張敏敏，孫亞杰，劉文興，劉任強(qiáng)，王喜軍，步志高*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

牛結(jié)節(jié)性皮膚病（Lumpy skin disease，LSD）是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（Lumpy skin disease virus，LS?DV）引起牛的一種重要疫病，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、皮膚水腫及局部堅(jiān)硬的結(jié)節(jié)或潰瘍?yōu)橹饕卣?。LSD可導(dǎo)致乳牛產(chǎn)奶量減少、公牛暫時(shí)或永久不育、皮張利用價(jià)值大大降低。發(fā)病率在2%～45%之間，致死率高達(dá)20%[1]，奶牛更為易感。節(jié)肢動(dòng)物的機(jī)械性間接傳播被認(rèn)為是LSDV 傳播的主要途徑[1]。該病在跨境動(dòng)物疫病中具有高影響力，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須通報(bào)的疫病之一[2]。

LSDV 屬于痘病毒科，與綿羊痘病毒和山羊痘病毒共同組成羊痘病毒屬。LSDV 是雙鏈DNA 病毒，全基因組約由156 個(gè)假定基因組成[3]。LSDV 和其它痘病毒一樣，病毒基因組由中間核心區(qū)域以及兩端的反向重復(fù)序列組成，且羊痘病毒屬各成員之間基因組序列高度同源。血清學(xué)上很難將屬內(nèi)的各病毒成員加以區(qū)分，但通過感染動(dòng)物的種屬特性可以初步判斷，同時(shí)必須結(jié)合多種診斷方法才能最終確定。羊睪丸（LT）細(xì)胞、牛肌肉細(xì)胞、MDBK 細(xì)胞及OA3.Ts 細(xì)胞對(duì)LSDV 較敏感[4-5]，可用于該病毒的分離。

本研究利用采自新疆伊犁地區(qū)臨床疑似LSD 癥狀的牛病變皮膚樣本接種LT 細(xì)胞，對(duì)產(chǎn)生細(xì)胞病變的培養(yǎng)物經(jīng)透射電鏡觀察、間接免疫熒光檢測(cè)、PCR 檢測(cè)、基因序列分析，結(jié)果表明分離到引起我國首次LSD 疫情病毒株。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料病變皮膚組織（病料）無菌采集自新疆伊犁地區(qū)發(fā)病牛。LT 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)制備凍存。細(xì)胞培養(yǎng)基為含10% FBS 和2%雙抗的MEM（Hyclone，美國）。羊痘病毒陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。用于病毒分離的LT 細(xì)胞培養(yǎng)基含青鏈霉素濃度為10%（V/V）。病毒DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTAR?Max DNA Poly?merase 購自TaKaRa 公司；驢抗羊IgG-FITC 二抗購自SIGMA 公司。本研究涉及的活病毒相關(guān)操作均在哈爾濱獸醫(yī)研究所高等級(jí)生物安全I(xiàn)II 級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 病毒分離與滴定將無菌采集的病牛病變皮膚組織樣品研磨后用含10%雙抗的PBS重懸，5 000 r/min離心10 min，取上清接種LT 細(xì)胞，37 ℃，5% CO2孵育1 h，棄上清，用PBS 洗3 遍，補(bǔ)加10% FBS 的MEM，繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)90%細(xì)胞病變（CPE）時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，將其反復(fù)凍融3 次，5 000 r/min 離心10 min，收取上清病毒液按10-1～10-7連續(xù)梯度稀釋后，以每孔加100 μL 的量加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。接種后連續(xù)觀察6 d，根據(jù)典型痘病毒細(xì)胞病變，按Reed-Muench 法計(jì)算病毒半數(shù)感染量（TCID50）。

1.3 分離病毒的鑒定

1.3.1 病毒粒子的形態(tài)學(xué)觀察 將上述上清病毒樣品進(jìn)行濃縮，按常規(guī)的負(fù)染方法固定染色、制備樣片，利用透射電子顯微鏡（日立H-7650）觀察病毒粒子形態(tài)。

1.3.2 分離病毒株的間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA） 將1.2 中收集的病毒液100 倍稀釋后，接種長滿24 孔板的單層LT 細(xì)胞，培養(yǎng)72 h 后用4%多聚甲醛固定20 min，以山羊痘病毒陽性血清（1:100）為一抗，驢抗山羊FITC-IgG（1:200）為二抗，進(jìn)行IFA 檢測(cè)。

1.3.3 分離病毒的PCR 檢測(cè)與測(cè)序 根據(jù)LSDV TK基因兩翼序列（AF409137.1），采用Oligo6.0 軟件設(shè)計(jì)引 物: Forward primer（55844-55865）5'-TTGATGAAT ATAGCAACAAGCC-3'/Reverse primer（58275-58299）5'-AATGATCTCTTAAGTATTTAATATG-3'。引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。采用DNA 提取試劑盒提取1.2 中收集的病毒液總DNA，利用上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 10 μL；Forward primer 和Reverse primer 各1 μL（10 pmol）；模板2 μL；dH2O 6 μL，共20 μL。PCR 條件為：98 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃10 min，30 個(gè)循環(huán)。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步判斷為陽性后，由吉林庫美生物科技有限公司測(cè)序后進(jìn)行分析。

