陳越，宋振康，張海悅,2*

1(長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春， 130012)2(吉林省富生特醫(yī)食品有限公司， 吉林 長春， 130012)

龍葵果(Solanumnigrumfruit) 為茄科茄屬龍葵種，一年生草本植物，全國大部分省區(qū)均有分布[1]，具有清熱解毒、活血化瘀、利水消腫等功效。龍葵果中的主要成分大體可分為三類，即生物堿類成分、皂苷類成分和非皂苷類成分。其中最主要的有效活性成分的是生物堿類，其次是多糖。龍葵果多糖作為龍葵果中的主要成分之一，近年來國內(nèi)外學(xué)者通過實驗證明其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、腎臟保護、免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3]。

在對龍葵果多糖進行提取時，發(fā)現(xiàn)了多糖提取液中含有較多的蛋白質(zhì)，而對龍葵果多糖生物學(xué)功效研究的前提是獲得純度均一的多糖，所以脫蛋白是多糖分離純化中首要的、關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[4]。分離蛋白的方法主要有：三氯乙酸法、Sevage法及酶法脫蛋白等。其中Sevage 法脫蛋白條件較為溫和, 但脫蛋白效率不高, 往往需要操作多次才能達到滿意的效果, 操作繁瑣。酶法脫蛋白對復(fù)合酶的種類及比例選擇性高，應(yīng)用較為困難，實際操作中應(yīng)用較少。三氯乙酸法脫蛋白時，反應(yīng)較為劇烈，易破壞多糖原有構(gòu)型，部分多糖發(fā)生水解。但是三氯乙酸法是根據(jù)蛋白質(zhì)在有機酸的作用下，形成不可逆的沉淀，所以脫蛋白效果好且效率高[5-7]。

因此，本文通過響應(yīng)面法優(yōu)化了三氯乙酸脫除龍葵果多糖中蛋白質(zhì)的最佳工藝，為龍葵果多糖后續(xù)研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇、三氯乙酸、苯酚、濃H2SO4、考馬斯亮藍、牛血清白蛋白、葡萄糖等試劑均為分析純或化學(xué)純；實驗所用藥材購自于長春市吉林大藥房，經(jīng)鑒定為龍葵果。

紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司UVT5500TC；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州天瑞儀器有限公司HH4；循環(huán)水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；DHG—9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TG16G臺式高速離心機，湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HAO-100A小型快速粉碎機，廣州賽豪機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取儲備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于試管中，需平行測定3次，并以蒸餾水補至2.0 mL，加入6%苯酚1 mL，隨后加入濃H2SO45 mL，振蕩搖勻至沸水浴中，加熱30 min，取出后冷卻至室溫，然后用紫外分光光度計于480 nm處測吸光值。以葡萄糖溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察線性關(guān)系[8]，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.503 4x-0.007 7，R2=0.998 7。

1.2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取0.05 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補加蒸餾水至1.0 mL，隨后加入4 mL考馬斯亮藍溶液，輕輕振蕩，使其混勻，室溫靜置15 min，采用蒸餾水為空白對照，測定吸光光度值A(chǔ)595，測定3個平行樣，并取其平均值。橫坐標(biāo)(x)為牛血清白蛋白質(zhì)量，縱坐標(biāo)(y)為595 nm處吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.2.3 龍葵果多糖提取

取干燥龍葵果50 g，加入1 000 mL蒸餾水(料液比1∶20)，沸水浴上加熱5 h，重復(fù)2次，抽濾，取濾液，濃縮至一定體積，加4倍量的無水乙醇，靜置24 h，抽濾沉淀，即得深棕色粉末狀物質(zhì)[10]。冷凍干燥，稱重，得龍葵果粗多糖27.5 g。

1.2.4 三氯乙酸法脫蛋白

將龍葵果粗多糖配制成50 g/L的粗多糖水溶液，取粗多糖樣品溶液20 mL，加入適量的三氯乙酸，調(diào)節(jié)至最終濃度為50 g/L，4 ℃低溫靜置過夜， 3 000 r/min 條件下離心5 min，棄去沉淀，取上清液測蛋白質(zhì)含量[11]。

1.2.5 龍葵果多糖損失率的計算

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為對照品，取1 mL龍葵果粗多糖溶液，同法顯色后，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方式測量吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)無線中，計算脫蛋白前后多糖溶液中葡萄糖的含量[12]，按公式(1)計算多糖損失率：

(1)

