劉 敏,張才圣,柏正平,3*
(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙410208;2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,湖南 長沙410006;3.湖南省中醫(yī)藥研究院,湖南 長沙410006)
哮喘是一種慢性炎癥性呼吸道疾病,是目前全球發(fā)病率較高的呼吸道疾病之一,嚴重影響人們的健康生活[1]。黏液高分泌是其最為關(guān)鍵的病理特征,也是導(dǎo)致哮喘患者死亡的最主要因素[2]。Akaba 等[3]研究表明,哮喘中黏液過度分泌的原因在于氣道杯狀細胞增生,分泌過量的黏蛋白。 其中,黏蛋白5AC(MUC5AC)是支氣管哮喘患者體內(nèi)含量最豐富的黏液蛋白[4],豆蔻?;槐彼峒っ窩 底物(MARCKS)為誘導(dǎo)氣道黏液蛋白過度分泌的關(guān)鍵作用因子[5]。
目前,常用于緩解哮喘的藥物為糖皮質(zhì)激素類及β 受體激動劑等藥物[6-7]。但臨床運用上發(fā)現(xiàn),中藥對于防治支氣管哮喘也有較好的療效[8]。哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇,多見于中老年人,臨床以風(fēng)哮證多見,主要病機為風(fēng)盛痰阻、氣道攣急[9]。 麻葶舒喘湯是湖南中醫(yī)藥大學(xué)柏正平教授治療支氣管哮喘的臨床經(jīng)驗方,具有止咳、平喘、祛痰的功效,對于哮喘-風(fēng)哮證的臨床療效顯著且安全性強,但其具體的作用機制尚不清楚。 因此,本研究探討麻葶舒喘湯對支氣管哮喘模型小鼠氣道黏液蛋白的干預(yù)作用,為麻葶舒喘湯進一步臨床推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
清潔級雌性BALB/C 小鼠60 只,6~8 周齡,體質(zhì)量范圍21~29 g,由湖南省中醫(yī)藥研究院動物實驗中心提供,許可證號:SCXK(湘)2016-0002。 實驗動物環(huán)境:小鼠分籠飼養(yǎng),室溫18~20 ℃,濕度65%~70%,自由飲水進食。 適應(yīng)環(huán)境7 d 后開始實驗。
HE 染色試劑盒(GP1031,武漢賽維爾生物科技有限公司);PAS 染色試劑盒(GP1039,武漢賽維爾生物科技有限公司);Super ECL Plus 超敏發(fā)光液(32109,美國Thermo pierce 科技有限公司);HiFi-Script cDNA 第一鏈合成試劑盒(CW2569,北京康為世紀生物科技有限公司);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0010S,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);RIPA 裂解液(CW2333,北京康為世紀生物科技有限公司);TrizolTMPlus RNA 純化試劑盒(12183555,美國Invitrogen 生命技術(shù)有限公司);鼠抗MUC5AC(MA1-21907,美國Invitrogen 生命技術(shù)有限公司);兔抗MARCKS(10004-2-Ig,美國Proteintech 科技有限公司);鼠抗β-actin(60008-1-Ig,美國Proteintech 科技有限公司);山羊抗小鼠IgG(CW0102,北京康為世紀生物科技有限公司);山羊抗兔IgG(CW0103,北京康為世紀生物科技有限公司)。
醫(yī)用壓縮霧化器(MI-M680,深圳市摩力康醫(yī)療科技有限公司);熒光定量PCR 儀(PIKO REAL 96,芬蘭Thermo 公司);-80 ℃超低溫冰箱(DW-HL388,中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司);臺式冷凍離心機(TGL-18R,深圳黑馬電子科技有限公司);紫外分光計(UV-5200,上海元析儀器有限公司);熒光顯微鏡(BX51,日本Olympus 公司);電泳儀(1645050,美國BIO-RAD 公司)。
