高力揚，張 穎，陳方正，李小杰，馬金成，馬小明，趙琰龍，李 敏*

（1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起綿羊傳染性胸膜肺炎的主要致病菌，從1963 年首次發(fā)現(xiàn)該病原菌至今[1]，這種支原體在各大洲養(yǎng)殖羊及野生羊中均有檢出[2]，MO 對全球綿羊養(yǎng)殖業(yè)危害極大。大量文獻報道顯示：肺炎支原體能夠引起宿主呼吸道損傷并造成免疫缺陷，但與其他支原體相比，MO 的致病機理的研究非常有限[3]。有報道顯示在正常羊呼吸道中也能夠檢測出MO[4]，提示MO廣泛存在于飼養(yǎng)環(huán)境中。因此，養(yǎng)殖戶在處理支原體肺炎病羊時會直接接觸到MO，雖然目前未見MO 引起人的病例報道，但MO 對人體是否存在潛在影響尚不能確定，近年來關(guān)于致病菌跨種屬感染的病例報道越來越多，因此有必要研究MO 對人體是否存在潛在危害。肺泡上皮細胞與病原體直接接觸，一旦激活后會釋放細胞因子參與肺部炎癥反應(yīng)，而且肺泡上皮細胞的損傷是肺炎發(fā)展的關(guān)鍵步驟[5]。因此，本研究以MO 感染后的人肺泡II 型上皮細胞為細胞模型，為MO 感染對人呼吸系統(tǒng)可能存在的潛在影響進行評估。

1 材料與方法

1.1 細胞株及MO株肺泡II型上皮細胞系HPAEpiC購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；MO 標準株Y98 由寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室保存。

1.2 主要試劑lncRNA RP11-29G8.3-001 過表達病毒由漢恒生物合成并構(gòu)建；腺病毒表達載體pH?BAd-EF1-MCS-CMV-EGFP-Δloxp 購自漢恒生物科技（上海）有限公司；本實驗所用引物均由Sangon Biotech 公司合成。胎牛血清和DMEM 均購自美國Gibco 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑和Premix Ex TaqTMII 購自Ta?KaRa 公 司；TRIzol 裂 解 液、CellTiter-LumiTM發(fā) 光 法檢測試劑盒、CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒、DIO 細胞膜綠色熒光染色試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。lncRNA 芯片購自博奧晶典生物技術(shù)公司。

1.3 MO Y98 株感染細胞模型的建立選取MO 標準株Y98，采用改良Hayflick 支原體培養(yǎng)基（20%馬血清）[6]，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基由紅變黃，MO濃度為1×106ccu/mL。將生長狀態(tài)良好的人肺泡II型上皮細胞HPAEpiC以1×105個/mL接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，待細胞融合度達75%左右時，利用MO Y98 株感染細胞24 h，感染復(fù)數(shù)（MOI）為10。利用DIO 對MO 細胞膜進行熒光染色，然后利用免疫熒光技術(shù)鑒定人肺泡II 型上皮細胞的感染狀況。

1.4 細胞增殖及活力影響的檢測將人肺泡II型上皮細胞以1×104個/孔接種于96孔板，待細胞融合度達到80%時加入MO Y98 株感染24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h 后，測定其OD450nm值，確定MO Y98 感染對細胞增殖的影響；取出細胞培養(yǎng)板室溫平衡10 min，每孔加入100 μL Cell Titer-LumiTM發(fā)光法檢測試劑，室溫下振蕩2 min 后室溫孵育10 min，利用多功能酶標儀進行化學發(fā)光檢測，確定MO Y98 感染對HPAEpiC 細胞ATP 生成量的影響。

1.5 細胞形態(tài)變化檢測本實驗采取掃描電鏡檢測感染MO 后的人肺泡II 型上皮細胞形態(tài)變化。具體操作步驟為：檢測前按1.3 中的方法制作被MO 感染的細胞爬片，采用預(yù)冷的2.5%戊二醛/PBS 溶液過夜固定，利用50%、70%、85%、95%、100%乙醇溶液梯度脫水，然后用叔丁醇置換3次，每次10 min，最后冷凍干燥后經(jīng)掃描電鏡觀察感染后人肺泡II 型上皮細胞形態(tài)變化情況。

