冀亞路，雷連成，馮 新，孫長(zhǎng)江，韓文瑜,2*，顧敬敏*

（1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的兼性致病菌，能夠引起人和動(dòng)物多種疾病，包括皮膚膿腫、敗血癥、以及心內(nèi)膜炎、肺炎、乳腺炎和腦膜炎[1]，該菌也是引起奶牛乳腺炎的主要病原體之一[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，抗生素治療（如天然或合成青霉素）是治療乳腺炎的主要策略，但抗生素的殘留物對(duì)人類健康造成極大危害。因此，迫切需要尋找新的有效對(duì)抗乳腺炎病原體的抗菌藥物。

噬菌體是能夠感染和殺死細(xì)菌的病毒，它能夠特異性感染細(xì)菌，附著于宿主并通過(guò)內(nèi)部復(fù)制和裂解細(xì)菌將其殺死[3]。與抗生素不同，噬菌體不會(huì)破壞宿主的正常微生物菌群，從而防止了細(xì)菌的生態(tài)失調(diào)，否則可能導(dǎo)致繼發(fā)感染，因此利用噬菌體抑制細(xì)菌生長(zhǎng)可能是抗生素的天然、無(wú)毒和有效的替代品[4]。有研究表明噬菌體顯示出對(duì)S. aureus 感染的局部和全身的殺菌活性，并且大大減輕由S. aureus 引起的炎癥[5]。此外，有研究表明S. aureus噬菌體K 對(duì)治療由S. aureus 引起的奶牛乳腺炎具有顯著功效[6]。依靠良好的生物學(xué)特性噬菌體有望成為控制S. aureus 感染的有效抗菌劑。

本研究利用牛源S. aureus SA.1545 從污水中分離得到一株烈性噬菌體，命名為VB-SavM-JYL02。該噬菌體表現(xiàn)出高效的裂解活性和寬宿主譜，基因組內(nèi)未發(fā)現(xiàn)與細(xì)菌毒力、抗生素抗性以及與溶原性相關(guān)的基因，這些特征均有利于該噬菌體被用作S. aureus 感染的治療或預(yù)防的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)所有菌株見表1[菌株名稱右上標(biāo)“1”表示菌株分離于吉林大學(xué)第一醫(yī)院（長(zhǎng)春，中國(guó)）；右上標(biāo)“2”表示菌株來(lái)自美國(guó)典型菌種保藏庫(kù)；右上標(biāo)“3”表示菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；右上標(biāo)“4”表示實(shí)驗(yàn)室保存菌株]。噬菌體宿主菌S. aureus SA.1545 分離于奶牛乳汁。胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自青島海博公司；0.22 μm 孔徑的Millipore 過(guò)濾器購(gòu)自Millipore 公司（美國(guó)）；病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自Doraville 公司（美國(guó)）。

1.2 噬菌體的分離與純化收集污水樣本，并通過(guò)棉絨過(guò)濾。用過(guò)濾后的污水配置100 mL TSB 液體培養(yǎng)基，加入1 mL S. aureus SA.1545（OD600nm1），置于37 ℃搖床（165 r/min）過(guò)夜培養(yǎng)后通過(guò)空斑法[7]檢測(cè)噬菌體，利用雙層瓊脂平板法對(duì)出現(xiàn)空斑的培養(yǎng)液進(jìn)行噬菌體的純化[8]，命名為噬菌體VB-SavMJVL02。將純化好的噬菌體擴(kuò)增與甘油按照3:1 的比例混勻后放-80°C 保存。