1.3.4 分離病毒的全基因測(cè)序與系統(tǒng)進(jìn)化分析 將提取的總DNA 基因組由北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行二代測(cè)序（De novo），以Neethling LW 病毒株（AF409137.1）作為參考序列。測(cè)序完成后，用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（MEGA 7.0）軟件，與數(shù)據(jù)庫中已知的所有病毒株（LSDV）全基因組進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3.5 分離病毒株的一步法生長曲線測(cè)定 將分離病毒以感染復(fù)數(shù)（MOI）0.1 接種長滿6 孔板的單層LT細(xì)胞，每天收取細(xì)胞上清和等體積的的相應(yīng)細(xì)胞裂解物，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，測(cè)定TCID50，確定分離病毒生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒分離及電鏡觀察結(jié)果將研磨病料勻漿后的離心上清接種LT 細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，用倒置顯微鏡逐日觀察，第6 d 觀察到細(xì)胞明顯地皺縮、變圓，即出現(xiàn)CPE。待CPE 達(dá)到90%時(shí)收取細(xì)胞，測(cè)定第一代病毒滴度，結(jié)果顯示可達(dá)到106.5TCID50/mL。有報(bào)道描述LSDV 對(duì)LT 細(xì)胞、牛肌肉細(xì)胞、MDBK細(xì)胞或者OA3.Ts 細(xì)胞比較敏感，可以用于LSDV 分離[4-5]。但不同LSDV 株對(duì)細(xì)胞的敏感度不同，有些LSDV 株在分離時(shí)需要盲傳幾代才能出現(xiàn)CPE，有些接種后幾天到十幾天才能觀察到CPE。本研究中的病毒株在接種LT 細(xì)胞第一代就觀察到了CPE。通過負(fù)染電鏡觀察，可見典型的磚型的痘病毒樣粒子，直徑為200 多納米。LSDV 的大小一般在290 nm×240 nm[6]，本研究中觀察到的病毒粒子大小基本與之相符（圖1）。由于痘病毒在復(fù)制過程中會(huì)產(chǎn)生胞內(nèi)成熟粒子（IV）和胞外病毒粒子（EV）[6]，所以要想觀察到各種形態(tài)的病毒粒子需要樣品中有大量病毒粒子，另外羊痘病毒在形態(tài)學(xué)上很難與正痘病毒區(qū)分，需采用其它方法進(jìn)一步鑒定分離的病毒。

圖1 分離病毒株的透射電鏡觀察Fig.1 Electronmicroscopy visualization of negatively stained LSDV

2.2 分離病毒株的IFA 結(jié)果由于LSD 于2019 年首次傳入我國[7]，尚未有針對(duì)該病原的陽性血清，而羊痘病毒屬中的各病毒成員之間同源性很高，血清學(xué)有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)[8]，所以本研究選擇其它羊痘病毒的血清作為檢測(cè)血清。將感染分離病毒72 h 后的LT 細(xì)胞經(jīng)IFA 檢測(cè)，結(jié)果顯示，病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)亮綠色熒光，而空白細(xì)胞無熒光（圖2），表明該病毒株可能為LSDV。

圖2 IFA 結(jié)果Fig.2 Result of indirect immunofluorescence assay

2.3 分離病毒株P(guān)CR 檢測(cè)結(jié)果提取病毒液DNA，以LSDV 的TK 基因兩翼序列為模板設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小位于2 000 bp～3 000 bp，與預(yù)期LSDV 基因組相應(yīng)序列片段大小一致（圖略）。PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，該P(yáng)CR 擴(kuò)增片段與NCBI 中LSDV 相應(yīng)片段的相似性為99.98%，進(jìn)一步確定該分離株為LSDV，命名為LS?DV/China/Xinjiang/2019。本研究以LSDV 的TK 基因兩翼序列為模板，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，由于GTPV，SPPV 與LSDV 基因序列同源性很高，所以必須要結(jié)合測(cè)序結(jié)果來判斷。

2.4 分離病毒株基因組序列分析將分離病毒株基因組DNA 進(jìn)行全基因組二代測(cè)序，所得序列與NC?BI 中所有LSDV 的基因組序列進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（MEGA 7.0），結(jié)果顯示該分離株與LSDV/Russia/Saratov/2017 序列相似性最高（99.42%）（圖3）。LSDV/Russia/Saratov/2017 首次由俄羅斯分離，本次分離的病毒株與俄羅斯分離株一樣，均能引起病牛發(fā)熱和全身性結(jié)節(jié)等典型的臨床癥狀[9-10]。

2.5 一步法生長曲線分離病毒株接種LT 細(xì)胞后，取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的LT 細(xì)胞以及細(xì)胞上清樣品進(jìn)行病毒效價(jià)滴定，結(jié)果顯示該分離病毒株在96 h 病毒效價(jià)達(dá)到最高，為106.8TCID50/mL。接種后4 d～5 d 為病毒滴度的平臺(tái)期（圖4）。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的山羊痘病毒復(fù)制速度較慢的特點(diǎn)相符[11]。

本研究通過對(duì)疑似LSD 病牛的皮膚組織樣品進(jìn)行病毒分離，對(duì)分離物進(jìn)行電鏡形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光學(xué)檢測(cè)、PCR 檢測(cè)與基因組測(cè)序、病毒培養(yǎng)特性等系統(tǒng)分析結(jié)果表明，首次成功在我國分離到1株LSDV，命名為LSDV/China/Xinjiang/2019。同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，本研究分離株與俄羅斯發(fā)現(xiàn)的LSDV/Russia/Saratov/2017 株高度同源，后者能夠引起典型皮膚結(jié)節(jié)等臨床癥狀，分離樣品采集地點(diǎn)距離哈薩克斯坦邊境僅60 km[10,12]，這些信息可為疫情溯源提供了重要線索。結(jié)合流行病學(xué)情況[7]，我國新疆伊犁疫情最大可能為鄰國傳入，但以何種傳播方式途徑，有待進(jìn)一步分析研究。LS?DV/China/Xinjiang/2019 的分離為我國LSD 防控研究和技術(shù)研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果Fig.3 Phylogenetic tree analysis of LSDV nucleotide sequences

圖4 一步法生長曲線Fig.4 One-step growth curveof the isolatedvirus