陳 松，索世琪，李成立，張 飛，李佳奇，張 為*

(1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科，河北 邯鄲 056002；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科，河北 石家莊 050051)

頸椎前路椎間盤切除融合術(shù)(anterior cervical discectomy and fusion,ACDF)是目前治療頸椎退行性疾病最常用的手術(shù)方法之一。目前對于脊柱融合動物模型的研究多以胸腰椎為主。頸椎椎間融合動物模型多見于大型動物，但大型動物圍手術(shù)期管理復(fù)雜，因場地及經(jīng)費原因飼養(yǎng)大量的大型動物進(jìn)行研究是困難的。而小型動物又因椎體及附件過小不便于固定，術(shù)后X線難以觀察。目前國內(nèi)外研究缺乏成功的能很好模擬臨床頸椎椎間植骨融合后狀態(tài)的小型動物模型。本研究通過測量兔頸椎骨性結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用鋼板螺釘系統(tǒng)進(jìn)行兔頸椎椎體間植骨融合內(nèi)固定，并通過大體觀察、手觸檢查、X線檢查、微型計算機(jī)斷層掃描(micro computed tomography,Micro-CT)等檢查驗證該模型的可行性及安全性，為頸椎融合相關(guān)基礎(chǔ)研究提供一種可靠的動物模型。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用體重2.0～2.5 kg的健康雄性新西蘭白兔36只(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實驗動物中心提供)，隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，每組9只。A組用于解剖測量兔頸椎椎體結(jié)構(gòu)；B組(造模4周組)、C組(造模8周組)、D組(造模12周組)行頸椎椎間植骨融合內(nèi)固定。醫(yī)學(xué)實驗動物生產(chǎn)許可證編號SCXK(冀)2016-002；合格證編號181104。所有動物飼養(yǎng)條件相同，分籠飼養(yǎng)。本研究遵守動物倫理學(xué)要求，并經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2動物模型制作

1.2.1術(shù)前準(zhǔn)備 測量觀察兔頸椎解剖結(jié)構(gòu)并定制合適的鋼板螺釘(天津正天醫(yī)療器械有限公司,批號1800052159)，手術(shù)器械常規(guī)高壓消毒。術(shù)前6 h禁食水，稱重并記錄，配制麻藥。

1.2.2麻醉方法 采用20%烏拉坦(BOSF，W001)按3.5 mL/kg的劑量經(jīng)耳緣靜脈注射進(jìn)行全身麻醉。

1.2.3手術(shù)過程 麻醉成功后，兔側(cè)臥位于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。取髂嵴處切口，長約2 cm，逐層暴露髂骨外板，鈍性分離周圍軟組織，取約3 mm×4 mm大小髂骨塊備用，創(chuàng)面止血處理，待骨面無滲血后逐層縫合包扎。取仰臥位將兔固定于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，在顯微鏡輔助下行頸椎椎間植骨融合內(nèi)固定術(shù)。取頸前正中偏右切口，長約4 cm，由頸動脈鞘與氣管、食管鞘間隙鈍性分離至椎體前，C臂定位C2/3椎體間隙，注意保護(hù)血管神經(jīng)。仔細(xì)剝離頸長肌及前縱韌帶，在自制骨膜剝離子的輔助下顯露C2/3椎體間隙及上下椎體，用自制鉸刀去除C2/3椎間盤和終板，并在其輔助下將備用的髂骨塊植入C2/3椎體間隙。于上椎體的近下終板和下椎體近上終板處放置頸椎鋼板，使用鉆孔器鉆孔并置入螺釘。其他椎體操作同上。術(shù)區(qū)采用生理鹽水反復(fù)沖洗止血后逐層縫合包扎，造模完成。

1.3術(shù)后處理 術(shù)后分籠飼養(yǎng)，觀察其精神狀態(tài)、雙下肢運動、切口情況及營養(yǎng)狀況。切口處常規(guī)換藥并連續(xù)3 d給予青霉素5萬U肌肉注射。

1.4觀察手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生情況 并發(fā)癥包括死亡、食管損傷、神經(jīng)血管損傷、硬膜囊撕裂、術(shù)后切口感染、血腫形成、內(nèi)固定斷裂移位、髂骨供區(qū)感染及脊髓損傷等。

1.5評價方法

1.5.1大體觀察 觀察實驗動物術(shù)后進(jìn)食、活動量及對外界刺激的反應(yīng)。

1.5.2影像學(xué)檢查 B、C、D組分別于術(shù)后4，8，12 周麻醉后行頸椎正側(cè)位X線檢查，觀察鋼板及螺釘位置以及是否存在內(nèi)固定脫落、松動及椎間融合等情況。取出兔融合節(jié)段頸椎標(biāo)本，剝離周圍的肌肉及軟組織，保留骨性結(jié)構(gòu)部分后在18 μm分辨率下對各組標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT檢查，以評估新骨生成及脊柱融合情況。使用分析軟件測定B、C、D組新生骨體積與植入材料總體積的比值(bone volume/total volume,BV/TV)。采用雙盲法由2名未參加實驗的醫(yī)生進(jìn)行讀片，觀察頸椎椎間植骨融合情況，根據(jù)有無骨形成或融合進(jìn)行評分，見表1。

