鄭 姚，李 娟，王 利*，陳希文

（1.西南民族大學(xué)青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部和四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.綿陽師范學(xué)院動物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，四川 綿陽 621000）

β 防御素是抗菌肽家族（Antimicrobial peptides，AMPs）重要成員，廣泛存在于動植物體內(nèi)，現(xiàn)已在人、鼠、豬、雞、藍(lán)狐和牛中發(fā)現(xiàn)β 防御素存在[1-5]。β 防御素是構(gòu)成機(jī)體天然免疫的重要組成部分，被認(rèn)為是防御細(xì)菌和真菌等侵入病原體的第一道防線，多存在于消化道與呼吸道[6]。在牛的舌頭、氣管、腸組織中分別發(fā)現(xiàn)了舌抗菌肽（Lingual antimi?crobial peptide，LAP）、氣管抗菌肽（Tracheal antimi?crobial peptide，TAP）、腸溶性β 防御素（EBD）和β防御素4（BD4）。TAP 是β 防御素家族的第一個特征明確的成員，純化后對多種細(xì)菌均具有抑菌活性[7]。Mossallam 等在水牛的氣管組織中克隆鑒定出β 防御素10 和11[8]。從水牛乳汁中分離出的牛中性粒細(xì)胞β 防御素2（BNBD2）也顯示出對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的顯著抗菌活性[9]。牛中性粒細(xì)胞β防御素4（Bos grunniens neutrophilbeta-defensin 4，BN?BD4）屬于β 防御素類，目前國內(nèi)外僅對牦牛BNBD5基因的克隆與原核表達(dá)研究外，尚未見牦牛其他β防御素的報道。牦牛是世界上典型的長期生存于高原地區(qū)的物種之一，對多種疾病有較強(qiáng)的抵抗力[10]。牦牛不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，并且具有極大的科研價值。本實(shí)驗(yàn)克隆獲得牦牛BNBD4 基因序列，檢測其在牦牛不同組織中的轉(zhuǎn)錄情況，同時原核表達(dá)了BNBD4 蛋白，初步探究該蛋白的抑菌作用。本研究為深入探究BNBD4 在牦牛免疫系統(tǒng)中的防御機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織無菌采集自四川阿壩州紅原3 歲齡3 頭健康麥洼牦牛，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。DL2000 DNA Marker、1.1×T3 Super PCR Mix 和E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit 和TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ均購自寶生物工程（大連）有限公司；抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體和His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞和ECL 發(fā)光試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 牦牛BNBD4 基因的PCR 擴(kuò)增參考GenBank中黃牛BNBD4 基因序列（NM_174775.1），利用Prim?er Premier 5.0 軟件設(shè)計引物P1（P1-F：TCTTCTC?CAGCATCAGCC/P1- R： CTGGTTACGCCTCAGTCT）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用RNAiso Plus 試劑處理并提取牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟5 種組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以肺組織cDNA 作為模板，采用P1 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃2 min；98 ℃2 min、 55.6 ℃10 s、72 ℃15 s，共35 個 循 環(huán)；72 ℃2 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

1.3 牦牛BNBD4 基因生物信息學(xué)分析采用NCBI的ORF Finder 程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffind?er/）分析擴(kuò)增的BNBD4基因序列，并預(yù)測其氨基酸序列。采用Megalign 軟件進(jìn)行序列同源性分析及進(jìn)化分析。利用DNAMAN 軟件分析BNBD4 氨基酸序列。采用ExPASy 子程序分析BNBD4 蛋白基本理化性質(zhì)、親疏水性、二硫鍵的位置。采用SignalP4.0、TMHMM、SOPMA、SMART SWISS MODEL 預(yù)測蛋白信號肽剪切位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)。

1.4BNBD4 基因在牦牛不同組織中的轉(zhuǎn)錄情況

根據(jù)1.2 克隆獲得的牦牛BNBD4 基因序列設(shè)計熒光定量PCR 引物P2（P2-F：CTTCCTGGTCCTGTCTGC/P2-R：AGGTGCCAATCTGTCTCAT），以β-actin 為內(nèi)參基因，參考文獻(xiàn)[11]合成牦牛β-actin 基因引物（P3- F： CTTCGAGCAGGAGATGGC/P3- R： CCGT?GTTGGCGTAGAGGT）。采用TB Green 熒光定量PCR法檢測BNBD4 基因在麥洼牦牛心臟、肝、脾、肺和腎5 種組織中的轉(zhuǎn)錄情況。反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)程序：95 ℃3 min；95 ℃10 s、53.4 ℃20 s、72 ℃30 s，39 個循環(huán)；65 ℃5 s、95 ℃3 min。每個樣品均重復(fù)3 次。以肝臟擴(kuò)增的Ct 值作為不同組織間差異定量分析的參照，采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果，通過PSS24.0單因素方差分析其顯著性，p<0.05 表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