1.3 噬菌體VB-SavM-JYL02的一般生物學(xué)特性測(cè)定

1.3.1 噬菌體VB-SavM-JYL02 電鏡觀察 將純化后的噬菌體利用800 mL TSB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行大量擴(kuò)增后，4 ℃8 000 r/min 離心10 min 除去細(xì)菌和細(xì)菌碎片，收集上清液。將DNase I 和RNase A 以終濃度1 μg/L 加入上清液，室溫靜置30 min。隨后將聚乙二醇8 000 以終濃度0.1 μg/mL 加入上清液，冰上孵育2 h 以上，4 ℃以10 000 r/min離心20 min。噬菌體最終附著到離心管管壁上，棄掉上清液，用3 mL SM緩沖液重懸噬菌體，加入等體積的氯仿萃取，充分混合后用4 ℃離心機(jī)以4 000 r/min 離心20 min，重復(fù)萃取3次。將濃縮的噬菌體VB-SavM-JYL02 樣品采用磷鎢酸負(fù)染法染色后使用透射電子顯微鏡觀觀察形態(tài)。

1.3.2 噬菌體VB-SavM-JYL02 最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）測(cè)定 將宿主菌SA.1545在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm=0.6），調(diào)整菌落數(shù)至1×108cfu/mL，分別按照MOI 0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例加入不同量的噬菌體，37 ℃180 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h。分別取其培養(yǎng)液，4 ℃10 000 r/min 離心2 min，過(guò)濾后10 倍倍比稀釋，通過(guò)雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體滴度，以確定噬菌體最佳MOI，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 噬菌體VB-SavM-JYL02 的一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將S. aureus SA.1545 在TSB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm=0.6），取1 mL 菌液離心后棄去上清液，用等體積新鮮的TSB 培養(yǎng)基重懸沉淀。以上述篩選的最佳MOI 加入噬菌體，使其在37°C 吸附10 min。將混合物4 ℃10 000 r/min離心15 min，隨后將沉淀物重新懸浮于5 mL 新鮮TSB 培養(yǎng)基中37 ℃180 r/min 振蕩培養(yǎng)70 min，每10 min 取100 μL 培養(yǎng)液，10 倍倍比稀釋后，通過(guò)雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體滴度，繪制噬菌體生長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 噬菌體VB-SavM-JYL02 的宿主譜測(cè)定 通過(guò)空斑法和雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體的宿主譜。觀察噬菌體在涂有菌液的固體培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生空斑或噬菌斑，以確定該噬菌體對(duì)所測(cè)菌株是否有裂解活性。共選取50 株菌（包括4 株表皮葡萄球菌和46 株S.aureus）用于噬菌體VB-SavM-JYL02 的宿主譜測(cè)定。

1.4 噬菌體VB-SavM-JYL02 基因組測(cè)序及其同源性比對(duì)分析利用IlluminaHiSeq 2500 測(cè)序平臺(tái)對(duì)噬菌體VB-SavM-JYL02 進(jìn)行全基因組測(cè)序；利用SOAPdenovo 軟件拼接噬菌體VB-SavM-JYL02 基因組序列對(duì)并其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用BLAST 和GeneMarkS 預(yù)測(cè)和分析噬菌體VB-SavM-JYL02 潛在的開放閱讀框（ORF）；利用CLC Main Workbench ver?sion 7.7.3 軟件制作噬菌體VB-SavM-JYL02 基因功能模塊圖譜；利用BLAST 比對(duì)與噬菌體VB-SavMJYL02 全基因組序列同源性較高的噬菌體，并利用Mauve 2.3.1 軟件對(duì)其比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離和純化利用牛源S. aureus?SA.1545 從污水中分離出一株噬菌體，利用雙層平板法純化3 代后，獲得直徑大小為1 mm～2 mm，邊緣整齊透亮，無(wú)暈環(huán)透明圓斑樣噬菌斑（圖1）。表明該噬菌體具有較強(qiáng)的裂解活性，命名為噬菌體VB-SavM-JYL02。

圖1 噬菌體VB-SavM-JYL02 純化后在雙層板上產(chǎn)生的噬斑，直徑約1 mm～2 mmFig.1 The plaques produced by the phage VB-SavM-JYL02 on the double-layer plate after purification, about 1 mm-2 mm in diameter

