姜利英，趙鍵龍，張慧桐，宋甲寶，步志高，胡 森

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

布魯氏菌?。ú疾。┦怯刹剪斒暇鸬囊环N人獸共患傳染病，主要引起動(dòng)物和人流產(chǎn)及不孕不育[1]。該病呈世界范圍分布，中東和亞洲地區(qū)流行較廣，近些年我國(guó)人和動(dòng)物布病均呈上升趨勢(shì)[2]。布魯氏菌為革蘭陰性球桿菌，是α 變形桿菌門(mén)布魯氏菌屬成員，能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)，有利于其定植在巨噬細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致慢性感染[3]。布魯氏菌主要分為6 個(gè)種，對(duì)人和家畜危害嚴(yán)重的主要為馬耳他種布魯氏菌、豬種布魯氏菌和流產(chǎn)種布魯氏菌，其中馬耳他種的感染性和致病力最強(qiáng)。

Small RNA（sRNA）是一類(lèi)大小為50 nt～300 nt 的小分子非編碼RNA，廣泛分布于原核和真核生物中，是生命活動(dòng)中重要的調(diào)控因子，通過(guò)順式和反式作用等方式參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。目前在大腸桿菌[4]、沙門(mén)氏菌[5]、耶爾森菌[6]等中相繼發(fā)現(xiàn)了參與調(diào)控靶基因表達(dá)的sRNA，在細(xì)菌代謝、毒力決定、環(huán)境適應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。但布魯氏菌sRNA 的研究較少，本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，以布魯氏菌強(qiáng)毒株M28 為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、篩選并驗(yàn)證了幾個(gè)新sRNA，并證明了其中的Bmsr1能夠降低布魯氏菌的毒力[7]，Bmsr10也是本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的新sRNA之一。本研究利用同源重組方法構(gòu)建布魯氏菌Bmsr10的缺失株，通過(guò)對(duì)布魯氏菌體內(nèi)外增殖能力的檢測(cè)，分析Bmsr10缺失對(duì)布魯氏菌M28毒力的影響，為進(jìn)一步研究sRNA對(duì)布魯氏菌毒力作用機(jī)制及疫苗的開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料馬耳他布魯氏菌強(qiáng)毒株M28和馬耳他布魯氏菌疫苗株M5-90（由M28致弱）由哈爾濱獸醫(yī)研究所菌種保藏中心保存并提供。巨噬細(xì)胞RAW264.7、pSP72質(zhì)粒、pBBR1MCS4質(zhì)粒和pIRES2-EGFP 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。5 周齡～6 周齡SPF 雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 sRNA Bmsr10 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和Northern blot 檢測(cè)采用RNAfold web server（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）對(duì)Bmsr10 的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。參照文獻(xiàn)[7]，以利用RNA Extraction kit 提取的布魯氏菌M28 總RNA 為模板，以前面加有T7 啟動(dòng)子序列（TAATACGACTCACTATAGGG）的RT-Bmsr10-f/RT-Bmsr10-r 為引物（表1），進(jìn)行Northern blot，檢測(cè)Bmsr10 是否表達(dá)。

1.3 重組質(zhì)粒pSP-Bmsr10-K 和pBB-Bmsr10 的構(gòu)建與鑒定利用CE Design 軟件設(shè)計(jì)sRNA Bmsr10左、右同源臂和卡那霉素抗性基因引物（表1）。以RNA Extraction kit 提取的布魯氏菌M28 基因組為模板，分別以L-f/L-r、R-f/R-r 為引物，擴(kuò)增sRNA Bmsr10 的左右同源臂；以含有卡那霉素抗性基因質(zhì)粒pIRES2-EGFP為模板，以K-f/K-r為引物，擴(kuò)增卡那霉素抗性基因。sRNABmsr10左、右同源臂片段和卡那霉素抗性基因片段經(jīng)純化，利用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 同時(shí)克隆至pSP72 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，接種卡那霉素平板（50 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取陽(yáng)性單菌落，進(jìn)行菌落PCR 鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pSP-Bmsr10-K。以M28 基因組為模板，Bmsr10-com-f/Bmsr10-com-r 為引物，擴(kuò)增含Bmsr10 調(diào)控序列的片段，利用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 將該片段克隆至pBBR1MCS4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，接種氨芐青霉素平板（100 μg/mL）37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取陽(yáng)性單菌落，進(jìn)行菌落PCR 鑒定，提取陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pBB-Bm?sr10。以上質(zhì)粒經(jīng)中量制備并保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物和序列Table 1 Primers and sequence