1.6 MO 感染人肺泡II 型上皮細胞后相關(guān)基因表達及轉(zhuǎn)錄水平的檢測利用TRIzol 裂解后提取無感染組及MO 感染組細胞總RNA，委托博奧晶典生物技術(shù)公司利用lncRNA 芯片對細胞mRNA 長鏈非編碼RNA（lncRNA）進行篩查檢測。利用RT-qPCR 方法對芯片篩選到的基因進行初步驗證，篩選出表達顯著上調(diào)的基因。并利用qPCR 對炎癥因子相關(guān)基因IL-1β、TNF-α、IFN、IRF7 的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測（引物序列見表1）。

1.7 lncRNA RP11-29G8.3-001 過表達對MO 感染人肺泡II 型上皮細胞的影響分析進一步選擇與MO感染相關(guān)且表達上調(diào)的基因lncRNA RP11-29G8.3-001開展基因過表達及免疫相關(guān)基因的檢測。具體方法為：合成lncRNA RP11-29G8.3-001 的cDNA 序列（En?sembl GRCh37.p13 獲得），插入腺病毒表達載體pH?BAd-EF1-MCS-CMV-EGFP-Δloxp 中，重組病毒的構(gòu)建及純化由漢恒生物科技（上海）有限公司完成；將含有l(wèi)ncRNA RP11-29G8.3-001 表達質(zhì)粒的腺病毒加入細胞融合度達到70%的人肺泡II 型上皮細胞，病毒最佳MOI 為100。置于細胞培養(yǎng)箱中孵育6 h～8 h 后，利用熒光顯微鏡觀察細胞中GFP 的表達情況，然后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞至90%以上融合后，收集細胞用于后續(xù)試驗。qPCR 檢測lncRNA RP11-29G8.3-001的轉(zhuǎn)錄水平，及l(fā)ncRNA RP11-29G8.3-001過表達后細胞中免疫相關(guān)基因HLA-B、HLA-F、HLA-C、IF16、IF127、IF135、IFITM1、IFITM3、OAS1、OAS3的轉(zhuǎn)錄水平（表1）。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers for RT-qPCR

1.8 生物信息學分析及統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 7 軟件進行分析，采用T 檢驗，p<0.05 有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MO 感染人肺泡II 型上皮細胞模型的建立為了證實MO 感染人肺泡II 型上皮細胞模型的建立，本研究采用熒光法檢驗MO 在細胞中的分布情況。激光共聚焦顯示，DIO 熒光染色的MO 在感染人肺泡II 型上皮細胞12 h 內(nèi)會進入細胞質(zhì)基質(zhì)中，并圍繞細胞核分布（圖1）。這一現(xiàn)象表明建立的MO 感染模型可用于后續(xù)試驗。

2.2 MO 對人肺泡II 型上皮細胞細胞增殖及活力的影響為了研究MO 在體外對人肺泡II 型上皮細胞增殖及細胞活力的影響，本實驗采用CCK-8 及CellTiter-LumiTM發(fā)光法對細胞增殖和細胞活力進行檢測，結(jié)果顯示MO 感染的細胞與對照兩種細胞的數(shù)量及ATP 產(chǎn)生量無顯著影響（圖2），結(jié)果提示MO感染對人肺泡II 型上皮細胞沒有顯著毒性，且不會降低該細胞的活性。

圖2 MO 對人肺泡II 型上皮細胞增殖及活性的影響Fig.2 The effect of Mycoplasma ovipneumoniae on cellproliferation activity of human alveolar type II epithelial cells

2.3 MO對細胞形態(tài)的影響為了觀察MO 感染人肺泡II 型上皮細胞后的形態(tài)變化，本實驗采用掃描電鏡進行觀察，結(jié)果顯示：人肺泡II 型上皮細胞在感染MO 后會伸出很多偽足（圖3），推測MO 刺激細胞后伸出的偽足可能是MO 進入細胞質(zhì)基質(zhì)的原因。

圖3 MO 對肺泡上皮細胞形態(tài)的影響Fig.3 The morphology of infected human alveolar epithelial cells