地塞米松片(浙江仙琚制藥,0.75 mg/片);生理鹽水(安徽豐原,250 mL/瓶),以上藥物均購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。 雞卵白蛋白(ovalbumin,OVA)購自美國Sigma 公司。酚紅購自上海躍騰生物技術(shù)有限公司。中藥材購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房,經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科田其學(xué)教授鑒定為道地藥材。
2.1.1 麻葶舒喘湯的制備 麻葶舒喘湯組成:炙麻黃 10 g,地龍10 g,蟬蛻10 g,桑白皮10 g,辛夷10 g,法半夏10 g,射干10 g,白果10 g,葶藶子10 g,紫蘇子10 g,磁石15 g,浙貝母10 g,水蛭3 g,甘草6 g。 一煎加水500 mL,煎汁150 mL;二煎加水300 mL,煎汁150 mL;兩次煎煮液合并濃縮至含生藥2 g/mL 的膏狀,置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.1.2 分組、 造模 實驗選擇60 只BALB/C 雌性小鼠[10],隨機分為空白組、模型組、地塞米松組及麻葶舒喘湯高、中、低劑量組,10 只/組。根據(jù)劉貴穎改良法[11]制作哮喘小鼠模型,于造模第1、14 天腹腔注射新鮮配制的OVA 致敏液(含OVA 100 μg),注射量為0.2 mL/只。 造模第14 天起,每組給予5%OVA 霧化激發(fā),1 次/d,30 min/次,連續(xù)刺激7 d。 空白組給予同體積生理鹽水替代OVA 致敏液,處理同上。 造模成功的依據(jù)為:小鼠出現(xiàn)噴嚏、喘息、抓耳撓腮等癥狀[12]。
2.1.3 給藥 造模第14 天起,各組小鼠開始給藥,每次霧化激發(fā)前30 min 進行灌胃給藥,每天1 次??瞻捉M與模型組分別給予劑量為0.1 g/mL 的生理鹽水;地塞米松組給予劑量為0.1 g/mL 的地塞米松混懸液;麻葶舒喘湯不同劑量組參考臨床上70 kg人的等效劑量,根據(jù)“人與實驗動物間體表面積比值表”換算出小鼠的等效劑量為人的9.1 倍,并將此劑量設(shè)為低劑量組,中、高劑量組分別為低劑量組的2 倍和4 倍。 最終,麻葶舒喘湯低、中、高劑量分別0.19、0.38、0.76 g/mL[13]。
于實驗造模第14、21 天后對哮喘小鼠進行30 min 內(nèi)的行為學(xué)觀察。 參考吳云濤等[14]操作,將30 min 內(nèi)哮喘小鼠的噴嚏頻率、抓鼻次數(shù)及喘息情況等作為半定量評價的主要指標,并將每項指標分為4 個等級,以對哮喘小鼠的行為學(xué)進行客觀化、標準化評定。其中無噴嚏、抓鼻、喘息為0 分。1~4 次噴嚏、抓鼻為1 分;5~8 次噴嚏、抓鼻為2 分;8 次以上噴嚏、抓鼻為3 分。 輕度喘息(靜伏或躁動)為3 分,明顯喘息(中度呼吸困難)為6 分,嚴重喘息(重度呼吸困難或死亡)為9 分。
參考文獻[15]方法,稱取10 mg 酚紅,用5%碳酸氫鈉溶液定容至100 mL,配成100 μg/mL 的母液,依 次稀 釋為2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 μg/mL,在546 nm 下測定吸光度(absorbance, A)。以酚紅濃度作為橫坐標,A 為縱坐標,繪制酚紅標準曲線。 每組取6 只小鼠,末次給藥30 min 后,腹腔注射0.01 mL/g酚紅溶液。注射酚紅1 h 后,斷髓處死小鼠,剪開頸前皮膚,剪下甲狀軟骨下緣至氣管分叉處的一段氣管,往氣管內(nèi)注射5 %碳酸氫鈉溶液進行灌洗。 隨后放置于1.5 mL 灌洗液中,旋渦振蕩1 min,用酶標儀在波長546 nm 處測A,并根據(jù)制定的標準曲線計算出氣管沖洗液中酚紅濃度,以此表示酚紅排泌量。