表1 放射學(xué)評分系統(tǒng)

1.5.3手觸檢查 X線檢查完畢后采用空氣栓塞法處死B、C、D組實驗動物，取出兔融合節(jié)段頸椎標(biāo)本進(jìn)行手觸檢查。去除頸椎軟組織及前路鋼板、螺釘，采用雙盲法由2名未參加實驗的醫(yī)生對標(biāo)本進(jìn)行屈伸、側(cè)彎及扭轉(zhuǎn)來檢測融合節(jié)段的活動度，并且根據(jù)有無活動進(jìn)行評分。無活動：融合;有活動：未融合。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兔頸椎解剖結(jié)構(gòu)及鋼板螺釘規(guī)格 兔頸椎椎體呈細(xì)腰鼓狀，椎體兩端粗大，中間稍細(xì)，椎體前面有骨嵴隆起，兩側(cè)為平整的斜面，測量頸椎椎體近終板處矢狀徑、橫徑、斜徑(骨嵴最高點旁開1 mm與矢狀徑呈45 °)及椎體長度(圖1)。自頸2(C2)～頸6(C6)椎體長度、椎體下端矢狀徑逐漸減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，C2～C6椎體下端橫徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，C2～C6椎體下端斜徑變化波動，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。根據(jù)兔子椎體解剖結(jié)構(gòu)，選用螺釘和鋼板的規(guī)格分別為1.7 mm×4 mm和4 mm×11 mm,在兔椎體的側(cè)前方進(jìn)行鋼板固定，螺釘斜向后上方與椎體斜徑平行，避免進(jìn)入椎管損傷脊髓,置入鋼板時，根據(jù)術(shù)中情況可適當(dāng)調(diào)整(圖2)。

表2 兔頸椎骨性結(jié)構(gòu)測量數(shù)據(jù)

2.2術(shù)后并發(fā)癥 術(shù)中因麻藥過量死亡3只,B組1只,C組0只,D組2只;術(shù)后感染死亡1只,C組1只；C組術(shù)后出現(xiàn)雙下肢癱瘓1只，可能因術(shù)中損傷脊髓有關(guān)，雖加強(qiáng)護(hù)理清潔并給與藥物治療，但最終因絕食而死亡。所有死亡動物均及時補(bǔ)齊。

2.3大體觀察 實驗動物術(shù)后當(dāng)天飲食、活動及對外界刺激反應(yīng)差，術(shù)后第1天對外界刺激反應(yīng)可，飲食和活動稍差。術(shù)后第2天飲食、活動及對外界刺激反應(yīng)基本恢復(fù)正常。

2.4影像學(xué)觀察 B、C、D組分別于術(shù)后4，8，12 周麻醉后行頸椎正側(cè)位X線檢查(圖3A～C)，B組植骨及鋼板位置良好，可見明顯間隙，其中1例出現(xiàn)螺釘松動退釘，其余無內(nèi)固定斷裂、移位等情況。C組和D組植骨及內(nèi)固定位置良好，無內(nèi)固定松動、斷裂情況。C組椎間隙已模糊，可見骨痂生長；D組椎間隙已與上下椎體骨性連接。Micro-CT結(jié)果顯示B組可見椎間有骨痂形成，但仍可見明顯間隙;C組見椎間骨痂大量生長，間隙模糊;D組見椎間有連續(xù)骨性連接，無明顯間隙，已達(dá)到臨床融合效果。C組BV/TV和X線評分高于B組，D組BV/TV和X線評分高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 BV/TV和X線評分比較

2.5手觸檢查結(jié)果 手觸摸檢查，B組椎間融合2例，融合率為22.2%(2/9);C組椎間融合5例，融合率為55.6%(5/9);D組椎間融合8例，融合率為88.9%(8/9)。