2.4 MO 感染人肺泡II 型上皮細胞中相關(guān)基因表達及轉(zhuǎn)錄水平的檢測為了進一步檢測MO 感染后的細胞基因表達的變化，利用基因芯片對細胞中mRNA 及l(fā)ncRNA 進行篩查，并采用熒光定量PCR 進行驗證。 RT-qPCR 結(jié)果顯示MO 感染會引起人肺泡II 型上皮細胞中SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1 及l(fā)n?cRNA RP11-29G8.3-001 轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào)（p<0.05，圖4A），但是MO 感染不會上調(diào)人肺泡II 型上皮細胞中炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平，如IL-1β、TNF-α、IFN、IRF7（圖4C）。結(jié)果表明MO 感染雖然會上調(diào)人肺泡II 型上皮細胞內(nèi)極少數(shù)蛋白編碼基因的表達（SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1），但這些基因均與細胞炎癥反應(yīng)、細胞凋亡無關(guān)；且MO 感染不會直接誘導(dǎo)肺泡上皮細胞炎癥因子的表達。

2.5 lncRNA RP11-29G8.3-001 過表達對MO 感染人肺泡II 型上皮細胞的影響分析MO 感染會引起lncRNA RP11-29G8.3-001 轉(zhuǎn)錄水平升高（p<0.05，圖4B），但lncRNA RP11-29G8.3-001 的作用目前未見報道。為了進一步探索lncRNA RP11-29G8.3-001在人肺泡II 型上皮細胞中的作用，本實驗利用攜帶lncRNA RP11-29G8.3-001 表達質(zhì)粒的腺病毒感染HPAEpic 細胞。qPCR 檢測結(jié)果顯示lncRNA RP11-29G8.3-001 表達上調(diào)超過6 倍以上（圖5），本研究將肺泡II 型上皮細胞分為兩組，lncRNA RP11-29G8.3-001 基因過表達和MO 感染組。人RP11-29G8.3-001過表達會引起HLA-B、HLA-F、HLA-C 的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（圖6Ai），且抗感染相關(guān)基因IFITM1、IF?ITM3、OAS1、OAS3 等轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低（圖6Aii）。然而體外MO 感染（MOI 10）感染僅能上調(diào)ln?cRNA RP11-29G8.3-001 表達1.5 倍，不足以引起上述免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化（圖6B）。實驗結(jié)果表明，雖然lncRNA RP11-29G8.3-001 過表達可引起人肺泡II 型上皮細胞的免疫抑制，但本實驗中MO 感染（MOI 10）引起的少量lncRNA RP11-29G8.3-001 表達并沒有造成免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的下降，推測相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平可能與lncRNA RP11-29G8.3-001 的表達水平有關(guān)。

3 討 論

以往研究顯示，肺炎支原體可以通過對宿主細胞的黏附、膜融合、營養(yǎng)剝奪、侵入、毒力因子等作用直接損傷宿主細胞[7]。但本實驗通過CCK-8 及細胞ATP 水平檢測等手段，發(fā)現(xiàn)MO 感染人肺泡II型上皮細胞48 h 后，感染組及對照組細胞數(shù)量及細胞活性并無明顯改變，推測MO 感染可能不會引起人肺泡II 型上皮細胞增殖能力降低甚至死亡。利用DIO 熒光染色的MO 感染人肺泡II 型上皮細胞，發(fā)現(xiàn)MO 可以進入細胞質(zhì)基質(zhì)中，而且掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)MO 感染會促進人肺泡II 型上皮細胞伸出偽足，推測MO 可能利用胞飲進入細胞。而支原體和細胞膜成分相似，這可能也是MO 進入細胞的一個途徑。

圖4 MO 感染對人肺泡II 型上皮細胞中基因表達的影響Fig.4 The effect of Mycoplasma ovipneumoniae on gene expression of human alveolar type IIepithelial cells

圖5 lncRNA RP11-29G8.3-001 在人肺泡II 型上皮細胞中的表達量變化Fig.5 Expression of lncRNA RP11-29G8.3-001 in human alveolar type II epithelial cells

