)(P<0.05)。

表6 膝關節(jié)切片組織學評分Table 6 Histological score of knee joint section

圖2 膝關節(jié)HE染色關節(jié)破壞Fig.2 Knee joint destruction with HE staining

圖3 膝關節(jié)番紅O-固綠染色關節(jié)破壞Fig.3 Knee joint destruction with safranin O-fixation green staining

3 討論

3.1 M IA對于膝關節(jié)軟骨的損傷特點

MIA的作用為抑制骨關節(jié)細胞中3-磷酸脫氫酶,切斷抑制細胞的三羧酸循環(huán),使蛋白質和多糖合成減少,最終導致細胞壞死,從而模擬 OA時的過程[11]。有文獻表示此方法無法造成臨床OA樣的損傷,推薦將此方法用于OA疼痛模型的建立[12],但也有文獻選擇將MIA用于OA破壞模型的建立[13-14],本文更傾向于MIA可以形成OA樣損傷而非僅造成疼痛。與此同時,M IA具有自身獨特優(yōu)勢,相較于傳統(tǒng)的 Hulth法、單純前交叉韌帶切斷法,MIA建立OA模型的方法速度較快,在1～2周內即可觀察到骨關節(jié)的損害。此外,相較于手術方法,注射的過程對于膝關節(jié)的損傷較小,不易產生感染和周圍軟組織損傷與結構性破壞。而韌帶切斷術后由于膝關節(jié)不再穩(wěn)定,手術后小鼠的日常的攀爬動作和懸吊動作,小鼠的搬運都有可能造成的關節(jié)異?；顒?從而對膝關節(jié)炎進程產生影響,增加了實驗結果異常的風險。

從大體和組織結果看來,MIA造成的膝關節(jié)破壞主要聚集在注射區(qū)域周圍,在注射過程中,可控性較差,手術法獲得的組織損傷,多體現(xiàn)為關節(jié)力學軸線的破壞,關節(jié)最大承重面從外側脛骨平臺變?yōu)閮葌让劰瞧脚_和股骨內上髁,破壞范圍較為確定可控[15]。

3.2 M IA劑量的選擇

3.2.1 膝關節(jié)寬度與MIA劑量的關系:從膝關節(jié)寬度研究結果可以發(fā)現(xiàn),第1周是關節(jié)寬度變化最大的時期,較大劑量組(≥0.1 mg)明顯更加嚴重,由此可知這是由于膝關節(jié)周圍軟組織受MIA不同劑量刺激可產生不同程度的炎癥腫脹。0.5 mg組在第1天時腫脹明顯,在7 d時明顯回落,在下降后與PBS組相比差異仍然顯著(P<0.05),0.1 mg與0.2 mg也在4～7 d時迅速下降,0.05 mg與0.025 mg組本身腫脹在4 d時才顯現(xiàn),但于1周時也開始下降,各個組的寬度變化在3周內不再明顯,這說明周圍軟組織水腫和消退與時間和劑量相關,雖然高劑量MIA對組織刺激更大,但機體的反應速度也更加迅速,而當其到達一個相對“平臺期”后,變化不再明顯。由此可知,在一定劑量范圍內注射M IA引起的OA滑膜炎可以在1周左右到達平臺期,而在平臺期之前,較大的劑量產生的滑膜炎也更加嚴重。

而在2周之后,PBS組、0.05 mg組與0.025 mg組出現(xiàn)了膝關節(jié)寬度上升,考慮到小鼠本身的體質量與體型的變化,可以暫時把這些程度較小的寬度增加歸因于機體的生長。

3.2.2 大體評分與MIA劑量的關系:在大體觀察中可以發(fā)現(xiàn),PBS組評分均為0～1分,而注射 MIA的脛骨平臺均出現(xiàn)細小的凹陷,這表明即使是少量的MIA也可在無骨組織結構破壞的情況下產生軟骨退變,這與OA早期病L過程相似,可以通過細化低劑量M IA來開發(fā)更貼近慢性OA的動物模型。

在2周之前,除PBS組以外各組均出現(xiàn)評分的上升,2周時1～2分處有 0.1 mg組,0.05 mg組與0.2 mg組,而當 4周 后0.2 mg組平均分達到2.5分,而 0.1 mg組,0.05 mg組平均分仍為1～2分。0.5 mg組在2周和4周均達到了2分以上的平均分。從評分的標準可以看出,2分以上的破壞存在片狀的軟骨損害,而非細小空洞,說明軟骨損傷更為明顯,但若需要通過MIA注射產生軟骨較大面積損害,應選擇 0.2 mg以上的劑量。若需要模擬晚期OA產生的骨質破壞,還需更高劑量的MIA進行實驗認證。

3.2.3 組織學分析:OARSI評分在0.5 mg注射4周后達到最大值6分[10],而本實驗0.5 mg組在4周時最高僅達到4分,這應該與小鼠品種和體質量不同有關。達4分之后,小鼠開始出現(xiàn)骨組織損傷,不宜再用軟骨損傷評估來評價OA嚴重程度,故本實驗推薦在大于4周以上通過組織學評價評估OA損傷的實驗中MIA劑量小于0.5 mg。

通過觀察各個時間點的組織學評分不難發(fā)現(xiàn),在1周之后較大劑量組(≥0.1 mg)評分出現(xiàn)了一個急劇的上升,而較小劑量組(<0.1 mg)上升較為平緩,0.025 mg組幾乎與PBS組相同,這說明較大劑量組(≥0.1 mg)MIA對于骨組織的損傷更加明顯,更適合用于短期內獲得滿意軟骨組織的損傷。而其中0.1 mg、0.2 mg、0.5 mg三組之間差距不大,沒有太大的統(tǒng)計學意義。

通過本實驗可以發(fā)現(xiàn),注射MIA產生的小鼠膝關節(jié)損傷與時間和劑量有關,較大劑量組(≥0.1 mg)的表現(xiàn)為短時間內的軟骨組織的破壞和劇烈的炎癥反應,較小劑量組(<0.1 mg)表現(xiàn)出輕度軟骨組織的破壞和可逆性炎癥反應。本實驗推薦0.1 mg劑量作為較大劑量組的代表劑量,0.05 mg劑量為較小計量組的代表劑量,但在大體觀察中可以發(fā)現(xiàn)0.2 mg組癥狀優(yōu)于0.1 mg組,故在OA模型特定研究中,應詳細考慮MIA的劑量和作用時間,以滿足實驗行為學和組織學需要。與此同時,仍然需要更為細化的濃度實驗和長期實驗來研究較大劑量組和較小劑量組的組內差異。選擇合適的MIA劑量來快速構建小鼠OA模型,對于之后的骨關節(jié)治療研究大有裨益。