沈雪鷹，蔣寶貴，何志海，孫 毅，傅國(guó)璋，姚明國(guó)，張 云，江佳富，杜春紅*

（1.云南省地方病防治所，云南 大理 671000；2.云南省騰沖市動(dòng)物疫病控制中心，云南 騰沖 679100；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，北京 100071；4.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000）

無(wú)形體是隸屬于立克次體目（Rickettsiales）無(wú)形體科（Anaplasmataceae）無(wú)形體屬（Anaplasmas）的一類(lèi)革蘭氏陰性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，不同種的無(wú)形體可分別侵襲人和動(dòng)物粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板，導(dǎo)致人和動(dòng)物無(wú)形體病。人類(lèi)和多種小型獸類(lèi)、野生動(dòng)物和家畜均可成為無(wú)形體的感染者和/或宿主，成為重要傳染源，并通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物蜱等叮咬，或破損皮膚黏膜接觸含病原體的體液、血液進(jìn)行傳播[1]。無(wú)形體屬種類(lèi)多，主要有嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體（A.phagocytophilum）、山羊無(wú)形體（A.capra）、綿羊無(wú)形體（A. ovis）、邊緣無(wú)形體（A. marginale）、中央無(wú)形體（A. centrale）、牛無(wú)形體（A. bovis）和血小板無(wú)形體（A. platys）等，主要感染牛、羊、犬和鹿等哺乳動(dòng)物，其中A. phagocytophilum、A. capra 和A. ovis 變異種可以感染人類(lèi)[2-7]。無(wú)形體感染后可出現(xiàn)不同癥狀，人類(lèi)主要以發(fā)熱伴白細(xì)胞、血小板減少和多器官功能損害為主，可伴有頭疼、肌痛等癥狀。動(dòng)物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸、大量流涎和體重減輕等，部分發(fā)生流產(chǎn)，重則發(fā)生死亡[8]。無(wú)形體疾病是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的人獸共患自然疫源性疾病。

騰沖市位于云南省西部邊陲，為古代“南方絲綢之路”的極邊重鎮(zhèn)，畜牧業(yè)產(chǎn)值達(dá)23.29 億元，占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的47.7%。作為云南省的重要邊境縣市，有148 公里國(guó)境線，有3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)與緬甸接壤。有國(guó)家級(jí)口岸猴橋口岸，省級(jí)口岸滇灘、自治口岸，還有16 條民間交往通道。中緬兩國(guó)自古民間貿(mào)易往來(lái)密切，民間交流頻繁。由于動(dòng)物疫病防控的需要，我國(guó)禁止與東南亞國(guó)家的偶蹄動(dòng)物貿(mào)易。目前沒(méi)有通過(guò)正規(guī)渠道入境的偶蹄動(dòng)物，但通過(guò)民間小道走私入境的情況偶有發(fā)生。另外由于騰沖與緬甸有較長(zhǎng)的國(guó)境線，中緬雙方邊民交叉放牧牛羊的情況也時(shí)有發(fā)生，放牧過(guò)程中也發(fā)生一些牲畜的交換、交易。目前，長(zhǎng)期在邊境游牧的牛羊約有12 群600 余頭（只）。邊民的牛羊混牧也給疫病和寄生蟲(chóng)交互感染提供了機(jī)會(huì)。云南省既往調(diào)查也顯示, 家畜、犬等家養(yǎng)動(dòng)物和小型獸類(lèi)中存在無(wú)形體感染。為了解本地區(qū)養(yǎng)殖家畜感染無(wú)形體的狀況，加強(qiáng)動(dòng)物疫病防治，本研究對(duì)本地區(qū)多個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)殖的牛、羊進(jìn)行無(wú)形體病調(diào)查，旨在為該地區(qū)牛羊養(yǎng)殖與流行病學(xué)防治提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 血液樣本及主要實(shí)驗(yàn)材料牛、羊血樣758 份，其中牛血樣331份，羊血樣427份，分別采集于云南省騰沖市曲石、滇灘、中和、猴橋、界頭、芒棒、騰越、明光、荷花、固?hào)|、蒲川等11個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，采樣區(qū)分布見(jiàn)圖1。采集方式為無(wú)菌采集動(dòng)物頸靜脈血。

圖1 調(diào)查樣本采集區(qū)分布圖Fig.1 Distribution of sampling area

血液基因組DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit，lot：03625）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa Bio 公司。

1.2 血液樣本中無(wú)形體16S rRNA 的PCR 擴(kuò)增利用血液基因組DNA 提取試劑盒提取血液樣品DNA。參照文獻(xiàn)[9-10]，采用半巢式PCR 擴(kuò)增無(wú)形體16S rRNA 基因，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段660 bp。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序鑒定。