3 討 論

ACDF目前已成為治療退行性頸椎間盤病變的金標(biāo)準(zhǔn)。自體骨具有骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)、無免疫排斥反應(yīng)、安全性高等特點，目前自體骨移植仍是骨移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1-3]。自體骨作為椎間融合植骨材料在臨床上應(yīng)用廣泛[4-5]。但自體骨移植存在一系列問題，如來源有限、術(shù)后供區(qū)疼痛等。另外，由于骨量的限制及松質(zhì)骨含量較少，不適合大范圍的骨移植。人工植骨替代材料可彌補(bǔ)自體骨移植骨量不足的缺點、減少并發(fā)癥，近年來已逐漸成為研究熱點[6-8]。為了研究不同植骨材料或方式對脊柱融合的影響，研究者設(shè)計了一系列脊柱融合實驗動物模型[9-15]。然而，山羊、犬、豬等大型動物常因受到經(jīng)濟(jì)和規(guī)模上的限制，導(dǎo)致研究結(jié)果不可避免會產(chǎn)生偏倚，影響其可靠性。而大鼠頸椎椎體及附件過小不便于固定，術(shù)后X線也難以觀察其融合程度。兔的脊柱解剖結(jié)構(gòu)與人具有一定相似性，其為爬行動物，軸向應(yīng)力與人在直立狀態(tài)下不盡相同，盡管兩者植骨融合過程存在一定的差異，但是因其價格低廉，耐受性較強(qiáng)，術(shù)后進(jìn)食、抗感染等也相對容易控制，已廣泛用于研究脊柱融合[16]。目前兔脊柱融合模型多為腰椎后外側(cè)橫突間植骨融合。但該模型無法真實模擬目前臨床上應(yīng)用較多的融合方式即椎間融合。兔頸椎椎間植骨融合模型目前報道較少，本研究根據(jù)兔頸椎的解剖特點，設(shè)計出一種能真實模擬頸椎A(chǔ)CDF手術(shù)路徑和融合方式的頸椎植骨融合模型的制作方法。本研究選取2～2.5 kg健康雄性新西蘭大白兔9只進(jìn)行頸椎椎體解剖測量，根據(jù)兔頸椎解剖數(shù)據(jù)，確定鋼板及螺釘規(guī)格及置入位置。為了保證置入鋼板及螺釘?shù)陌踩约胺€(wěn)定性，在兔頸椎側(cè)前方進(jìn)行鋼板固定。相較于側(cè)方固定，側(cè)前方固定可避免因術(shù)野暴露過大、術(shù)中失血過多而致動物死亡。另外，此處較為平整，更利于鋼板與椎體貼附、固定。術(shù)后X線檢查見植骨及鋼板位置均良好。置入螺釘?shù)奈恢眠x擇椎體下端距離終板約2 mm處，此處椎體矢狀徑、橫徑、斜徑較大，沿斜徑方向置入螺釘，根據(jù)所測頸椎解剖數(shù)據(jù)，可避免螺釘進(jìn)入椎管損傷脊髓。本研究結(jié)果顯示，B、C、D3組均未發(fā)生因螺釘進(jìn)入椎管內(nèi)挫傷脊髓致術(shù)后癱瘓，僅B組術(shù)后發(fā)生螺釘松動退釘1例，表明螺釘置入的方法安全可靠。

本研究采用烏拉坦進(jìn)行麻醉，早期因麻藥過量致實驗動物死亡3只，隨著對麻藥劑量的調(diào)整和技術(shù)的提高，中后期未發(fā)生此類情況。盡管烏拉坦對實驗動物細(xì)胞膜、心血管活動、血液流變學(xué)、血糖以及癌基因有明顯影響，但其價格便宜、容易配制、麻醉效果穩(wěn)定、維持時間長、對呼吸與循環(huán)抑制力弱、肌肉松弛好等優(yōu)點，廣泛用于實驗動物麻醉。因此采用20%烏拉坦按3.5 mL/kg劑量經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射進(jìn)行全身麻醉是安全可靠的。在麻醉時，須精確測量體重，根據(jù)體重計算給藥劑量，耳緣靜脈注射麻藥時須遵循先快后慢，勻速推進(jìn)的原則。先快速推入總藥量的1/3，剩下的2/3緩慢勻速推入，給藥過程中須密切觀察兔子的狀態(tài)。術(shù)后感染死亡1只，可能與術(shù)中不慎污染手術(shù)器械有關(guān)。術(shù)后出現(xiàn)雙下肢癱瘓1只，分析原因可能是椎間盤摘除植骨融合過程中損傷脊髓所致。兔頸椎椎間隙自前下略斜向后上，有一定角度，摘除椎間盤和去除終板時須提高注意、動作輕柔，沿椎間隙方向進(jìn)行，避免因不當(dāng)操作損傷脊髓致使實驗動物術(shù)后肢體癱瘓或死亡。摘除間盤后去除終板直至滲血，給予充足骨量植骨以及維持椎間穩(wěn)定是椎間融合的關(guān)鍵。本研究采用自體髂骨作為骨移植材料并采用Micro-CT評估新骨生成及脊柱融合情況。Micro-CT在骨代謝領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，是評價骨形態(tài)和骨微結(jié)構(gòu)的計算機(jī)體層成像系統(tǒng)。Micro-CT具有高分辨率、使用方便等特點，可以獲得檢測骨組織內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)信息，在小動物標(biāo)本和大型動物離體標(biāo)本的研究領(lǐng)域扮演著重要的角色。Micro-CT檢測BV/TV能夠反映不同樣本骨小梁的骨量，BV/TV值增高說明骨合成代謝大于分解代謝，骨量增加。BV/TV結(jié)果說明在骨量增加方面D組優(yōu)于B組和C組，C組優(yōu)于B組(P<0.01)。結(jié)合X線、Micro-CT和手觸檢查，結(jié)果表明隨著時間的推進(jìn)，椎間融合程度及新生骨量方面日漸增加。

綜上所述，兔頸椎椎間植骨內(nèi)融合固定動物模型設(shè)計合理、容易操作、費用低廉、與臨床上椎間融合相符，可為頸椎椎間融合的基礎(chǔ)研究提供了一種可靠的動物模型。(本文圖見封三)