1.4 缺失株M28ΔBmsr10 和回補(bǔ)株M28ΔBmsr10-com 的構(gòu)建與鑒定參考文獻(xiàn)[8]制備M28 感受態(tài)細(xì)胞，取10 μg 重組質(zhì)粒pSP-Bmsr10-K 電轉(zhuǎn)（300 V，900 μF，5 ms）入M28 感 受 態(tài) 細(xì) 胞，37 ℃振 蕩（200 r/min）培養(yǎng)12 h 后，將菌液涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的TSA 平皿，37 ℃培養(yǎng)96 h。挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落，分別劃線培養(yǎng)至含卡那霉素（50 μg/mL）和氨芐青霉素（100 μg/mL）的TSA平皿上。連續(xù)傳代并純化5 代后，挑取卡那霉素抗性而氨芐青霉素敏感的單個(gè)菌落，利用引物Bmsr10L-f/Bmsr10R-r、L-f/R-r、L-f/K-r和K-f/R-r對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR鑒定，并將PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定，陽(yáng)性菌命名為M28ΔBmsr10。按照同樣方法，取10 μg 重組質(zhì)粒pBB-Bmsr10 電轉(zhuǎn)入（300 V，900 μF，5 ms）M28ΔBmsr10 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)氨芐青霉素（100 μg/mL）篩選純化，挑取陽(yáng)性菌落，以Bm?sr10-com-f/Bmsr10-com-r為引物進(jìn)行PCR 鑒定，陽(yáng)性菌株命名為M28ΔBmsr10-com。

1.5 缺失株M28ΔBmsr10 生長(zhǎng)曲線測(cè)定分別挑取新鮮培養(yǎng)的M28ΔBmsr10、M28 和M5-90 單菌落接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基（卡那霉素50 μg/mL），置于37 ℃，振蕩培養(yǎng)（200 r/min）至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（約12 h），測(cè)定各菌液OD600nm值，并分別稀釋至OD600nm=0.05。以1:100 比例轉(zhuǎn)接于100 mL 的TSB 液體培養(yǎng)基，置于37 ℃，振蕩培養(yǎng)（200 r/min）54 h（平臺(tái)期），期間每6 h 取一次樣，每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)，測(cè)定其OD600nm，繪制M28、M28ΔBmsr10 和M5-90 在TSB 液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

1.6 缺失株M28ΔBmsr10 巨噬細(xì)胞感染試驗(yàn)將RAW264.7 細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)至每孔約5×106個(gè)細(xì)胞。將M28ΔBmsr10、M28、M28ΔBmsr10-com 和M5-90 按MOI 100，分別感染9個(gè)孔的RAW264.7細(xì)胞（每個(gè)感染時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)重復(fù)），37 ℃5% CO2培養(yǎng)4 h，然后用PBS（pH 7.2）洗3次，加入300 μL DMEM培養(yǎng)基（含終濃度5 μg/mL 慶大霉素）繼續(xù)培養(yǎng)。分別于感染后6 h、24 h和48 h各取3個(gè)孔的細(xì)胞，利用Triton X-100裂解，按1:10倍比稀釋裂解液至10-4、10-5和10-6，將各稀釋度分別取100 μL 涂布于TSA 平皿（做3 個(gè)重復(fù)），37 ℃培養(yǎng)96 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.7 缺失株M28ΔBmsr10 小鼠感染試驗(yàn)將96只5周齡～6 周齡雌性BALB/c 小鼠隨機(jī)分成4 組，每組24只，分別以1×106cfu/100 μL/只經(jīng)腹腔接種M28ΔBm?sr10、M28 和M5-90，對(duì)照組腹腔接種100 μL PBS。接種后第1、3、5和7周迫殺小鼠，無(wú)菌分離脾臟，稱(chēng)重后將整個(gè)脾臟組織研磨（25 t/s，10 min），將組織懸液按1:10倍比稀釋?zhuān)∵m當(dāng)稀釋度100 μL涂布于TSA固體培養(yǎng)基（每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)），37 ℃培養(yǎng)96 h，菌落計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)采用軟件Graphpad（Version 6.04）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。采用t 檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p< 0.05（*）表示差異顯著，p< 0.01（**）表示差異極顯著，p<0.001（***）表示差異極其顯著。

