彭 凱 王國霞 孫育平 陳 冰 莫文艷 黃燕華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東廣州510640）

隨著養(yǎng)殖規(guī)模化和集約化的迅猛發(fā)展，動物在養(yǎng) 殖過程中所面臨的人為活動、環(huán)境變化、飼料和水體中有毒有害物質(zhì)等各種應(yīng)激因子日益增加，從而造成氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是多種疾病發(fā)生的重要病理機制之一。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，機體組織和細胞內(nèi)氧自由基生成增加，導(dǎo)致活性氧家族累積而引起細胞氧化損傷，使機體抗氧化和免疫力下降并引發(fā)大規(guī)模病害，影響生產(chǎn)性能、產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全，同時給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。動物的健康程度與機體抗氧化防御體系的能力密切相關(guān)。應(yīng)用天然抗氧化活性物質(zhì)提高動物的抗應(yīng)激能力、降低病害的發(fā)生，是高效健康養(yǎng)殖和維持養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑，也是動物營養(yǎng)調(diào)控的研究熱點之一。但由于動物內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激途徑及自身防御機制仍不完全清楚，導(dǎo)致外源添加劑對機體抗氧化作用的調(diào)控機理不明，從而嚴重制約了抗氧化活性物質(zhì)的應(yīng)用。

縮合單寧（Condensed tannins）是由黃烷-3-醇單體組成的多酚化合物，是一種天然、綠色、安全的生物抗氧化劑，其抗氧化功能在食品和醫(yī)療行業(yè)已被人們所認知[1]?？s合單寧屬于植物次級代謝產(chǎn)物，在自然界中分布廣泛，常見于喬木、灌木、草本植物（百脈根）、豆科牧草（紅豆草、紫色達利菊）、谷物（高粱、黍、大麥、木薯）和水果（葡萄、黑莓、柿子、香蕉）之中，主要存在于細胞壁或植物的莖、皮、葉、花、種子之內(nèi)。與化學合成的抗氧化劑相比，縮合單寧具有安全性高、殘留及毒副作用小、抗氧化活性高等優(yōu)點，在抵御或減輕氧化應(yīng)激對機體的危害、減少動物疾病、提高生產(chǎn)性能等方面表現(xiàn)出巨大的研究價值和開發(fā)潛力。在抗氧化過程中，縮合單寧通過與苯酚耦合發(fā)生低聚反應(yīng)，導(dǎo)致自身反應(yīng)結(jié)合位點數(shù)量增加，因此比低分子量的多酚化合物表現(xiàn)出更強的抗氧化能力[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，縮合單寧具有提高機體抗氧化能力、清除自由基的功能，這對于預(yù)防疾病、修復(fù)受傷機體、增強動物健康等具有重要意義。本文概括了近年來縮合單寧抗氧化生物活性及其作用機理的研究進展，介紹了縮合單寧在促進動物抗氧化應(yīng)激和增強機體健康上的應(yīng)用。

1 縮合單寧對抗氧化酶的調(diào)控作用

已有研究表明，提高動物機體抗氧化能力的根本措施是通過提高酶促體系的功能[3]。天然多酚類化合物作為抗氧化劑的研究已被廣泛報道[4-5]。研究表明，單寧比低分子量多酚或非酚類抗氧化劑具有更強的抗氧化能力[2]。關(guān)于體外試驗對于單寧的抗氧化活性已有大量報道[6-9]，而體內(nèi)試驗也證實了單寧能夠提高動物血液[10-11]、肌肉[12]和肝臟[13]的抗氧化能力。Peng等[14]研究表明，縮合單寧通過提高血清總抗氧化能力和過氧化氫酶（CAT）活性增強綿羊的抗氧化能力。Franki?等[15]指出，栗木單寧可通過降低尿中丙二醛（MDA）濃度和減少血清淋巴細胞DNA損傷來緩解仔豬的氧化應(yīng)激。Wang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽縮合單寧通過降低肉雞血漿一氧化氮和MDA 濃度，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，進而減少機體氧化損傷。劉華偉[17]在兔日糧中添加栗樹縮合單寧可顯著清除對1,1-二苯基苯肼（DPPH）自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基，降低肝臟中MDA 含量，提高SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，增加肝臟中GSH-Px、SOD基因的表達量。

