王 巖，劉 聰，那 雷，王雪峰，林躍智，王曉鈞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/馬傳染病和慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

NLRP3 炎癥小體是一種由NLRP3 蛋白（NOD-，LRR- and pyrin domain- containing protein 3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（Apoptosis-associated speck-like pro?tein，ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶pro-caspase-1 組成的大分子多蛋白復(fù)合物，可識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式和宿主來源的危險(xiǎn)信號(hào)，如細(xì)菌的穿孔素、肽聚糖、病毒的dsRNA、DNA、脂蛋白、ATP 和尿酸等[1-3]。當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，NL?RP3 與接頭蛋白ASC 結(jié)合，招募并切割pro-caspase-1 形 成 具 有 活 性 的caspase-1（p20 和p10 兩 個(gè) 亞 單位）。活化的p20 進(jìn)一步切割pro-IL-1β 和pro-IL-18產(chǎn)生成熟的IL-1β（p17）和IL-18，分泌到細(xì)胞外引起炎癥反應(yīng)[4-5]（圖1）。

圖1 NLRP3 炎癥小體的結(jié)構(gòu)及組裝Fig.1 The structure and formation of NLRP3 inflammasome

NLRP3 炎癥小體在參與炎癥及天然免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。目前已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)NLRP3 炎癥小體在病毒復(fù)制調(diào)控及疾病進(jìn)程中起重要作用，特異性NLRP3 體外重建系統(tǒng)是開展炎癥調(diào)控機(jī)制研究的前提[6-8]。目前已有鼠源和豬源NLRP3 炎癥小體體外篩選系統(tǒng)的相關(guān)報(bào)道[7,9]，然而由于該系統(tǒng)中的組成分子具有較為嚴(yán)格的種屬特異性，無法開展馬源NLRP3 炎癥小體的研究。因此，建立馬屬動(dòng)物NL?RP3 炎癥小體的激活系統(tǒng)是研究馬屬動(dòng)物炎癥調(diào)控反應(yīng)的關(guān)鍵。本研究擬參考鼠源NLRP3 炎癥小體激活系統(tǒng)的構(gòu)成，并引入Gaussia 螢光素酶（Gaussia lu?ciferase，Gluc）作為激活指示信號(hào)[9]，通過將GLuc 前端的分泌信號(hào)肽去掉后連接到pro-IL-1β 的羧基端，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，與炎癥小體組分中相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒（ASC、NLRP3 和caspase-1）依次共轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞；通過檢測(cè)細(xì)胞上清中的熒光信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)p17 蛋白的表達(dá)，確定不導(dǎo)致pro-IL-1β 切割的NLRP3 復(fù)合體中相應(yīng)組分的最適劑量，從而建立特異性馬源NLRP3 炎癥小體激活系統(tǒng)，并且實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)IL-1β 的切割活性和細(xì)胞上清中成熟IL-1β 的平行檢測(cè)，為馬屬動(dòng)物NLRP3 炎癥小體的調(diào)控研究提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料pcDNA3.1-HA、pCAGGS 質(zhì)粒和人胚胎腎細(xì)胞HEK 293T 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；E. coil DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；pMCS-Gaussia Luc 質(zhì)粒購自Thermo Fisher Scientific 公司；馬組織（EIAV 感染馬的脾臟）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑TRIzolTM試劑、限制性核酸內(nèi)切酶購自Thermo Fisher Scientific 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司；KOD 高保真酶購自TOYOBO 公司；同源重組酶Seamless Assembly Cloning 購自Clone Smarter 公司；膠回收試劑盒、DNA 小提試劑盒購自O(shè)mega 公司；DNA 轉(zhuǎn)染試劑PolyJetTM購自SignaGen Laboratories 公司；5×passive lysis buffer 購自Promega公司；鼠源抗Flag 標(biāo)簽抗體、鼠源抗HA 標(biāo)簽抗體、紅外熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-Dylight 800）、GLuc 底物Coelenterazine（native）購自Sigma 公司；Ni?gericin 購自APExBIO 公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank 中eqIL-1β 基因序列（D42147.1）、eqCaspase-1 基因序列（NM_001081842）、eqASC 基因序 列（XM_001500509.4）、eqNLRP3 基因序列（XM_005598741.3）），設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。采用TRIzol 試劑提取馬組織的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以cDNA 為模板，利用引物IL-1β-F1/IL-1β-R1，擴(kuò)增eqIL-1β 目的基因。以此PCR 產(chǎn)物為模板，利用引物IL-1β-F2/IL-1β-R2 擴(kuò)增eqIL-1βflag 基因，經(jīng)Not I 和Xho I 雙酶切后克隆到pCAGGS 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-eq?IL-1β-flag。以真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-eqIL-1β-flag為模板，利用引物pCAGGS-IL-1β-F/pCAGGS-IL-1β-R 擴(kuò)增線性pCAGGS-eqIL-1β-flag載體；以pMCSGaussia Luc 質(zhì)粒為模板，利用特異性引物GLuc-F/GLuc-R，擴(kuò)增線性目的基因Gluc（Gaussia Luc），利用同源重組方法將目的基因Gluc 克隆到pCAGGS-eqIL-1β-flag 載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag。以pCAGGS 載體為模板，利用引物casppCAGGS-F/casp-pCAGGS-R 擴(kuò) 增 線 性pCAGGS 載體；以上述馬組織的cDNA 為模板，利用引物Casp-1-F/Casp-1-R 擴(kuò)增線性目的基因eqCaspase-1。利用同源重組方法將目的基因eqCaspase-1克隆到pCAGGS載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAGGS-eqCaspase-1-HA。以上述馬組織的cDNA為模板，利用引物ASC-F/ASC-R 擴(kuò)增eqASC 目的基因，經(jīng)Hind III 和Not I 雙酶切后克隆到pcDNA3.1-HA 載體中，構(gòu)建pcDNA3.1-eqASC-HA 質(zhì)粒。以上述馬組織的cDNA為模板，利用引物NLRP3-F/NLRP3-R 擴(kuò)增eqNLRP3 目的基因，通過Hind III和Not I 雙酶切后克隆于pcDNA3.1-HA 載體中，構(gòu)建pcDNA3.1-eqNLRP3-HA質(zhì)粒。