2.2 噬菌體VB-SavM-JYL02 的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果噬菌體VB-SavM-JYL02 濃縮后經(jīng)電鏡觀察可見該噬菌體頭部呈正二十面體，頭部直徑為85 nm～90 nm，尾部長(zhǎng)約180 nm～190 nm，且尾部可收縮。噬菌體VB-SavM-JYL02 從形態(tài)學(xué)上分析屬于有尾病毒目，肌尾病毒科（圖2）。當(dāng)MOI 為0.01 時(shí)，噬菌體VB-SavM-JYL02 的效價(jià)最高，約達(dá)到5.2×109pfu/mL（圖3）。一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示噬菌體VB-SavMJYL02 具有較短的潛伏期，約為20 min，爆發(fā)期約為20 min，一個(gè)裂解周期約為40 min（圖4），表明噬菌體有很強(qiáng)的殺菌效率。

利用空斑法和雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體VBSavM-JYL02 的宿主譜?？瞻叻ńY(jié)果顯示噬菌體VBSavM-JYL02 在所有50 株測(cè)試菌株的平板上均能產(chǎn)生空斑，雙層瓊脂平板法檢測(cè)結(jié)果顯示噬菌體VBSavM-JYL02 能在其中32 株菌（包括2 株表皮葡萄球菌和30 株S. aureus）的雙層瓊脂平板上產(chǎn)生噬菌斑，表明噬菌體能夠裂解其中32 株葡萄球菌，具有很寬的宿主譜，裂解率為64%（32/50）（表1）。

圖2 噬菌體VB-SavM-JYL02 的透射電鏡圖，比例尺代表100 nmFig.2 Transmission electron microscope image of phage VB-SavM-JYL02, scale bar represents 100 nm

圖3 噬菌體VB-SavM-JYL02 的最佳MOI 的測(cè)定Fig.3 Optimal multiplicity of infection (MOI) determination of phage VB-SavM-JYL02

圖4 噬菌體VB-SavM-JYL02 的一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig.4 One-step growth curve determination of phage VB-SavM-JYL02

2.3 噬菌體VB-SavM-JYL02 基因組學(xué)分析經(jīng)測(cè)序及拼接后，噬菌體VB-SavM-JYL02 的完整基因組序列上傳至GenBank（MK250904.1）。噬菌體VBSavM-JYL02 的基因組屬于線性雙鏈DNA，全長(zhǎng)141 384 bp，G+C 含量30.18%，共編碼218 個(gè)ORF。利用軟件制作噬菌體VB-SavM-JYL02 基因功能模塊圖譜（圖5）。每個(gè)箭頭代表編碼蛋白質(zhì)的ORF，箭頭的方向代表基因轉(zhuǎn)錄方向。大多數(shù)噬菌體基因是正向轉(zhuǎn)錄的（20～181 個(gè)ORF），其余均為逆向轉(zhuǎn)錄。將所有ORF 分為6 大類，包括核苷酸代謝和復(fù)制、宿主裂解、形態(tài)發(fā)生、DNA 包裝、病毒代謝相關(guān)及假定蛋白質(zhì)，在所有鑒定的ORF 中，該噬菌體與已知功能蛋白質(zhì)具有高度相似性的72 種基因產(chǎn)物暫時(shí)被賦予相應(yīng)的功能，其中宿主裂解相關(guān)基因位于ORF13 和ORF14，末端酶大亞基位于ORF23。未發(fā)現(xiàn)與抗藥性、致病性或溶原性相關(guān)的基因序列，這有利于該噬菌體用于治療性藥物的研發(fā)。