末次給藥后24 h 斷髓處死小鼠,開胸取小鼠新鮮肺組織。用生理鹽水反復(fù)沖洗肺組織表面淤血,重復(fù)2 次。 將左肺裝入凍存管,于-80 ℃保存待Westen blot 及qPCR 實驗備用。 將右肺置于4%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋備用。
取制備好的小鼠右肺組織石蠟切片,常規(guī)HE染色后于400 倍顯微鏡下觀察氣道炎性細胞浸潤情況、肺泡/支氣管結(jié)構(gòu)、氣道上皮損傷等形病理形態(tài)改變。
取制備好的小鼠右肺組織石蠟切片,常規(guī)PSA染色后于100 倍顯微鏡下觀察。PAS 技術(shù)可將中性黏液染成深紅色或紅紫色[16],根據(jù)切片中紫紅色或深紅色判斷杯狀細胞增生情況。每張切片隨機采5個直徑約70 μm 完整氣道,測定杯狀細胞占所有上皮細胞的比例,并采用積分法進行半定量分析,杯狀細胞占上皮細胞的比例:<5%為0 分;5%~25%為1 分;25%~50%為2 分;50%~75%為3 分;≥75%為4 分。
使用RIPA 提取肺組織蛋白并用BCA 法對蛋白濃度進行測定。 經(jīng)SDS-PAGE 和轉(zhuǎn)膜后,用封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)封閉90 min,分別加入稀釋的一抗:MUC5AC(1∶200)、MARCKS(1∶2 000)及β-actin(1∶5 000),4 ℃過夜孵育。孵育后經(jīng)TBST洗滌,并用稀釋的HRP 標記的二抗室溫孵育90 min:山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)及山羊抗兔IgG(1∶6 000)。洗滌后用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶并用quantity one 專業(yè)灰度分析軟件分析各條帶的灰度值,取目的蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度值的比值進行統(tǒng)計學(xué)分析。
保持無酶清潔環(huán)境,稱取20 mg 肺組織于1.5 mL無RNA 酶離心管中并加入1 mL Trizol 提取總RNA。使用紫外分光光度計在260 nm 與280 nm 處測定RNA 濃度,表示RNA 樣本的純度值OD260/OD280在1.8~2.0 之間。 RNA 逆轉(zhuǎn)錄按照HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)要求操作。以Real-time PCR 檢測肺組織中MUC5AC 及MARCKS 的mRNA 表達。 反應(yīng)體系見表1。反應(yīng)條件:95 ℃10 min,95 ℃15 s,60 ℃60 s(采集熒光),共40 個循環(huán)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成。 序列見表2。
表1 PCR 反應(yīng)體系
造模第14 天,與空白組相比,模型組、地塞米松組、麻葶舒喘湯不同劑量組的哮喘小鼠行為學(xué)發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為噴嚏頻率增加,抓鼻次數(shù)增多,喘息癥狀明顯,少數(shù)小鼠伴有呼吸困難、毛發(fā)雜亂無光澤等癥狀,哮喘小鼠的評分均顯著高于空白組(P<0.01)。 藥物干預(yù)治療7 d后(即造模第21 天),地塞米松組和麻葶舒喘湯不同劑量組的哮喘小鼠評分較模型組均顯著下降(P<0.01),抓鼻次數(shù)及噴嚏次數(shù)減少,喘息癥狀明顯改善。 見表3。
與空白組比較,模型組的酚紅排泌量明顯降低(P<0.01)。模型組相比,加入地塞米松或麻葶舒喘湯進行干預(yù)治療后,酚紅排泌量均明顯增加(P<0.01)。見表4。
表2 RT-PCR 引物序列
表3 各組小鼠行為學(xué)評分比較(±s,n=10,分)
表3 各組小鼠行為學(xué)評分比較(±s,n=10,分)