1.3 16S rRNA 基因序列分析及無(wú)形體種類(lèi)的鑒定與統(tǒng)計(jì)利用CLC Genomics Workbench 3.6.1 將所得序列進(jìn)行序列拼接。利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中相關(guān)基因序列比對(duì)分析，進(jìn)行無(wú)形體種的確定。根據(jù)無(wú)形體種類(lèi)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，以種間序列相似性 99%，結(jié)合不同來(lái)源等生態(tài)學(xué)特征，判定為同一種無(wú)形體。利用MEGA6.06 軟件，鄰接法Neighbor-Joining、Kimura 2-parameter model、bootstrap 1000 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)獲得的陽(yáng)性樣本序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 騰沖市各鄉(xiāng)鎮(zhèn)牛、羊感染無(wú)形體的情況本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)11 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的家畜血樣758 份，檢出陽(yáng)性樣品255 份，總陽(yáng)性率為33.64%。其中羊血樣本427份，檢出陽(yáng)性114 份，陽(yáng)性率為26.69%；牛血樣本331 份，檢出陽(yáng)性141 份，陽(yáng)性率為42.60%；11 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，有8 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊血檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性率從高到低依次為蒲川鄉(xiāng)（76.19%）、界頭鎮(zhèn)（55.00%）、荷花鎮(zhèn)（53.33%）、猴橋鎮(zhèn)（21.05%）、滇灘鎮(zhèn)和明光鎮(zhèn)（20.00%）、曲石鎮(zhèn)（10.81%）、中和鎮(zhèn)（10.61%）；采樣的全部鄉(xiāng)鎮(zhèn)的牛血樣本均檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性率在10.00%～100.00%，部分樣本的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，騰沖市牛、羊中無(wú)形體的感染率較高，流行地區(qū)分布廣泛。羊血陽(yáng)性率>50%的有3 個(gè)鄉(xiāng)：蒲川鄉(xiāng)、界頭鎮(zhèn)和荷花鎮(zhèn)，牛血陽(yáng)性率最高的是猴橋（100%）和騰越鎮(zhèn)（95.74%），猴橋鎮(zhèn)某養(yǎng)殖戶的20頭牛血樣本，全部檢出陽(yáng)性，騰越鎮(zhèn)某養(yǎng)殖戶的47頭牛血樣本45 頭檢出陽(yáng)性。而這些鄉(xiāng)鎮(zhèn)大多為山區(qū)、半山區(qū)，感染率高可能與周邊森林植被覆蓋率高，氣候濕潤(rùn)，易孳生蜱蟲(chóng)、牛虻、廄蠅、蚊等吸血昆蟲(chóng)有關(guān)。

蜱蟲(chóng)因其復(fù)雜的生活史、較強(qiáng)的抗逆性、對(duì)病原體復(fù)雜的傳播模式和廣泛的宿主譜，使其成為許多自然疫源性疾病的傳播媒介和儲(chǔ)存宿主，是近年來(lái)比較受關(guān)注的媒介之一。其中立克次體病是一種重要的蜱傳疾病，也是影響畜牧業(yè)發(fā)展的一類(lèi)重要疾病。立克次體科無(wú)形體屬病原體主要宿主是野生哺乳動(dòng)物如野豬、鹿、刺猬、嚙齒動(dòng)物等，以及家養(yǎng)動(dòng)物如羊、牛、犬、馬等。而動(dòng)物宿主的持續(xù)感染是病原體維持自然循環(huán)的基本條件。云南省既往研究顯示，多地野生動(dòng)物和家畜中均存在無(wú)形體病的流行[11-14]。本研究結(jié)果提示，騰沖市為無(wú)形體病的潛在自然疫源地，而且具有病原體種類(lèi)復(fù)雜、分布廣泛的特點(diǎn)，這些病原體可通過(guò)蜱蟲(chóng)叮咬在動(dòng)物之間甚至是動(dòng)物與人之間傳播，對(duì)人群和家畜健康產(chǎn)生危害。因此，在發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)的同時(shí)，需加強(qiáng)無(wú)形體病的防治工作，倡導(dǎo)家畜圈養(yǎng)、注意動(dòng)物體表寄生蟲(chóng)的殺滅，從業(yè)者提高防范意識(shí)，進(jìn)入林區(qū)和飼養(yǎng)家畜時(shí)，避免被蜱蟲(chóng)等叮咬。獸醫(yī)要提高對(duì)無(wú)形體病的認(rèn)識(shí)，早期發(fā)現(xiàn)和治療病畜，加強(qiáng)流動(dòng)家畜的檢驗(yàn)檢疫，控制疾病的傳播。

圖2 部分樣本的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Partial results of PCR amplified

2.2 騰沖市牛、羊感染無(wú)形體的種類(lèi)根據(jù)所得16S rRNA 基因序列與GenBank 中登錄的該基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，本次調(diào)查共檢出7 種無(wú)形體，包括：A.centrale、A. ovis、A. platys、A. capra、A. margi?nale、A. phagocytophilum 和A. bovis。其中羊檢出除A. centrale 外 的6 種 無(wú) 形 體 共114 份，以A. ovis（占63.16%，72/114）和A. platys（占21.93%，25/114）為主。牛檢出除A. capra 外的6 種無(wú)形體共138 份，以A. marginale（占46.10% ， 65/141）和A. platys（占36.88%，52/141）為主。A. platys 是當(dāng)?shù)嘏?、羊均能感染且感染率較高的一種無(wú)形體，共檢出77 份陽(yáng)性，11 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均有分布；A. marginale 主要在9 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的牛血中檢出，羊血僅檢出1 份；A. ovis 主要感染羊，在8 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的72 頭羊血樣中檢出陽(yáng)性，主要集中在界頭鎮(zhèn)和蒲川鄉(xiāng)，牛檢出6 份陽(yáng)性。本研究還在牛和羊血中檢出A. phagocytophilum 19 份、羊血中檢出A. capra 1 份，這兩種無(wú)形體是目前已確認(rèn)對(duì)人有致病性的2 個(gè)種[8]。

