張鳳玉，俞霽云，陳明星，王 軍，丁昌平，蔡逸婷*

(1.上海市第一人民醫(yī)院檢驗科，上海 200080；2.上海藝星整形美容醫(yī)院整形外科，上海 200030；3.揚州大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，江蘇 揚州 225001)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是由多種病因引起的慢性致死性疾病，常見的病因主要有：肺部疾病或缺氧誘發(fā)的PAH；由左心衰引起的PAH；慢性血栓栓塞性PAH；具有不明確或多種病因的PAH；肺靜脈閉塞性疾病或肺毛細(xì)血管血管瘤誘導(dǎo)的PAH[1]。低氧性PAH是臨床上最常見的病理生理過程，也是慢性阻塞性肺疾病、慢性肺心病和高原PAH等心肺疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。當(dāng)下對PAH的治療熱點多集中在分子和基因水平上[3]，筆者通過持續(xù)通入N2使氧含量維持在10%左右，慢性低氧培養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠低氧性PAH模型，用重組腺病毒載體介導(dǎo)的p53消減基因轉(zhuǎn)染低氧性PAH模型的大鼠，旨在探索低氧性PAH大鼠模型的建立方法，觀察p53對低氧性PAH大鼠肺動脈壓力和細(xì)胞凋亡的影響，為低氧性PAH的研究提供實驗動物模型及新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD大鼠60只，雄性，體重180～200 g，7周齡，SPF級，購自上海斯萊克公司，SCXK(滬)2017-0005，合格證號20170005004525。飼養(yǎng)條件：溫度范圍20～25 ℃，相對濕度范圍40%～70%，自由飲食。實驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)一周，實驗過程中對動物的處置符合揚州大學(xué)動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2實驗材料 重組腺病毒質(zhì)粒Adeno-null,Adeno-p53由廣州賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建, TurboFect Transfection reagent(R0531)購自Thermo Scientific公司，293A細(xì)胞購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(11684817910)購自Roche公司，蛋白酶K(RT403-01)購自天根生物有限公司，蘇木素(H9627)購自Sigma公司，氯化鈉注射液購自河北天成藥業(yè)股份有限公司。低氧艙：ZKY-4F氧濃度監(jiān)測儀，小動物呼吸機(HX-101E)、生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420S)購自成都泰盟軟件有限公司。

1.3低氧性PAH模型的建立 將SD大鼠隨機分為常氧對照組、常氧實驗Adeno-null組、常氧實驗Adeno-p53組、低氧對照組、低氧實驗Adeno-null組和低氧實驗Adeno-p53組各10只，常氧組為正常氧濃度培養(yǎng)，低氧組則置于常壓低氧箱內(nèi)，氧濃度維持在(10±0.5)%，8 h/d，連續(xù)4周。每天觀察并記錄大鼠外觀體征、行為活動等。

1.4重組腺病毒的Adeno-p53的制備 3條構(gòu)建好的pAV-p53載體質(zhì)粒和空白對照組腺病毒載體質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑室溫混合后，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，反復(fù)擴增，空斑實驗法測定轉(zhuǎn)染液病毒滴度。Quantitative-PCR法測得重組腺病毒Adeno-p53和空白對照組的滴度分別為3.2×1010pfu/mL和1.0×1010pfu/mL。使用前，用無菌的生理鹽水將腺病毒Adeno-null與Adeno-p53稀釋至3×108pfu/mL。

1.5重組腺病毒的轉(zhuǎn)染 4組大鼠喂養(yǎng)2周后，采用氣管滴入法轉(zhuǎn)染重組腺病毒，大鼠用戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，剃毛消毒，經(jīng)口-氣管插管行機械通氣，同時鈍性分離頸部肌肉暴露氣管，在會厭軟骨下方氣管里滴入30 μL腺病毒，浸潤一段時間后。將大鼠頭朝上直立，使病毒均勻分布于各肺葉。所有滴入腺病毒后的大鼠置于恒溫墊上，統(tǒng)一右側(cè)臥位，等待自然蘇醒。滴入腺病毒12 h后分別放入低氧艙和正常培養(yǎng)環(huán)境中，繼續(xù)飼養(yǎng)2周。