注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01
組別空白組模型組地塞米松組麻葶舒喘湯低劑量組麻葶舒喘湯中劑量組麻葶舒喘湯高劑量組第14 天1.250±0.936 9.500±1.937##8.875±1.834##8.125±1.452##8.250±1.785##8.375±1.495##第21 天1.500±0.866 10.875±1.763##7.750±0.968##**8.875±1.166##**8.125±1.452##**8.000±1.414##**
表4 各組小鼠氣道酚紅排泌量(±s,n=6)
表4 各組小鼠氣道酚紅排泌量(±s,n=6)
注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01
組別空白組模型組地塞米松組麻葶舒喘湯低劑量組麻葶舒喘湯中劑量組麻葶舒喘湯高劑量組吸光度/A 0.460±0.005 0.387±0.010##0.985±0.006##**0.428±0.004##**0.482±0.003##**0.879±0.011##**酚紅濃度/(μg·mL-1)3.335±0.034 2.826±0.069##6.999±0.041##**3.106±0.028##**3.487±0.024##**6.258±0.074##**
空白組肺組織結(jié)構(gòu)正常,組織內(nèi)未見水腫部位,管腔內(nèi)光滑平整無黏液、無狹窄,管壁無炎性細胞浸潤。 模型組小鼠病變部位見明顯水腫,管腔狹窄,內(nèi)見黏液栓,管壁有大量炎性細胞浸潤,基底膜厚度明顯增加。地塞米松組的肺組織水腫明顯減輕,病變處只見少量炎細胞浸潤,管腔寬度較模型組明顯擴大且無明顯黏液栓形成,上皮結(jié)構(gòu)也較完整。麻葶舒喘湯低劑量組的肺組織病理改善程度較地塞米松、麻葶舒喘湯中劑量及麻葶舒喘湯高劑量組低,但相對模型組,其管腔狹窄、管壁炎性細胞浸潤等程度亦有所降低。麻葶舒喘湯中劑量組的管腔較地塞米松組和麻葶舒喘湯高劑量組縮小,壁內(nèi)見少許炎性細胞。麻葶舒喘湯高劑量組的肺組織結(jié)構(gòu)與地塞米松組類似,管腔擴大,壁內(nèi)無明顯炎性細胞浸潤。 見圖1。
空白組小鼠支氣管周圍僅有少量紫紅色表達。與空白組相比,模型組在支氣管周圍的紫紅色面積明顯增加(P<0.01)。給予地塞米松和中、高劑量的麻葶舒喘湯進行干預(yù)后,小鼠支氣管周圍的陽性面積呈現(xiàn)不同程度的減少(P<0.05)。 見表5、圖2。
與空白組相比,模型組的黏蛋白MUC5AC的mRNA 及蛋白表達水平明顯上升(P<0.01)。 加入地塞米松或麻葶舒喘湯進行干預(yù)治療后,MUC5AC mRNA 及蛋白水平均明顯降低(P<0.05 或P<0.01)。見表6、圖3。
圖1 各組小鼠肺組織HE 染色(×400)
圖2 各組小鼠肺組織PAS 染色(×100)
表5 各組小鼠支氣管黏膜杯狀細胞計數(shù)評分[M(P25,P75),n=10,分]
表6 各組小鼠肺組織中MUC5AC mRNA 及蛋白含量(±s,n=10)
表6 各組小鼠肺組織中MUC5AC mRNA 及蛋白含量(±s,n=10)
注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01
組別空白組模型組地塞米松組麻葶舒喘湯低劑量組麻葶舒喘湯中劑量組麻葶舒喘湯高劑量組MUC5AC mRNA 1.420±0.483 4.735±0.697##1.814±0.475**4.122±0.296##*3.963±0.608##*2.065±0.446**MUC5AC 0.098±0.038 0.504±0.037##0.112±0.044**0.332±0.048##**0.256±0.064##**0.143±0.0180**
與空白組相比,模型組的黏蛋白MARCKS 的mRNA 及蛋白表達水平明顯上升(P<0.01)。使用地塞米松或麻葶舒喘湯進行干預(yù)治療后,MARCKS mRNA及蛋白水平均明顯降低(P<0.05 或P<0.01)。見表7、圖3。