2 結(jié) 果

2.1 sRNA Bmsr10 二級(jí)結(jié)構(gòu)模式圖及Northern blot檢測(cè)利用生物學(xué)軟件RNAfold 測(cè)定sRNA Bmsr10 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，Bmsr10 有3 個(gè)大環(huán)，并伸出多個(gè)小環(huán)，呈典型的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，符合sRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。利用Northern blot 檢測(cè)Bmsr10 表達(dá)情況，結(jié)果顯示：RNA 探針能夠特異性的識(shí)別Bmsr10 的表達(dá)，其大小與181 nt 理論值一致（圖1）。表明，sRNA Bmsr10 能夠在布魯氏菌M28 中正確表達(dá)。

圖1 sRNA Bmsr10 二級(jí)結(jié)構(gòu)模式圖和northern blot 分析Fig.1 sRNA secondary structure pattern and Northern blot analysis

2.2 重組質(zhì)粒pSP-Bmsr10-K 和pBB-Bmsr10 的構(gòu)建與鑒定以M28 基因組為模板PCR 擴(kuò)增Bmsr10左、右同源臂，以pIRES2-EGFP為模板PCR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因。結(jié)果顯示擴(kuò)增的3 個(gè)基因片段大小分別約為500 bp、500 bp 和1 258 bp，均與預(yù)期相符（圖2A）。將Bmsr10 左、右同源臂和卡那霉素抗性基因克隆至質(zhì)粒pSP72，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSP-Bmsr10-K，通過(guò)PCR 鑒定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為2 258 bp，產(chǎn)物與預(yù)期大小相符（圖2B）。將擴(kuò)增的sRNA Bm?sr10 序列克隆至pBBR1MCS-4，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBBBmsr10，PCR 鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增片段為512 bp，與預(yù)期相符（NC_017245.1）（圖2C）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定，測(cè)序序列均正確。表明重組質(zhì)粒pSP-Bm?sr10-K 和pBB-Bmsr10 構(gòu)建 正確。

高中物理知識(shí)很抽象，教師如果只是單純地對(duì)理論知識(shí)進(jìn)行講解，學(xué)生理解起來(lái)就會(huì)有很大的困難.為了取得很好的課堂效果，教師會(huì)加入實(shí)驗(yàn)進(jìn)行教學(xué)，同時(shí)教師還會(huì)考慮對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行創(chuàng)新，以更好地激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，使學(xué)生能夠融入到實(shí)驗(yàn)中來(lái)，這樣不僅能夠讓學(xué)生有體驗(yàn)的機(jī)會(huì)，幫助學(xué)生領(lǐng)略知識(shí)的內(nèi)涵，還能有效地培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力，提高課堂教學(xué)效率.

2.3 缺失株M28ΔBmsr10 和回補(bǔ)株M28ΔBmsr10-com 構(gòu)建與鑒定經(jīng)卡那霉素和氨芐青霉素連續(xù)篩選5 代，得到僅在卡那霉素抗性的平板上生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌落，命名為M28ΔBmsr10， PCR 鑒定重組菌M28ΔBmsr10，結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物分別為2 366 bp、2 258 bp、1 758 bp 和1 758 bp，并將PCR 產(chǎn)物測(cè)序鑒定，結(jié)果均與預(yù)期相符（圖3A）。同樣對(duì)回補(bǔ)菌M28ΔBmsr10-com，以Bmsr10-com-f/Bmsr10-com-r為引物PCR 鑒定，結(jié)果顯示，產(chǎn)物大小為512 bp，產(chǎn)物測(cè)序鑒定結(jié)果，與預(yù)期相符（圖3B）。結(jié)果表明：缺失株M28ΔBmsr10 和回補(bǔ)株M28ΔBmsr10-com正確構(gòu)建。