1.5 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)將PCR 擴(kuò)增得到的BNBD4 目的片段克隆至pET-32a 載體的KpnⅠ/EcoRⅠ位置，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-BNBD4。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和MluⅠ酶切鑒定后，陽性質(zhì)粒并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。將鑒定的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6 時加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)12 h，收集表達(dá)產(chǎn)物。分離上清與菌體沉淀，菌體沉淀用5 mL PBS 懸浮并破碎，收集上清與沉淀，用SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步以抗His 標(biāo)簽鼠單克隆抗體（1:4 000）為一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP（1:10 000）作為二抗，進(jìn)行western blot 鑒定。設(shè)轉(zhuǎn)化空載體pET-32a 的重組菌作為陰性對照。

1.6 重組蛋白的毒性試驗(yàn)將重組菌pET32a-BN?BD4/BL21（DE3）培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6 時以終濃度0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)6 h，以LB 液體培養(yǎng)基調(diào)整其初始濃度為5×108cfu/mL，按10倍倍比稀釋獲得5個濃度（5×104cfu/mL～5×108cfu/mL），每個濃度取5 μL涂布于LB 平板（含100 μg/ml Amp、0.5 mmol/L IPTG），37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察各組菌落數(shù)，分析BNBD4 對E. coli BL21（DE3）的毒性作用。以轉(zhuǎn)化空載體pET-32a 的重組菌作為陰性對照。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛BNBD4 基因的PCR 擴(kuò)增牦牛各組織樣品總RNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測均有28S、18S、5S 3 個條帶（圖略），OD260nm/OD280nm均為1.9～2.0，表明所提取RNA 可用。以牦牛肺各組織cDNA為模板，利用引物P1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增基因結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到約250 bp的BNBD4基因目的條帶（圖1）。測序后采用NCBI 比對結(jié)果顯示其與黃牛相應(yīng)基因同源性達(dá)97.44%。表明正確擴(kuò)增了牦牛BNBD4基因。

圖1 牦牛BNBD4 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of BNBD4 gene of Bos

2.2BNBD4 基因序列分析利用ORF Finder 程序?qū)NBD4 基因序列分析結(jié)果顯示，BNBD4 基因開放閱讀框?yàn)?95 bp，可編碼64個氨基酸。采用MEAG5.0和Megalign 軟件將牦牛BNBD4 基因與其他物種的該基因序列分析后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果顯示牦牛BNBD4與黃牛相似性達(dá)96.4%，與其聚為一板，與水牛相似性為87.7%。表明BNBD4 基因ORF 區(qū)高度保守，與黃牛親緣關(guān)系最近，其次是與水牛。

將預(yù)測的BNBD4 基因編碼的氨基酸序列利用Megalign 軟件與NCBI 數(shù)據(jù)庫中登錄的黃牛、人、獼猴、犬等11 種物種的BNBD4 氨基酸比對結(jié)果顯示，氨基酸序列在特定位置均含有6 個保守半胱氨酸殘基；氨基酸序列同源性最高的是黃牛為82.7%，其次是水牛為64.2%，與大西洋鮭同源性最低為19.8%。表明BNBD4 在同屬中具有高度的保守性。

圖2 牦牛BNBD4 基因的進(jìn)化樹Fig.2 Nucleotide phylogenetic tree of BNBD4 gene

2.3 牦牛BNBD4 蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測采用在線工具ProtParam 預(yù)測牦牛BNBD4 的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示其前體蛋白的分子量為7.3 ku，分子式為C325H521N99O75S9，理論等電點(diǎn)為11.17。含16 種基本氨基酸，其中含量最高的是Leu（14.1%）；帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為8，不含帶負(fù)電荷的氨基酸殘基；280 nm 的摩爾消光系數(shù)為11 375 mol/cm；該分子的平均親水系數(shù)為0.463。表明BNBD4是陽離子型β防御素。利用ExPASy在線服務(wù)網(wǎng)站的Protscale工具對BNBD4 前體蛋白的親疏水性進(jìn)行預(yù)測分析結(jié)果顯示，該蛋白aa10 具有最強(qiáng)的疏水性（最大值為3.511），aa30 表現(xiàn)出最弱的疏水性（最小值為-2.256），表明該蛋白在其N 末端信號肽形成較強(qiáng)的疏水區(qū)。