以上結(jié)果表明，騰沖市牛和羊感染的無(wú)形體種類(lèi)極為豐富，幾乎涵蓋了目前所確定的全部無(wú)形體種類(lèi)。羊以感染A. ovis 和A. platys 為主，牛以感染A. marginale 和A. platys 為主，A. platys 是在當(dāng) 地 牛 和和羊中共同流行的一個(gè)種。雖然檢出的部分種類(lèi)如中央無(wú)形體是弱病原性蟲(chóng)種，但其可致體弱的個(gè)體、新生個(gè)體發(fā)??；A. ovis、A. bovis、A. platys 和A.marginale 等均可引起流行，影響家畜的繁殖和奶、肉產(chǎn)出，甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡。臨床上牛常發(fā)生持續(xù)隱性感染，甚至終生隱性感染而成為重要傳染源[15]。同時(shí)，本調(diào)查還在1 份羊血中檢出A. margi?nale，在6 份牛血中檢出A. ovis，部分樣本不能確定種類(lèi)，如TC-729?？赡芤虍?dāng)?shù)嘏?、羊攜帶的無(wú)形體病原體具有基因多樣性較高的特征，加之立克次體基因組高度保守，導(dǎo)致少部分樣本采用單一基因序列分析會(huì)影響其種屬分類(lèi)。后續(xù)還需對(duì)這些樣本，尤其是致病性較強(qiáng)的A.phagocytophilum，A. capra 等進(jìn)行多位點(diǎn)分析，如rrs、gltA、ompA、ompB 等，以提高種屬的可靠性并了解病原體的特征。

2.3 感染無(wú)形體的16S rRNA 基因序列分析將經(jīng)PCR 擴(kuò)增的16S rRNA 基因與GenBank 中登錄的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，檢出的7 種無(wú)形體與相應(yīng)無(wú)形體種類(lèi)的同源性在98%～100%。以立氏立克次體（Rickettsia rickettsii，DQ150682）為外類(lèi)群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，山羊、奶水牛、水牛和黃牛中檢出的A. platys 種間差異較小，進(jìn)化關(guān)系聚在一個(gè)分支，與非洲和東南亞檢出的序列親緣關(guān)系較近，部分樣本遺傳距離稍遠(yuǎn)（圖3）。在當(dāng)?shù)嘏：脱蛑袡z出的A. bovis、A.ovis、A. marginale、A. centrale，同種間序列同源性96.8%～100%，分別與國(guó)外、國(guó)內(nèi)多省市檢出的序列聚在一個(gè)分支。在牛和羊中檢出對(duì)人致病的A. phagocytophilum，與其它地區(qū)蜱、狗、綿羊分離的16S rRNA 序列同源性>99%，與從韓國(guó)人血分離到的菌株（MH482862.1）同源性為99.77%。表明騰沖檢出的A. phagocytophilum 對(duì)人致病的可能性較大。部分樣本同種間存在一定差異，如黃牛TC-729，同源性比較與A. phagocytophilum、A. platys 和在南非牛血中檢出的無(wú)形體同源性均為99.07%，但進(jìn)化分析卻獨(dú)處一個(gè)小分支，處于A.phagocytophilum 和A. bovis 之間，是否單獨(dú)為一個(gè)種類(lèi)或亞種，還需進(jìn)一步確認(rèn)。這些結(jié)果表明，騰沖市牛、羊感染的無(wú)形體，在不同牛羊個(gè)體來(lái)源的同種無(wú)形體，16S rRNA 基因序列存在堿基差異、遺傳距離不等的情況。

圖3 基于無(wú)形體16S rRNA 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis based on 16S rRNA genes of Anaplasmosis

16S rRNA 存在于所有原核生物中，其具有較高拷貝量和序列中含有高度保守區(qū)，是無(wú)形體基因分類(lèi)最常用的擴(kuò)增靶基因[16-18]。本次調(diào)查可能因當(dāng)?shù)嘏！⒀驍y帶的無(wú)形體病原體具有基因多樣性較高的特征，導(dǎo)致少部分樣本采用單一基因序列分析無(wú)法達(dá)到種屬分型的要求。因此，對(duì)于分類(lèi)不是太清晰的樣本，尤其是致病性較強(qiáng)的A. phagocytophilum、A. capra，非常有必要進(jìn)行多位點(diǎn)分型，以提高分型的可靠性，并進(jìn)一步了解病原體的特征，為牛、羊感染不同無(wú)形體病的研究，以及對(duì)人類(lèi)健康存在威脅的無(wú)形體種類(lèi)的更深入認(rèn)識(shí)提供參考依據(jù)。