表1 用于相關(guān)重組質(zhì)粒構(gòu)建所需引物Table 1 Primers used for the construction of recombinant plasmids

1.4 Western blot 檢測(cè)各蛋白在HEK 293T 細(xì)胞中的表達(dá)將HEK 293T 細(xì)胞以每孔4×105個(gè)細(xì)胞均勻鋪于12孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)利用PolyJet轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染500 ng pCAGGS-eqIL-1β-flag、500 ng pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、500 ng pCAGGS-eqcas?pase-1-HA、500 ng pcDNA3.1-eqASC-HA、500 ng pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 質(zhì)粒。37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液，加入裂解液裂解細(xì)胞，離心去除細(xì)胞碎片并收集細(xì)胞裂解液上清，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳后，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白樣轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂乳封閉2 h，分別用鼠源抗Flag 抗體（1:5 000）和鼠源抗HA 抗體（1:5 000）作為一抗，用紅外熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:10 000）作為二抗，利用激光掃描成像系統(tǒng)Odyssey 掃描，檢測(cè)各目的蛋白的表達(dá)。

1.5 激活系統(tǒng)的構(gòu)建參照1.4 中轉(zhuǎn)染方法將250 ng pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 質(zhì)粒分別與不同劑量（0、1.56 ng、3.12 ng、6.25 ng、12.5 ng、25 ng、50 ng和100 ng）的pCAGGS-eqCaspase-1-HA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，20 h 后收集25 μL 上清與GLuc 底物Coelenterazine（native）混合后利用微孔板化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，同時(shí)裂解細(xì)胞，按1.4 中west?ern blot 方法檢測(cè)細(xì)胞中切割的IL-1β 蛋白，確定上清中熒光強(qiáng)度較低且不能導(dǎo)致細(xì)胞中IL-1β 蛋白切割的pCAGGS-eqCaspase-1-HA 質(zhì)粒的最適轉(zhuǎn)染劑量；在此基礎(chǔ)上，再將250 ng pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGS-eqCaspase-1-HA（確定的最適劑量）質(zhì)粒與不同劑量的pcDNA3.1-eqASC-HA（0、1.56 ng、3.12 ng、6.25 ng、12.5 ng、25 ng、50 ng 和100 ng）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，按上述檢測(cè)方法確定不能導(dǎo)致IL-1β 蛋白切割的pcDNA3.1-eqA?SC-HA 質(zhì)粒的最適轉(zhuǎn)染；按上述轉(zhuǎn)染方法再將250 ng pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、最 適 劑 量 的pCAGGS-eqCaspase-1-HA 質(zhì)粒、最適劑量的pcDNA 3.1-eqASC-HA 質(zhì)粒不同劑量（0、1.56 ng、3.12 ng、6.25 ng、12.5 ng、25 ng、50 ng 和100 ng）的pcD?NA3.1-eqNLRP3-HA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，按上述檢測(cè)方法確定不能導(dǎo)致IL-1β 蛋白切割的pcD?NA3.1-eqNLRP3-HA 質(zhì)粒的最適轉(zhuǎn)染劑量。