圖3 各組小鼠肺組織MUC5AC 及MARCKS 蛋白表達水平
表7 各組小鼠肺組織中MARCKS mRNA 及蛋白含量(±s,n=10)
表7 各組小鼠肺組織中MARCKS mRNA 及蛋白含量(±s,n=10)
注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01
組別空白組模型組地塞米松組麻葶舒喘湯低劑量組麻葶舒喘湯中劑量組麻葶舒喘湯高劑量組MARCKS mRNA 1.581±0.400 4.162±0.391##2.067±0.287**3.523±0.310##*3.052±1.289##**2.266±0.278**MARCKS 0.078±0.033 0.454±0.051##0.084±0.017**0.334±0.066##*0.238±0.066##**0.112±0.030**
哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病,黏液高分泌是其最主要的病理特征。 LOC 和Takashi 等[17-18]研究表明,杯狀細胞顯著增生,導(dǎo)致黏蛋白過度表達是黏液高分泌的首要原因。本次研究中,哮喘小鼠的杯狀細胞增生遠高于正常小鼠,而使用麻葶舒喘湯進行干預(yù)治療后,哮喘小鼠的噴嚏、喘息、抓耳撓腮等哮喘體征及杯狀細胞的增生情況得到了明顯的改善,小鼠氣道酚紅排泌量顯著增加,并且黏蛋白的分泌也有所降低,表明麻葶舒喘湯具有較好的止咳、祛痰作用。
MUC5AC 是最為常見的聚合黏蛋白,主要表達于氣管和支氣管上皮的杯狀細胞中,其表達水平與黏液分泌量呈正相關(guān)[19],而抑制黏蛋白的過度分泌可有效減輕哮喘患者的氣道黏液高分泌[20]。 MARCKS 是黏蛋白分泌的主要調(diào)節(jié)因子。 Li 等[21]研究表明,抑制MARCKS 蛋白可減弱這些細胞黏蛋白的高分泌。 本研究發(fā)現(xiàn),麻葶舒喘湯可有效降低哮喘小鼠的MUC5AC 和MARCKS 的mRNA 及蛋白表達水平。 因此,麻葶舒喘湯可能通過抑制MARCKS 蛋白的表達減弱細胞黏蛋白的高分泌,直接或間接地減少MUC5AC 蛋白的分泌,從而降低氣道阻力,緩解氣道阻塞、哮喘的癥狀。麻葶舒喘湯高劑量組抑制MUC5AC 和MARCKS 的表達,可使小鼠模型的相應(yīng)指標降低至空白組水平。
中醫(yī)學(xué)認為,氣道黏液高分泌歸屬于中醫(yī)“痰”的范疇[22]。 肺內(nèi)宿痰內(nèi)伏,外感侵襲,易導(dǎo)致痰結(jié)于氣道,肺的宣肅功能失調(diào),氣道攣急,發(fā)為哮喘。 風(fēng)痰搏結(jié)是哮喘發(fā)作的關(guān)鍵,祛風(fēng)化痰是哮喘發(fā)作期的治療原則。麻葶舒喘湯是柏正平教授立足于“風(fēng)盛痰阻,氣道攣急”的病機而創(chuàng)建的,由炙麻黃、地龍、蟬蛻、桑白皮、辛夷、法半夏、浙貝母、射干、白果、葶藶子、水蛭、紫蘇子、磁石、甘草組成。 方中炙麻黃可宣散肺部壅塞之氣;蟬蛻善除肺經(jīng)之風(fēng)邪;二者共用可開宣肺氣,加入白果收斂肺氣,防止宣散太過。地龍與蟬蛻能疏散風(fēng)邪,透邪外出,舒緩氣道[23],配以水蛭可加強搜風(fēng)通絡(luò),緩解氣道痙攣。哮喘病發(fā)作期多由外感受涼而致,配以辛夷發(fā)散肺經(jīng)風(fēng)寒之邪。哮喘病根為痰,加入法半夏與射干合消肺部之痰。紫蘇子、杏仁質(zhì)潤而主降,降利肺氣,與炙麻黃相配,宣降相宜,既制約炙麻黃宣散太過,又增強止咳平喘之功。浙貝母化痰止咳、降泄肺氣。磁石質(zhì)重沉降、納氣平喘。桑白皮瀉肺平喘,葶藶子泄肺之水飲及痰水而下氣定喘,二藥合用增強瀉肺平喘之功。甘草調(diào)和諸藥,亦能解除痙攣。整方宣降通用,化痰祛風(fēng),并在宣散外邪的同時注重補腎納氣。
綜上所述,麻葶舒喘湯可通過恢復(fù)MARCKS/MUC5AC 的平衡,抑制小鼠氣道黏液過度分泌,從而防治哮喘。 同時,麻葶舒喘湯可使哮喘小鼠的杯狀細胞、炎性細胞數(shù)量及組織水腫面積減少,改善氣道重塑。