1.6平均頸總動脈壓及平均肺動脈壓測定 動物飼養(yǎng)4周后，巴比妥鈉45 mg/kg麻醉后連接呼吸機，分離頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動脈夾固定近心端。插管后利用生物機能實驗系統(tǒng)監(jiān)測大鼠頸總動脈壓，待穩(wěn)定后連續(xù)監(jiān)測5～10 min。分離頸總動脈后，游離右側(cè)頸外靜脈，將導(dǎo)管自右頸外靜脈內(nèi)慢慢插入，待壓力波形穩(wěn)定后，實時記錄肺動脈壓。

1.7右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index,RVHI) 右心導(dǎo)管測壓后處死大鼠，快速取出心臟，分離右心室和左心室加室間隔，分別稱量右心室(right ventricular，RV)和左心室+室間隔[(left ventricle,LV)+(interventricular septum,S)]的重量，以RV/(LV+S)作為RVHI。依據(jù)RVHI評估右心室質(zhì)量變化，判定有無右心室肥厚。

1.8細(xì)胞凋亡TUNEL染色 取左肺用4%甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水水化，PBS沖洗。Proteinase K工作液37 ℃消化20 min，PBS沖洗。每片加5 μL TDT+45 μL 熒光素標(biāo)記的dUTP混合液，37 ℃反應(yīng)1 h，PBS沖洗。每片加50 μL converter-POD，37 ℃作用30 min，PBS沖洗。加適量DAB底物，顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染數(shù)秒，水洗后脫水，透明，封片后鏡下拍照，隨機采集5個不重復(fù)視野，計數(shù)凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)=動脈平滑肌細(xì)胞凋亡數(shù)目/平滑肌細(xì)胞數(shù)目。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad prism 6.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用兩獨立樣本的t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1實驗動物一般情況觀察 造模過程中正常氧培養(yǎng)組狀態(tài)良好，行為活潑，毛發(fā)光潤，飲食排便正常，無死亡出現(xiàn)。低氧培養(yǎng)組從活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)入睡眠、安靜、少動狀態(tài)，食物飲水減少，體重降低，精神狀態(tài)低迷，病死率20%。病毒滴入實驗不會干擾常氧組大鼠的行為特征和活動。

2.2低氧性PAH模型的鑒定 常壓下持續(xù)通入10.0% O2培養(yǎng)4周的大鼠與正常情況下培養(yǎng)的大鼠相比，平均肺動脈壓力顯著升高，右心室明顯肥厚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，平均頸總動脈壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示低氧培養(yǎng)可以成功建立大鼠的低氧性PAH模型。見表1。

表1 低氧對照組與常氧對照組大鼠平均頸總動脈壓、平均肺動脈壓及RVHI的比較

2.3Adeno-p53轉(zhuǎn)染對大鼠頸總動脈壓及肺動脈壓的影響 低氧培養(yǎng)條件下，與低氧實驗Adeno-null組相比，低氧實驗Adeno-p53組肺動脈壓和RVHI降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，頸總動脈壓力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示p53消減可明顯減低低氧性PAH的肺動脈壓力。見表2。

表2 低氧條件下Adeno-P53轉(zhuǎn)染對大鼠頸總動脈壓及肺動脈壓及RVHI的影響

2.4Adeno-p53轉(zhuǎn)染后檢測各組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡情況 低氧實驗Adeno-p53組的肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于低氧實驗Adeno-null組及低氧對照組，低氧實驗Adeno-null組和低氧實驗Adeno-p53組細(xì)胞凋亡指數(shù)高于常氧對照組，常氧實驗Adeno-null組和常氧實驗Adeno-p53組大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)高于常氧對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示p53消減會促進(jìn)大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡，同時亦增加低氧性PAH模型中肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡。見表3，4，圖1。