1.6 激活系統(tǒng)有效性的檢測(cè)根據(jù)1.5 中確定的pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGS-eqCaspase-1-HA、pcDNA3.1-eqASC-HA、pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 質(zhì)粒的最適轉(zhuǎn)染劑量進(jìn)行HEK 293T細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，于收樣前2 h 分別加入不同劑量（0、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L 和32 μmol/L）的NL?RP3炎癥小體激活劑Nigericin，按照1.5中檢測(cè)方法進(jìn)行細(xì)胞上清的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞中切割的IL-1β 蛋白檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定分別利用Not I/Xho I、Hind III/Not I、Nhe I/Kpn I對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAGGSeqIL-1β-flag、pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGSeqCaspase-1-HA、pcDNA3.1-eqASC-HA和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 進(jìn)行雙酶切鑒定，分別獲得了864 bp、1 365 bp、1 215 bp、585 bp、3 093 bp 大小的目的條帶，經(jīng)測(cè)序鑒定后確定大小和序列均與預(yù)期結(jié)果相符（圖2），表明各質(zhì)粒均正確構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Digestion analysis of the recombinant plasmids

2.2 重組蛋白表達(dá)的鑒定將重組質(zhì)粒pCAGGS-eq?IL-1β-flag、pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGSeqCaspase- 1- HA、 pcDNA3.1- eqASC- HA 和pcD?NA3.1-eqNLRP3-HA 分 別轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，west?ern blot 檢測(cè)目的蛋白大小均符合預(yù)期（圖3）。表明各重組蛋白均可在HEK 293T 細(xì)胞中正確表達(dá)。

圖3 重組蛋白表達(dá)的western blot 鑒定Fig.3 Western blot analysis for recombinant proteins expressed in HEK293T cells

2.3 NLRP3 體外激活系統(tǒng)構(gòu)建為確定NLRP3 炎癥小體激活系統(tǒng)中各質(zhì)粒的最適轉(zhuǎn)染劑量，分別對(duì)NLRP3 炎癥小體復(fù)合物中pCAGGS-eqCaspase-1-HA、pcDNA3.1-eqASC-HA 和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 質(zhì)粒進(jìn)行劑量依賴性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，隨著pCAGGS-eqCaspase-1-HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量的增加，細(xì)胞中切割的IL-1β 蛋白水平逐漸升高，且細(xì)胞上清中熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)pCAGGS-eqCaspase-1-HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量為3.12 ng 時(shí)，western blot 幾乎檢測(cè)不到切割的IL-1β，同時(shí)，細(xì)胞上清中熒光信號(hào)也較弱，因此可以確定NLRP3 激活系統(tǒng)中的pCAGGSeqCaspase-1-HA 質(zhì)粒發(fā)揮切割I(lǐng)L-1β 作用的臨界轉(zhuǎn)染劑量為3.12 ng（圖4A）。將250 ng pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 質(zhì)粒、3.12 ng pCAGGS-eqCaspase-1-HA 質(zhì)粒與不同劑量的pcDNA3.1-eqASC-HA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，當(dāng)pCAGGS-eqASC-1-HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量為3.12 ng 時(shí)，western blot 檢測(cè)不到切割的IL-1β，同時(shí)，細(xì)胞上清中熒光信號(hào)也較弱，確定NLRP3 激活系統(tǒng)中的pCAGGS-eqASC-1-HA 質(zhì)粒發(fā)揮切割I(lǐng)L-1β 作用的臨界轉(zhuǎn)染劑量為3.12 ng（圖4B）。再將250 ng pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 質(zhì) 粒、3.12 ng pCAGGS-eqCaspase-1-HA 質(zhì)粒、3.12 ng pCAGGSeqASC-HA 質(zhì)粒與不同劑量的pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，當(dāng)pCAGGS-eqASC-1-HA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量為3.12 ng 時(shí)，western blot 檢測(cè)不到切割的IL-1β，同時(shí)，細(xì)胞上清中熒光信號(hào)也較弱，確定NLRP3 激活系統(tǒng)中的pCAGGS-eqNLRP3-1-HA 質(zhì)粒發(fā)揮切割I(lǐng)L-1β 作用的臨界轉(zhuǎn)染劑量為6.25 ng（圖4C）。結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的馬源NLRP3炎癥小體激活系統(tǒng)中各個(gè)組分的工作劑量分別為pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 250 ng、pCAGGS-eqCas?pase-1-HA 3.12 ng、pcDNA3.1-eqASC-HA 3.12 ng 和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 6.25 ng。

2.4 NLRP3 體外激活系統(tǒng)有效性的檢測(cè)在確定的NLRP3 炎癥小體激活系統(tǒng)中各質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量條件下，加入NLRP3 炎癥小體激活劑Nigericin[10]，以檢測(cè)所建立系統(tǒng)的有效性。結(jié)果顯示，隨著Nigeri?cin 劑量的增加，細(xì)胞中切割的IL-1β 蛋白水平逐漸升高，且細(xì)胞上清中熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)（圖5）。表明該系統(tǒng)對(duì)NLRP3 的激活因素可以產(chǎn)生有效應(yīng)答，可用于后續(xù)能激活或抑制馬NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白或藥物的篩選研究。