式中：m1表示脫蛋白前多糖溶液中葡萄糖含量；m2表示脫蛋白后多糖溶液中葡萄糖含量。

1.2.6 龍葵果多糖中蛋白脫除率的計算

采用考馬斯亮藍法，以牛血清白蛋白為對照品，取1 mL龍葵果粗多糖溶液，同法顯色后，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方式測量吸光度值A(chǔ)，代入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算脫蛋白前后多糖溶液中蛋白質(zhì)的含量，按公式(2)計算蛋白脫除率：

(2)

式中：c1表示脫蛋白前多糖溶液中蛋白質(zhì)的含量；c2表示脫蛋白后多糖溶液中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.7 三氯乙酸法脫蛋白單因素試驗

將振蕩時間、除蛋白次數(shù)、三氯乙酸濃度作為考察因素，實驗設(shè)計如下：振蕩時間分別為10、15、20、25、30 min；除蛋白次數(shù)分別為1、2、3、4、5次；三氯乙酸質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 g/L。除了變動的單因素外，其余均采用預(yù)實驗中各因素的合適條件：振蕩時間20 min，除蛋白次數(shù)2次，三氯乙酸質(zhì)量濃度60 g/L。

1.2.8 龍葵果多糖脫蛋白的響應(yīng)面實驗

響應(yīng)面實驗是在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過分析各因素對龍葵果多糖脫蛋白率的影響程度，設(shè)計振蕩時間、除蛋白次數(shù)、三氯乙酸濃度為自變量，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計，對三氯乙酸法脫除龍葵果多糖中蛋白質(zhì)的條件進行優(yōu)化，其實驗因素和水平設(shè)計見表1[13-15]。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計因素和水平表Table 1 Box-behnken experimental designfactors and level table

使用Design-Expert 8.0.6軟件的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進行分析，最終獲得三氯乙酸法脫除龍葵果多糖中蛋白質(zhì)的最佳工藝條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實驗采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理。Box-Behnken設(shè)計采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合方差分析、顯著性檢測和響應(yīng)面分析，獲取回歸模型及最佳提取工藝參數(shù)。各組試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 三氯乙酸法脫除龍葵果多糖中蛋白質(zhì)的單因素結(jié)果分析

2.1.1 振蕩時間對蛋白脫除率和多糖損失率的影響

本實驗在三氯乙酸質(zhì)量濃度為60 g/L，除蛋白2次的條件下，分別振蕩5、10、15、20、25、30 min時，蛋白脫除率和多糖損失率如圖1所示。

圖1 振蕩時間對蛋白脫除率和多糖損失率的影響Fig.1 Effect of oscillation time on protein removal rate and polysaccharide loss rate

由圖1可知，隨著振蕩時間的增加，龍葵果多糖中蛋白質(zhì)脫除率呈緩慢增加又降低的趨勢，當(dāng)脫蛋白時間在20～25 min時，隨著時間延長蛋白質(zhì)脫除率逐漸升高，在25 min時，蛋白質(zhì)脫除率達到最高值為93.54%。之后隨著時間的增長，蛋白脫除率逐漸降低，所以蛋白脫除時間不宜過長[16-18]。但是在振蕩20 min時，多糖的損失率最小，因此，綜合考慮振蕩時間20 min為最佳。選擇15、20、25 min作為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

2.1.2 除蛋白次數(shù)對蛋白脫除率和多糖損失率的影響

本實驗在三氯乙酸質(zhì)量濃度為60 g/L，振蕩20 min的條件下，除蛋白1、2、3、4、5次時，蛋白脫除率和多糖損失率如圖2所示。

圖2 除蛋白次數(shù)對蛋白脫除率和多糖損失率的影響Fig.2 Effect of the number of protein removal on protein removal rate and polysaccharide loss rate

由圖2可知，除蛋白次數(shù)對脫蛋白率的影響不是很大，但是隨著除蛋白次數(shù)的增多，多糖的損失率也隨之增大，這是由于三氯乙酸與多糖溶液容易發(fā)生劇烈的反應(yīng)，導(dǎo)致多糖降解，影響多糖得率[19-21]。因此，綜合考慮選擇除蛋白次數(shù)2次，這時蛋白脫除率為86.06%。選擇1、2、3次作為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

2.1.3 三氯乙酸質(zhì)量濃度對蛋白脫除率和多糖損失率的影響

本實驗在振蕩20 min，除蛋白2次的條件下，分別加入質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 g/L的三氯乙酸，其蛋白脫除率和多糖損失率如圖3所示。