表1 VB-SavM-JYL02 的宿主譜Table 1 Host rangeof VB-SavM-JYL02

圖5 噬菌體VB-SavM-JYL02 全基因組分析Fig.5 Whole genome analysis of phage VB-SavM-JYL02

經(jīng)BLAST 比對(duì)分析，噬菌體VB-SavM-JYL02 在基因組水平上與S. aureus 噬菌體VB-SavM-JYL01（MH159197.1）、vB_SauM_LM12（MG721208.1）、SA3（MF001365.1）、P108（KM216423.1）、phiIPLA-RODI（KP027446.1）、GH15（JQ686190.1）、qdsa002（KY77 9849.1）、JD007（JX878671.1）及S25-4（AB853331.1）具有高度同一性。利用Mauve 2.3.1軟件對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析（圖6），序列相似性由不同顏色條柱的高度表示，其對(duì)應(yīng)于基因組序列中該區(qū)域中的平均保守水平。噬菌體VB-SavM-JYL02與同源噬菌體的基因組共線性分析結(jié)果顯示，這10個(gè)S.aureus噬菌體存在及其相似的基因模塊排布順序，不同噬菌體保有其特異性序列，顯示出S.aureus噬菌體的基因組排布特征，表明噬菌體基因組存在種屬關(guān)聯(lián)性與個(gè)體特異性。

圖6 噬菌體VB-SavM-JYL02 與同源噬菌體基因組共線性分析Fig.6 Co-linear analysis of phage VB-SavM-JYL02 and homologous phages

3 討 論

噬菌體作為抗菌劑具有很大的潛力成為替代抗生素候選物。噬菌體療法已經(jīng)在動(dòng)物感染模型的治療試驗(yàn)中獲得了一定的成功，可能成為治療牛乳腺炎的一種有效的替代療法。因此，篩選安全性高，殺菌活性強(qiáng)的牛源S. aureus 噬菌體尤為重要。

本研究利用牛源S. aureus SA.1545 從污水中分離得到一株新的噬菌體VB-SavM-JYL02，該噬菌體在體外表現(xiàn)出高效的裂解活性。噬菌體形態(tài)與已報(bào)道的S. aureus 噬菌體VB-SavM-JYL01、GH15、K 以及MSA6 相似[9-10]。其中噬菌體MSA6 是從患有乳腺炎的奶牛中分離出來(lái)，具有較寬的宿主譜，能夠裂解與牛乳腺炎相關(guān)的致病葡萄球菌以及與人類感染相關(guān)的耐抗生素S. aureus[9]。而噬菌體VB-SavM-JYL02同樣具有寬宿主譜（64%），同樣能夠裂解一些與人類感染相關(guān)的臨床致病菌株。全基因組比對(duì)結(jié)果顯示噬菌體VB-SavM-JYL02 與VB-SavM-JYL01 同源性為100%[11]，但是VB-SavM-JYL02 與VB-SavM-JYL01裂解譜卻有差異，兩者雖然都能在所測(cè)試的50 株葡萄球菌產(chǎn)生空斑，但VB-SavM-JYL02 能夠裂解葡萄球菌R066、R002、J2 和SL1，VB-SavM-JYL01 則不能裂解這4 株菌，而VB-SavM-JYL01 能夠裂解葡萄球 菌W074、 R027、 W4552、 R3790、 R3659 和R6199，VB-SavM-JYL02 則不能裂解這6 株葡萄球菌[11]，這可能與噬菌體基因組內(nèi)其他未表征的假定蛋白有關(guān)。此外，噬菌體VB-SavM-JYL02 與GH15和K 的同源性分別為99%和96%，但噬菌體VBSavM-JYL02 的宿主譜卻比GH15 和K 要寬很多，而尾絲蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示噬菌體VBSavM-JYL02 與GH15 和K 的同源性都為92%，尾絲蛋白氨基酸序列的差異可能導(dǎo)致宿主譜的差異[12]。

總之，噬菌體VB-SavM-JYL02 具有高效裂解活性和寬宿主譜，以及基因組中不存在與細(xì)菌毒力、抗生素抗性以及溶原相關(guān)的基因，這些特點(diǎn)都有利于該噬菌體用于S. aureus 感染引起的奶牛乳腺炎及相關(guān)疾病的預(yù)防和治療。