2 縮合單寧對Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化信號通路的調(diào)控作用

由氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧自由基直接或間接地損傷細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是眾多疾病發(fā)病的根本原因。Keap1-Nrf2/ARE 信號通路，即Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）-核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號通路，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的細胞抗氧化機制中最重要的通路。Keap1-Nrf2/ARE 信號通路是調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種抗氧化酶表達的關(guān)鍵通路。Nrf2以Ke?ap1-Nrf2/ARE 信號通路介導(dǎo)并激活下游多種抗氧化相關(guān)基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而減輕活性氧自由基（ROS）和親電子物質(zhì)引起的細胞損傷，在細胞防御保護和維持機體氧化與抗氧化生理平衡中發(fā)揮著重要作用，是近年來抗氧化研究領(lǐng)域的熱點。目前，大量研究報道了Keap1-Nrf2/ARE 信號通路在抵御氧化應(yīng)激、炎癥、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等多種病理生理進程中發(fā)揮的重要角色。正常生理狀態(tài)下，Nrf2以非活性狀態(tài)存在于胞漿中，與Ke?ap1 通過與同源結(jié)構(gòu)域Neh2 區(qū)偶聯(lián)并與胞漿肌動蛋白結(jié)合被錨定在胞漿中；當細胞或機體處于氧化應(yīng)激或親電子物質(zhì)的刺激下，Keap1結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而與Nrf2解偶聯(lián)，解離的Nrf2隨后進入細胞核與ARE啟動子結(jié)合，并調(diào)控下游靶基因的表達[18]。Nrf2被認為是調(diào)節(jié)細胞對抗異源性物質(zhì)和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[19]。關(guān)于Nrf2的活化機制，近年來研究發(fā)現(xiàn)激酶通路，包括絲裂酶原激活蛋白酶（MAPKs）、磷脂酰肌醇酶（PI3K）、蛋白激酶（PCK）等均參與Nrf2 的激活，原理是蛋白激酶能通過直接磷酸化Nrf2 的方式促使其與Keap1 解離，激活Nrf2[20]。Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的調(diào)控是十分精細和復(fù)雜的，目前已發(fā)現(xiàn)該信號通路調(diào)節(jié)的可編碼內(nèi)源性保護基因超過200個，其激活的基因種類取決于激活劑類型和激活方式，且存在其他信號通路的參與。多數(shù)文獻報道，Keap1-Nrf2/ARE信號通路的激活可啟動下游一系列靶基因，如CAT、SOD、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、醌氧化還原酶（NQO1）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）以及血紅素加氧酶（HO-1）的表達[21-22]，進而抵抗各種刺激對機體產(chǎn)生的氧化損傷。當前對Keap1-Nrf2/ARE信號通路的研究集中于抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，這也是信號通路調(diào)控的關(guān)鍵一步，抗氧化蛋白的表達可以清除過多的由于氧化還原失衡而增加的自由基，有助于維持細胞內(nèi)氧化平衡，使細胞免受損傷。

目前，少有文獻報道縮合單寧對Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的調(diào)控作用。Erlank 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，叔丁基對苯二酚、白藜蘆醇和姜黃素等多酚類化合物激活了細胞Nrf2/ARE 信號通路并增加了下游解毒酶的基因表達，Nrf2 和NQO1 的活性顯著提高。Han 等[24]指出，茶多酚提高了Nrf2 和HO-1 的基因表達量，增強了大鼠的抗氧化能力。Tamaki等[25]研究表明，白藜蘆醇能激活Nrf2/ARE 信號通路，改善8-羥基脫氧鳥苷和抗炎因子的基因表達水平以及NO 的代謝，從而減緩大鼠牙周炎。陳雁[26]發(fā)現(xiàn)，葡萄籽縮合單寧可激活Nrf2/ARE 信號通路，促進腎臟中Nrf2 及Ⅱ相解毒酶的表達，降低腎臟氧化損傷及細胞凋亡率。趙嬌[27]研究表明，葡萄籽縮合單寧通過提高Keap1 的mRNA表達量以減輕活性氧自由基對仔豬肝臟的氧化損傷；通過減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78 的mRNA 表達量和肝臟caspase-12 含量以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化損傷。蓮子皮縮合單寧可有效激活Nrf2/ARE 信號通路，促進Nrf2 解離，從而提高抗氧化保護基因HO-1的轉(zhuǎn)錄水平[28]。飼料中添加400 mg/kg 葡萄籽縮合單寧不僅不影響花鱸幼魚的生長性能，還能提高血清和肝臟抗氧化酶活性，并通過上調(diào)Nrf2基因表達降低10 h低氧脅迫累計死亡率[29]。

3 縮合單寧與腸道抗氧化細菌的相互作用

腸道是動物主要的消化代謝器官，也是縮合單寧作用的第一個靶點。然而，縮合單寧如何被腸道利用，以及提高腸道抗氧化狀態(tài)的作用機理尚不明確?？s合單寧是由黃烷-3-醇單體組成的聚合物，分子量在1 000～20 000 Da 之間[30]。黃烷-3-醇單體容易被腸道直接吸收而發(fā)揮作用，但低聚合度或高聚合度的縮合單寧并不能直接被腸道利用，而是被腸道細菌降解或轉(zhuǎn)化[31]。因此，人們推測縮合單寧的抗氧化作用可能存在其他重要的調(diào)控途徑，比如可能是通過與腸道微生物的相互作用實現(xiàn)的。通過在飼料中添加益生菌，如乳酸菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、雙歧桿菌（Bifidobaterium）、擬桿菌（Bacteroides）、腸球菌（Enterococcus）、芽孢桿菌（Bacillus）等，可增加動物腸道有益菌數(shù)量，修復(fù)腸黏膜損傷，從而增強宿主抵抗環(huán)境應(yīng)激和腸道疾病的能力[32]。