由圖3可知，隨著三氯乙酸濃度的增加，蛋白脫除率逐漸增大，在60 g/L時，蛋白脫除率達到最大值72.34%，隨著三氯乙酸濃度的持續(xù)升高，蛋白脫除率不再有顯著的變化，而多糖損失率卻逐漸增大。因此選取三氯乙酸溶液質(zhì)量濃度為60 g/L，此時多糖的損失率也達到最低值19.67%。選擇三氯乙酸質(zhì)量濃度為40、60、80 g/L作為響應(yīng)面設(shè)計的3個水平。

圖3 三氯乙酸濃度對蛋白脫除率和多糖損失率的影響Fig.3 Effect of trichloroacetic acid concentration on protein removal rate and polysaccharide loss rate

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化三氯乙酸脫除龍葵果多糖蛋白質(zhì)的工藝

2.2.1 Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，確定以振蕩時間(A)、除蛋白次數(shù)(B)、三氯乙酸質(zhì)量濃度(C)為基礎(chǔ)設(shè)計3因素3水平共17組響應(yīng)面分析實驗，實驗方案設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken center combination experimental design and results

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

以龍葵果多糖中蛋白脫除率為影響值，對中心組合的實驗結(jié)果進行回歸分析，獲得一個二次多項回歸方程：Y=93.25-0.13A+0.21B+0.024C-5.61AB-5.79AC-5.40BC-7.67A2-7.59B2-7.58C2

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Regression model analysis of variance table

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制得到響應(yīng)面曲面圖和等高線圖，如圖4、圖5、圖6所示，分別表示振蕩時間(A)和除蛋白次數(shù)(B)、振蕩時間(A)和三氯乙酸質(zhì)量濃度(C)、除蛋白次數(shù)(B)和三氯乙酸質(zhì)量濃度(C)交互作用的響應(yīng)面曲面圖和等高線圖。在響應(yīng)面圖中，坡面越陡峭，則表明蛋白質(zhì)脫除率受實驗因素影響越顯著，反之響應(yīng)面的坡面越平緩，則蛋白質(zhì)脫除率受實驗因素影響越小[23]。由圖4可以看出，在振蕩時間和除蛋白次數(shù)的交互作用下，對蛋白脫除率的影響是極顯著的，但是振蕩時間對蛋白脫除率的影響要大于除蛋白次數(shù)對蛋白脫除率的影響；圖5表明，在三氯乙酸質(zhì)量濃度和振蕩時間的相互作用下，三氯乙酸濃度對蛋白脫除率的影響大于振蕩時間對蛋白脫除率的影響；由圖6可以看出，在除蛋白次數(shù)和三氯乙酸質(zhì)量濃度的交互作用下，對蛋白脫除率的影響極為顯著，并且三氯乙酸質(zhì)量濃度對蛋白脫除率的影響要大于除蛋白次數(shù)對蛋白脫除率的影響。

圖4 振蕩時間和除蛋白次數(shù)交互的響應(yīng)面圖Fig.4 Response plots of interaction of oscillation time and number of protein removal

圖5 振蕩時間和三氯乙酸濃度交互的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface map of interaction between oscillation time and trichloroacetic acid concentration

圖6 三氯乙酸濃度和除蛋白次數(shù)交互的響應(yīng)面圖Fig.6 Response map of the interaction of trichloroacetic acid concentration and protein removal times

2.3 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證

通過回歸模型進行分析，預(yù)測出理論條件下的最佳脫蛋白工藝為：振蕩時間19.85 min，除蛋白次數(shù)1.73次，三氯乙酸質(zhì)量濃度64.8 g/L。其蛋白質(zhì)脫除率理論值為92.56%，考慮到實際操作的方便性和可行性，調(diào)整最佳工藝參數(shù)為：振蕩時間20 min，除蛋白次數(shù)2次，三氯乙酸質(zhì)量濃度為60 g/L，按此工藝進行3次平行實驗，測得龍葵果多糖中蛋白質(zhì)的脫除率為93.61%，多糖損失率為16.46%。實測結(jié)果與預(yù)測結(jié)果接近，表明基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化蛋白脫除率的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

3 結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實驗，確定了三氯乙酸法脫除龍葵果多糖中蛋白質(zhì)的最佳條件為三氯乙酸質(zhì)量濃度60 g/L，脫除次數(shù)2次，振蕩時間20 min，此條件下龍葵果多糖中蛋白的脫除率達93.61%，多糖損失率為16.46%。由此證明了三氯乙酸法是一種試劑用量少且效率高的脫除龍葵果多糖蛋白質(zhì)的有效方法。