圖2 pSP-Bmsr10-K 和pBBR1MCS4- sRNA Bmsr10 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig.2 Construction and identification of plasmid pSP-Bmsr10-K and pBB-Bmsr10

圖3 缺失株M28ΔBmsr10（A）和回補(bǔ)株M28ΔBmsr10-com（B）的PCR 鑒定Fig.3 Identification of deletion strain M28ΔBmsr10 and complementation strain M28ΔBmsr10-com by PCR

2.4 缺失株M28ΔBmsr10 體外生長(zhǎng)曲線測(cè)定每6 h 取3 mL 菌液測(cè)定OD600nm值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)作3 個(gè)重復(fù)，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，M28ΔBmsr10 和M28生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)一致，均在54 h達(dá)到平臺(tái)期，兩者生長(zhǎng)曲線無(wú)顯著差異（p>0.05）。但M28 和M28ΔBmsr10 生長(zhǎng)滴度均高于M5-90，差異均顯著（p<0.01）（圖4）。表明在TSB 液體培養(yǎng)基中sRNA Bmsr10 缺失不影響馬耳他布魯氏菌M28 體外的生長(zhǎng)增殖。

2.5 缺失株M28ΔBmsr10 巨噬細(xì)胞感染試驗(yàn)將M28ΔBmsr10、M28、M5-90 和M28ΔBmsr10-com 分別感染RAW264.7 巨噬細(xì)胞后于各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示：M28ΔBmsr10、M28、M5-90 和M28ΔBmsr10-com 均在感染48 h 時(shí)分菌數(shù)最多。感染6 h，M28ΔBmsr10 與M28 和M28ΔBmsr10-com 差異不顯著（p>0.05）（圖5）。感染24 h，M28ΔBmsr10 分菌數(shù)為7.09 log，顯著低于M28 的7.26 log（p<0.05）；感染48 h，M28ΔBmsr10 和M28 分菌數(shù)分別為8.39 log 和8.60 log。結(jié)果表明：sRNA Bmsr10 缺失降低了布魯氏菌M28在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。

圖4 缺失株M28ΔBmsr10 體外生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of M28ΔBmsr10 strain in vitro

圖5 缺失株M28ΔBmsr10 在RAW264.7 巨噬細(xì)胞中的增殖Fig.5 Propagation of M28ΔBmsr10 strain in RAW264.7macrophagocytes

2.6 缺失株M28ΔBmsr10 小鼠體內(nèi)感染試驗(yàn)將M28ΔBmsr10、M28 和M5-90 分別腹腔感染小鼠，比較感染后不同時(shí)間脾臟分菌數(shù)及脾重情況。結(jié)果顯示：M28ΔBmsr10、M28 和M5-90 在感染1 周時(shí)脾臟分菌數(shù)均達(dá)到峰值（圖6A），隨后逐漸下降。M28ΔBmsr10與M28相比，感染后1周、3周、5周和7周小鼠脾臟分菌數(shù)（p<0.01）和脾臟重量（p<0.01）均顯著降低。尤其是感染5 周時(shí)，M28ΔBmsr10 與M28 的小鼠脾臟分菌數(shù)差異最大，M28ΔBmsr10 為4.27 log顯著低于M28 5.44 log（p<0.001）（圖6A）。感染后3周時(shí)，M28ΔBmsr10 小鼠脾臟重量為0.41g，顯著低于M28 0.58 g（p<0.01）（圖6B）。結(jié)果表明：sRNA Bmsr10 缺失顯著降低了M28 在小鼠體內(nèi)的增殖能力和炎癥反應(yīng)。

3 討 論

布魯氏菌是革蘭氏陰性、無(wú)典型毒力因子的胞內(nèi)菌，其中馬耳他布魯氏菌對(duì)人和動(dòng)物的致病力最強(qiáng)，是導(dǎo)致目前我國(guó)布病流行的主要菌種。因此，本研究以馬耳他種布魯氏菌M28 株（強(qiáng)毒株）為研究對(duì)象，探究sRNA Bmsr10 缺失對(duì)其在毒力方面的影響。