表3 常氧Adeno-null組與常氧實驗Adeno-p53組凋亡細(xì)胞數(shù)比較

表4 低氧Adeno-null組與低氧實驗Adeno-p53組凋亡細(xì)胞數(shù)比較

3 討 論

低氧性PAH影響因素眾多，且大部分相互交錯形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。臨床上PAH患者肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖增多，凋亡降低，大多由平滑肌細(xì)胞的固有特征和外源性調(diào)控平滑肌細(xì)胞生長的各種基因的異常表達(dá)所致[4-5]。目前國內(nèi)外的研究多集中在低氧動物模型，側(cè)重分析各種因子的變化、血管再生和重塑、動脈狹窄、低氧誘導(dǎo)、細(xì)胞增殖等。本研究利用持續(xù)通入N2控制O2濃度為10%左右，模擬低氧環(huán)境，隨之將大鼠置于其中28 d，復(fù)制大鼠的低氧性PAH模型，檢測發(fā)現(xiàn)低氧條件下大鼠平均肺動脈壓比常氧條件明顯增加，同時低氧組大鼠右心室肥厚指數(shù)明顯增高，表明低氧性PAH模型建立成功。慢性低氧是PAH形成的重要因素之一，根據(jù)最新的PAH分類指南[6]，高原PAH是PAH分類的第3類，而低氧性PAH模型是高原PAH研究的首選模型，該模型制作簡便，重復(fù)性高，模型中大鼠存活率高，同時接近臨床PAH發(fā)病的自然病理過程，并且可以模擬臨床上一般PAH患者的病理特征[7]。該模型的成功建立及其與臨床PAH病理生理過程的相似性，為臨床上研究低氧性PAH發(fā)病機制和新型靶向藥物提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

p53是近年研究最為廣泛和深入的腫瘤抑制基因之一，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。p53是一種位于細(xì)胞核的多效性轉(zhuǎn)錄因子，可參與細(xì)胞內(nèi)眾多的生理和病理過程[8-9]，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、血管生成、生長因子信號傳導(dǎo)等調(diào)節(jié)[10-11]。也有研究表明p53是低氧誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵因子[12-14]。研究顯示p53基因會隨著低氧時間增加而在低氧性PAH大鼠肺組織中的表達(dá)逐漸增加(尤其是平滑肌細(xì)胞)，且大鼠肺組織肺動脈平滑肌細(xì)胞異常增殖增加，管壁增厚，管腔狹窄，p53基因增加會促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞異常增殖，因而可以推測p53消減后，肺動脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞增殖減少，凋亡增加[15]。另有研究顯示在PAH中表達(dá)增加的p53基因會失去下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的作用，使Bcl-2表達(dá)增加[16]。筆者利用p53消減腺病毒轉(zhuǎn)染低氧性PAH后的大鼠，其平均肺動脈壓力較低氧性PAH組大鼠明顯降低，p53消減干擾后的低氧組大鼠的右心室肥厚指數(shù)與低氧對照組對比也顯著降低，同時肺動脈平滑肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯高于PAH模型對照組。由此推斷，消減p53基因的表達(dá)可促進(jìn)肺血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，而低氧環(huán)境下促凋亡基因和促增殖基因的表達(dá)失衡是目前公認(rèn)的導(dǎo)致肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的原因之一。PAH的發(fā)生發(fā)展及其嚴(yán)重程度與肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，誘導(dǎo)凋亡可以減輕PAH的發(fā)病程度[14]。p53基因在特定條件下具有決定細(xì)胞命運的重要作用，研究證實低氧時肺動脈平滑肌細(xì)胞中p53等促凋亡基因減少，此過程參與低氧時肺血管壁的重建和慢性PAH的形成[17-19]。慢性低氧性PAH模型中，血管平滑肌增殖活性升高的同時，細(xì)胞凋亡也有所增強，其生理意義在于試圖從整體上維持平滑肌細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)平衡。而血管平滑肌細(xì)胞凋亡增加是為了對抗其增殖增強，是防止血管壁過度增厚的保護(hù)性反應(yīng)。凋亡降低可能與p53的表達(dá)增高有關(guān)，p53可以緩解肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的失衡狀態(tài)，在一定程度上延緩PAH的進(jìn)展。