有研究顯示雞毒支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白會上調(diào)雞氣管上皮細胞中IL-1β 的表達，而肺炎支原體感染可上調(diào)人肺泡II 型上皮細胞中IL-1、TNF 的表達[8]，并且ROS 可通過上調(diào)TNF-α 增加對腸上皮細胞的損傷[9]。有研究發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒基質(zhì)蛋白1、2 可以誘導(dǎo)小鼠氣管上皮細胞產(chǎn)生IFN-γ，提示IFN-γ 與氣管上皮細胞免疫有關(guān)[10]。而IRF7 則參與支氣管上皮細胞抗病毒免疫、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達[11]。上述病原體感染均可引起炎癥因子上調(diào)。上述炎癥因子均與上皮細胞免疫有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)MO 可以進入細胞，但細胞中IL-1β，TNF-α，IFN，IRF7 等炎癥因子的表達并無明顯變化，MO 感染不會引起人肺泡II型上皮細胞炎癥因子表達變化。

為了進一步研究MO 對人肺泡II 型上皮細胞的潛在影響，本研究采用基因芯片進行差異基因篩選，共檢出3 個mRNA 及5 個lncRNA 在MO 感染的細胞中表達上調(diào)，qPCR 驗證后證實SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1 及l(fā)ncRNA RP11-29G8.3-001 表達顯著上升。但利用OMIM 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，除上皮鈉通道γ 亞基外（由SCNN1G 基因編碼），LOX 和ST6GALNAC1 均與呼吸系統(tǒng)疾病無相關(guān)性。而上皮鈉通道γ 亞基表達升高對肺水轉(zhuǎn)運有促進作用，可以減少肺水腫的發(fā)生[12]。

反義lncRNA RP11-29G8.3 基因存在于第13 號染色體上（Ensembl GRCh37.p13 版本），目前功能尚不清楚。人肺泡II 型上皮細胞中l(wèi)ncRNA RP11-29G8.3-001 在MO 感染后表達顯著升高，提示其在感染中可能存在一定作用，因此本實驗采用基因過表達的方法驗證其功能。結(jié)果顯示lncRNA RP11-29G8.3-001 可以顯著下調(diào)HLA-B、HLA-F、HLA-C等基因的表達，并且顯著抑制抗感染因子OAS1、OAS3 等基因表達。人HLA-B、HLA-C 基因編碼主要組織相容性復(fù)合物I 類（MHC-I），HIV 可以通過抑制MHC-I 的表達而逃避免疫清除。而IFI6 可以通過線粒體依賴途徑抑制登革2 型病毒感染血管內(nèi)皮細胞凋亡[13]，提示IFI6 在抗病毒、抗凋亡中發(fā)揮作用。IFITM1、IFITM3 可以通過抑制病毒包膜與宿主細胞膜的融合，從而抑制丙型肝炎病毒進入細胞[14]。OAS1 和OAS3 作為人類巨噬細胞中趨化因子和干擾素應(yīng)答基因表達的負調(diào)節(jié)劑，是抗病毒反應(yīng)系統(tǒng)的介質(zhì)[15]。這些抗感染相關(guān)基因表達下調(diào)與ln?cRNA RP11-29G8.3-001 負相關(guān)，提示lncRNA RP11-29G8.3-001 可能參與細胞免疫抑制。然而與基因過表達相比，體外大劑量MO 感染（MOI 10）并不能大幅上調(diào)人肺泡II 型上皮細胞中l(wèi)ncRNA RP11-29G8.3-001 的表達量，而低水平的lncRNA RP11-29G8.3-001不會對細胞產(chǎn)生顯著的免疫抑制作用，因此MO 通過大幅上調(diào)lncRNA RP11-29G8.3-001 造成人肺泡II型上皮細胞免疫抑制的可能性極小。

圖6 人肺泡II 型上皮細胞中免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測Fig.6 Expression of immune-related genes inhuman alveolar type II epithelial cells

綜上所述，MO 是造成綿羊傳染性胸膜肺炎的主要病原菌，可以通過飛沫等途徑傳染，對綿羊養(yǎng)殖業(yè)危害極大，但這種支原體是否會對人體產(chǎn)生潛在影響，尚無理論依據(jù)。本研究通過建立MO 感染肺泡上皮細胞模型，從細胞活性及基因表達等方面評估了MO 對人體的潛在危險，研究發(fā)現(xiàn)MO 對人肺泡上皮細胞的影響有限，造成損害的可能性較小。