圖6 M28ΔBmsr10 感染小鼠脾臟分菌數(shù)（A）和脾臟重量（B）Fig.6 Spleen counts(A)and spleen weights(B)of BALB/c mice after M28ΔBmsr10 infection

sRNAs 作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分子，廣泛參與細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)，如溫度變化、營(yíng)養(yǎng)脅迫、滲透休克和代謝失衡等[9-10]。有文獻(xiàn)報(bào)道布魯氏菌抵抗和適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)殺菌或抑菌的能力，也是通過(guò)調(diào)控基因的協(xié)調(diào)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[11]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用在線生物軟件（RNAfold web serv?er http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）發(fā)現(xiàn)其具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1A），符合sRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)特征?sRNA 的表達(dá)需要Northern blot 來(lái)驗(yàn)證，因此本研究進(jìn)一步利用Bmsr10 探針與M28 的總RNA 雜交，膠片顯影結(jié)果證明其能夠表達(dá)（圖1B），大小也與理論值一致。另外，Blast N 分析結(jié)果也顯示，Bmsr10 在馬耳他布魯氏菌和流產(chǎn)布魯氏菌中是保守的（結(jié)果略）。

利用質(zhì)粒pSP72[8]和pBBR1MCS4[7]作為自殺和回補(bǔ)質(zhì)粒的布魯氏菌基因缺失-回補(bǔ)系統(tǒng)是本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間摸索并建立，多個(gè)研究證明該系統(tǒng)具有較高效率，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求[7-8,12-13]。

已有研究發(fā)現(xiàn)OmpR 基因缺失會(huì)導(dǎo)致M28 在固體培養(yǎng)基（TSA）上生長(zhǎng)受到抑制[13]，本研究結(jié)果顯示在液體培養(yǎng)基（TSB）上觀察Bmsr10 缺失對(duì)M28 生長(zhǎng)曲線無(wú)變化，表明缺失Bmsr10 并未影響M28 菌落的生長(zhǎng)速度?

研究表明sRNA Bmsr1 的缺失會(huì)降低布魯氏菌M28 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力[7]，本研究結(jié)果顯示，M28ΔBmsr10 感染巨噬細(xì)胞后分離的細(xì)菌數(shù)顯著低于M28。表明缺失Bmsr10 顯著降低了布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。

為了進(jìn)一步檢測(cè)Bmsr10 對(duì)體內(nèi)布魯氏菌的生長(zhǎng)增殖/毒力是否有影響，本研究選擇小鼠作為動(dòng)物感染模型。與巨噬細(xì)胞相比，體內(nèi)環(huán)境更接近于細(xì)菌的真實(shí)生存條件，更能有效地反映Bmsr10 對(duì)布魯氏菌M28 的毒力是否有影響。結(jié)果顯示，感染后無(wú)論脾臟分菌數(shù)還是脾臟重量，Bmsr10 缺失株均顯著低于M28 株（圖6）。但Bmsr10 是如何調(diào)控其靶基因來(lái)降低毒力具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究多處以M5-90 作為對(duì)照（M5-90 是由強(qiáng)毒株M28 馴化致弱，是我國(guó)防治牛、羊布病的疫苗株之一），目的是將其與M28ΔBmsr10 進(jìn)行比較，觀察M28ΔBmsr10 毒力下降是否能夠達(dá)到疫苗株下降的程度。結(jié)果顯示，M28ΔBmsr10 與親本株相比雖有顯著下降，但未達(dá)到疫苗株的程度。目前對(duì)sRNA 缺失標(biāo)記疫苗研究不多，有文獻(xiàn)報(bào)道刪除多個(gè)sRNA 構(gòu)建的鼠傷寒沙門(mén)氏菌弱毒疫苗具有良好的保護(hù)性[14]。因此，在M28ΔBmsr10 基礎(chǔ)上進(jìn)行多缺失是否可以獲得更低毒力的疫苗株值得進(jìn)一步研究。

綜上，Bmsr10 的缺失會(huì)降低布魯氏菌M28 毒力，該研究為進(jìn)一步探究布魯氏菌的毒力作用機(jī)制及構(gòu)建候選疫苗提供了新的思路。