細菌的抗氧化性是當前研究熱點之一[33]。Lin等[34]報道，乳酸菌Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 和雙歧桿菌Bifidobateriumlongum ATCC 15708均能夠顯著抑制血脂的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除2, 2-二苯基-1-苦基苯肼自由基（DPPH），發(fā)揮抗氧化效果。相似地，乳酸菌Lactobacillus fermentum被定義為抗氧化細菌，因為其具有清除活性氧、抵抗超氧陰離子自由基和過氧化氫的作用[35]。乳酸菌Lactobacillus plantarum KCTC 3099 和C88 可通過與金屬離子Cu2+和Fe2+發(fā)生螯合，或通過增強抗氧化酶活性等方式清除活性氧自由基，增強抗氧化防御體系[36-37]。此外，一些乳酸菌被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生非酶類抗氧化活性物質(zhì)，如谷胱甘肽、硫氧化還原蛋白，間接清除自由基[35]。

腸道菌群是多酚發(fā)揮生物活性的關(guān)鍵因素[38]。體內(nèi)和體外研究均已證實，黃烷-3-醇單體和單寧可促進乳酸菌（Lactobacillus）和擬桿菌（Bacteroides）增殖，抑制梭菌（Clostridium）和葡萄球菌（Staphylococ?cus）生長，從而改善腸道健康[39]。研究發(fā)現(xiàn)，紫色達利菊縮合單寧可顯著抑制大腸桿菌Escherichia coli ATCC 25922 和35218 的生長，促進乳球菌（Lactococ?cus）和明串珠菌（Leuconostoc）的增殖[40-41]。最新研究表明，縮合單寧可降低花鱸腸道梭菌（Fusobacteria）豐度，增加變形菌（Proteobacteria）豐度，提高花鱸血清和肝臟的抗氧化力[42]。在縮合單寧的干預(yù)下，腸道微生物結(jié)構(gòu)組成可能發(fā)生變化，優(yōu)勢菌可直接發(fā)揮抗氧化作用，或者通過其代謝產(chǎn)物間接調(diào)控機體抗氧化狀態(tài)。相反，縮合單寧也能夠被腸道細菌降解或轉(zhuǎn)化，其代謝產(chǎn)物對于增強機體抗氧化和維持腸道健康的作用不容忽視[43]。黃烷-3-醇，如兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素，可以被擬球梭菌（Clostridium coc?coides）和雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）降解，生成丙酸、戊酸和戊內(nèi)酯等物質(zhì)[44]。研究表明，日糧縮合單寧通過小鼠腸道菌群的降解產(chǎn)物還包括苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸、苯乳酸、間苯三酚和異丙醇及其衍生物，而在人腸道中的主要代謝產(chǎn)物為乙酸、苯丙酸、丙酸和戊酸[45]。盡管縮合單寧的微生物降解產(chǎn)物及其對腸道健康的保護作用已被人們所關(guān)注，現(xiàn)有研究仍然局限于少數(shù)單一菌屬，且作用機理不明確，縮合單寧如何在魚類腸道中代謝并發(fā)揮作用還不清楚。因此，當前研究的努力方向在于明確縮合單寧與腸道微生物的互作規(guī)律，以及探討縮合單寧抗氧化作用的微生態(tài)機理。

4 結(jié)語

植物縮合單寧作為一種理想的抗生素替代品能夠有效增強動物抗氧化能力，調(diào)節(jié)動物腸道健康，但其作用機制尚不清楚。以往研究多停留在抗氧化酶活性及其基因表達水平。近年來發(fā)現(xiàn)，Keap1-Nrf2/ARE 信號通路在抵御動物機體抗氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮的重要角色，縮合單寧可激活Keap1-Nrf2/ARE 信號通路，上調(diào)抗氧化酶基因表達，增強機體抗氧化狀態(tài)。腸道菌群作為機體固有免疫的重要組成部分，其在抵御腸道氧化應(yīng)激中發(fā)揮直接抗氧化性或關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用?？s合單寧為聚合物，基本不被腸道吸收，而腸道菌群在縮合單寧發(fā)揮抗氧化作用中起關(guān)鍵作用。那么一系列科學問題值得我們深入探討：①縮合單寧對動物腸道抗氧化性細菌的調(diào)控作用及其作用機理；②縮合單寧對動物腸黏膜損傷修復(fù)和結(jié)構(gòu)完整性的影響；③縮合單寧的微生物降解產(chǎn)物與腸道抗氧化通路有何內(nèi)在聯(lián)系？未來研究應(yīng)當更多關(guān)注上述一系列科學問題的解答，這將有助于我們更加明確縮合單寧調(diào)節(jié)腸道健康和提高機體抗氧化作用的分子機制，亦為營養(yǎng)調(diào)控動物抗氧化作用提供理論依據(jù)和新思路。