采用在線分析軟件SignalP4.1 對BNBD4 蛋白的氨基酸序列的信號肽剪切位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白的N 端至第22～23 位氨基酸之間的剪切位點(diǎn)分值和綜合剪切分值均達(dá)到最大峰值，表明該蛋白有信號肽結(jié)構(gòu)可能為分泌蛋白。通過在線預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)軟件TMHMM Server v.2.0 分析BNBD4 編碼的蛋白，結(jié)果顯示BNBD4 氨基酸序列中存在1 個跨膜螺旋區(qū)域，分別位于aa7～aa25 之間，表明BNBD4在合成后通過信號肽的引導(dǎo)分泌到細(xì)胞外。利用在線軟件SOPMA 對BNBD4 蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析結(jié)果顯示，在BNBD4 二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占46.8 %，β-折疊占31.25%，α-螺旋占21.9%。利用Predict-Protein 服務(wù)器分析結(jié)果顯示，6 個保守的半胱氨酸殘基分別以Cys1-Cys3、Cys2-Cys4、Cys5-Cys6 連接，形成3 個分子內(nèi)二硫鍵。采用SWISSMODEL 在線分析工具對BNBD4 進(jìn)行同源建模，BN?BD4 結(jié)構(gòu)域主要為無規(guī)則卷曲和β 折疊、α 螺旋結(jié)構(gòu)，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。進(jìn)一步證明了所克隆BNBD4 屬于β-防御素亞家族。

2.4 牦牛不同組織BNBD4 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測利用熒光定量PCR 檢測各組織中BNBD4 基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，BNBD4 在麥洼牦牛心臟、脾臟、肌肉、肝臟、肺臟均有不同程度的轉(zhuǎn)錄，在腎臟中轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于心、肝、脾、肺組織（p<0.01），肝臟次之，在心臟、肺臟、脾臟組織轉(zhuǎn)錄水平較低（圖3）。表明BNBD4基因轉(zhuǎn)錄情況具有組織特異性。

圖3 BNBD4 基因在麥洼牦牛不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 The levels of BNBD4 mRNA transcription in differenttissues of the Bos

2.5 原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定將目的基因BNBD4 與pET-32a 載體連接，獲得重組質(zhì)粒pET32a-BNBD4，經(jīng)EcoRⅠ和MluⅠ酶切鑒定結(jié)果顯示，產(chǎn)生4 500 bp 和1 500 bp 的目的條帶（圖4）。測序分析結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中正確插入BNBD4 序列。表明重組質(zhì)粒pET32a-BNBD4 構(gòu)建正確。

圖4 重組質(zhì)粒pET32a-BNBD4 酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pET32a-BNBD4 by enzyme digestion

2.6 牦牛BNBN4 的表達(dá)與western blot 鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)12 h 后收集表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，出現(xiàn)大小約為23 ku 的重組蛋白，而陰性對照在相應(yīng)位置未見明顯條帶（圖5A）。目的蛋白存在于破碎后的沉淀中，表明該蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。Western blot 鑒定結(jié)果顯示明顯的特異性蛋白印跡帶（圖5B）。表明正確表達(dá)了BNBD4 重組蛋白。

圖5 重組蛋白BNBD4 的原核表達(dá)與鑒定Fig.5 Prokaryotic expression and identification of recombinant protein BNBD4

2.7 重組蛋白BNBD4的毒性試驗(yàn)重組蛋白BNBD4對大腸桿菌的毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，5×107cfu/mL、5×106cfu/mL、5×105cfu/mL、5×104cfu/mL 濃度的重組菌菌落均明顯少于對照組（圖6），表明重組蛋白BNBD4 對大腸桿菌BL21（DE3）具有明顯的抑制作用。

圖6 重組蛋白BNBD4 對大腸桿菌的抑制作用Fig.6 Antibacterial effect of recombinant protein BNBD4 on E. coli