圖4 NLRP3 炎癥小體體外激活系統(tǒng)構(gòu)建Fig.4 Construction of NLRP3 inflammation activation system in vitro

圖5 馬NLRP3 炎癥小體體外激活系統(tǒng)有效性檢測(cè)Fig.5 Verification of equine NLRP3 inflammasome activation system in vitro

3 討 論

NLRP3 炎癥小體在病毒復(fù)制調(diào)控及疾病進(jìn)程中起重要作用，對(duì)NLRP3 炎癥小體的激活機(jī)制及其在疾病進(jìn)展中的調(diào)控作用是目前的熱點(diǎn)研究。而建立靈敏特異的評(píng)估方法是該研究得以開展的重要前提。目前已建立了多種檢測(cè)及評(píng)估方法，如采用激光共聚焦顯微鏡的方法判斷NLRP3 和ASC 斑點(diǎn)樣聚集情況；Western blot 檢測(cè)NLRP3 和ASC 多聚復(fù)合物的形成；采用ELISA 方法檢測(cè)細(xì)胞上清中炎癥因子水平（IL-1β 和IL-18）等，對(duì)NLRP3 炎癥小體是否激活綜合評(píng)價(jià)[8,10-11]。這些方法中最為經(jīng)典，最為直接的就是NLRP3 的體外激活系統(tǒng)?，F(xiàn)已有關(guān)于豬源和鼠源NLRP3 炎癥小體檢測(cè)系統(tǒng)的報(bào)道并取得了一定進(jìn)展。但是該系統(tǒng)盡管可通過western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pro-IL-1β 的切割，但是對(duì)分泌到細(xì)胞上清中成熟的IL-1β 則需要ELISA 的輔助檢測(cè)，但有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)這種方法對(duì)抗體的親和力和特異性要求較高且敏感性較低，可能存在無法檢測(cè)的情況。

本研究在上述研究的基礎(chǔ)上，引入了GLuc，建立了高敏感性的NLRP3 炎癥激活系統(tǒng)。GLuc 是橈足類海洋動(dòng)物Gaussia princeps 分泌的一種發(fā)光物質(zhì)，是目前已知的最小的可自然分泌的熒光素酶，其靈敏度比螢火蟲熒光素酶FLuc（Firefly luciferase）和海蜃熒光素酶RLuc（Renilla luciferase）高出約10 000倍，已被廣泛用于蛋白互作與定位檢測(cè)、啟動(dòng)子活性監(jiān)測(cè)及腫瘤發(fā)生和藥物治療評(píng)價(jià)等研究領(lǐng)域[9,12]。GLuc 報(bào)告基因的使用，不僅可以提高檢測(cè)的敏感性，重要的是實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)IL-1β 的切割活性和細(xì)胞上清中成熟IL-1β 的平行檢測(cè)，使評(píng)價(jià)更為準(zhǔn)確、便捷，方法更加方便。另外，如果利用本研究中的GLuc-IL-1β 質(zhì)粒構(gòu)建成細(xì)胞系，也可為NLRP3炎癥小體體內(nèi)激活的檢測(cè)提供可靠手段，并進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)NLRP3 炎癥小體調(diào)控機(jī)制的研究。

本研究中構(gòu)建的激活系統(tǒng)雖然是基于NLRP3 炎癥小體，但對(duì)于NAIP-NLRC4 和AIM2 這幾類炎癥小體，由于激活機(jī)制較為相似，因此將NLRP3 替換成NAIP-NLRC4 或AIM2，也可以構(gòu)建其他幾種類型炎癥小體的體外篩選系統(tǒng)[2-3,13]。由此可見，本研究不僅建立了高效特異性的馬源NLRP3 炎癥小體的體外篩選系統(tǒng)，同時(shí)也為其它炎癥小體的構(gòu)建提供重要參考依據(jù)。本研究中構(gòu)建的炎癥小體激活系統(tǒng)將為馬屬動(dòng)物炎癥性疾?。ㄈ珩R傳染性貧血病毒、馬流感病毒、馬皰疹病毒和馬病毒性動(dòng)脈炎、馬鼻疽和馬腺疫引起的相關(guān)疾病）的研究提供良好的檢測(cè)平臺(tái)，促進(jìn)NLRP3 炎癥小體活化及調(diào)控機(jī)制的認(rèn)知，同時(shí)也為馬屬動(dòng)物炎癥相關(guān)性疾病提供新的治療靶點(diǎn)。