3 討 論

牦牛BNBD4 基因編碼區(qū)全長195 bp，可編碼64個氨基酸，N 末端的23 個氨基酸是信號肽序列，含有明顯的疏水區(qū)，更加容易與膜結(jié)合，有利于信號肽引導(dǎo)蛋白的運(yùn)輸[12]。絕大數(shù)β 防御素是陽離子型，BNBD4 成熟肽的陽離子易于與病原體帶負(fù)電的磷脂膜結(jié)合，從而破壞細(xì)胞膜的完整性，與BNBD4的抑菌或殺菌功能相適應(yīng)[13]。BNBD4 與其他牛源防御素類的二級結(jié)構(gòu)組成基本一致，其中無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)所占比例最高，有利于β 防御素的穩(wěn)定性[14]。成熟的β 防御素蛋白多由38～42 個氨基酸組成，含有6個保守的半胱氨酸殘基，形成3 個分子內(nèi)二硫鍵[15]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。本實(shí)驗(yàn)對牦牛BNBD4基因序列分析得知，牦牛BNBD4 與黃牛、水牛的相似性較高，與豬、人、鼠的相對較低，但同屬中其保守性較高。動物種間β 防御素同源性差異較大，達(dá)爾文進(jìn)化論中提到物種之間感染的病原不同，從而導(dǎo)致一些基因發(fā)生有益于自身的顯著突變來抵御外界病原體，進(jìn)而導(dǎo)致物種間同源性差異較大，β防御素動物種間同源性差異大符合該理論。

作為機(jī)體免疫第一防線的β 防御素廣泛存在于動物體內(nèi)。β 防御素4（BD4）在鮭魚的粘膜組織、肌肉和性腺中分布較多，在其它組織中處于中等水平[16]。BNBD4 在黃牛的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、乳腺細(xì)胞以及周圍血單核細(xì)胞中表達(dá)量相對較高，在肝臟、睪丸、子宮中表達(dá)量很低，在小腸中幾乎未發(fā)現(xiàn)[17]。在水牛子宮內(nèi)膜中未發(fā)現(xiàn)BNBD4 轉(zhuǎn)錄本[18]。但脂多糖LPS 可顯著刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞BN?BD4 轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，提示β 防御素可能起到改善子宮內(nèi)膜炎的作用[19]。楊宇琴等通過免疫組化法在健康牛的腸、支氣管、肺泡和脾紅髓等發(fā)現(xiàn)BN?BD4 的分布，其在腸中表達(dá)量最高，在肺中相對較低，且與健康肺組織相比，病變肺組織中的BNBD4表達(dá)量升高，推測BNBD4 在機(jī)體中可能發(fā)揮免疫作用[20]。BNBD4 在荷斯坦奶牛乳腺中同樣有一定量的表達(dá)[21]。Brodowska 等發(fā)現(xiàn)BNBD4 基因中的兩個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與牛奶生產(chǎn)和乳房健康等生產(chǎn)性能有關(guān)，推測其對于抵抗乳房炎癥有重要作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)牦牛BNBD4 mRNA 在脾臟、肺臟、肝臟和腎臟等實(shí)質(zhì)性器官均有分布，BNBD4 在脾臟和肺臟內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平也相對較高，從而推測BNBD4 在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著一定的作用。

β 防御素家族在哺乳動物的先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，在過去的研究中已表明β 防御素4 的體外表達(dá)產(chǎn)物也對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑制或殺傷作用[2,5,23]。純化的重組人β 防御素4（HBD4）對銅綠假單胞菌有較強(qiáng)的殺菌活性，其效能高于哌拉西林和環(huán)丙沙星，具有燒傷創(chuàng)面感染治療的應(yīng)用前景[24]。重組mBNBD4 蛋白與無毒力的恥塘分枝桿菌和有毒力的牛分枝桿菌共培養(yǎng)后，通過致使牛分枝桿菌細(xì)胞壁發(fā)生破裂而死亡，且在高濃度該蛋白長時間作用情況下幾乎可殺死全部的細(xì)菌，推測可能與防御素陽離子與細(xì)菌壁陰離子的相互作用有關(guān)[25]。通過基因工程方法表達(dá)的奶牛β 防御素4 具有抑菌作用，且對革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌的抑菌效果要好[5]。本研究中毒性試驗(yàn)結(jié)果也顯示牦牛重組蛋白BNBD4 對大腸桿菌的生長具有抑制作用。這些都將為β 防御素4 在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，一方面可作為添加劑加到動物飼料中增強(qiáng)動物免疫力，尤其是對牦牛養(yǎng)殖起到指導(dǎo)作用。另一方面可作為治療性抗菌藥物開發(fā)的良好靶標(biāo)。

綜上所述，本研究首次獲得并分析了牦牛BN?BD4 基因ORF 序列及其組織分布，并表達(dá)了重組牦牛BNBD4 蛋白，鑒定了其對大腸桿菌BL21（DE3）具有一定抑制作用，為進(jìn)一步探究牦牛BNBD4 基因的功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。