陳穎 張麗萍 宋瑞雯 徐磊

抑郁癥是一種情感障礙性精神疾病，以顯著而持久的心境低落為主要特征，常伴有情緒抑郁、焦慮、興趣減退、軀體不適、食欲不振等癥狀。臨床中常見的抗抑郁西藥如氟西汀、帕羅西汀等，長期服用易產(chǎn)生惡心、失眠等副作用，影響患者的依從性。而中醫(yī)藥辨證論治、身心整體調(diào)理的特點(diǎn)，中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多層次的藥理作用，在治療抑郁癥上具有一定的優(yōu)勢。抑郁癥嚴(yán)重危害人類心身健康，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，存在多種假說：細(xì)胞因子假說、HPA軸假說、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說、神經(jīng)可塑性假說等，其中細(xì)胞因子假說中的色氨酸—犬脲氨酸(tryptophan- kynurenine,TRP-KYN)的代謝通路被證實(shí)和抑郁癥密切相關(guān)[1]。TRP-KYN通路的多種代謝產(chǎn)能夠影響神經(jīng)可塑性。近年來，較多研究發(fā)現(xiàn)吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine2,3 -dioxygenase,IDO)，一種色氨酸降解酶，是TRP-KYN代謝通路上的第一個(gè)限速酶，且其水平和抑郁樣癥狀呈正相關(guān)[2]；IDO增多或過度激活導(dǎo)致TRP更多的代謝為KYN，大量耗竭TRP。KYN的下游代謝產(chǎn)物中：3-羥基犬脲氨酸(3- hydroxy kynurenine,3-HKYN)、3-羥鄰氨苯甲酸(3- hydroxy anthranilic acid,3-HAA)、喹啉酸(quinolinic acid,QUIN)具有神經(jīng)毒性作用，犬脲喹啉酸(kynurenic acid,KYNA)能對(duì)抗QUIN的毒性而具有神經(jīng)保護(hù)作用[3]。本研究以調(diào)理中焦脾胃氣機(jī)立法，觀察中藥復(fù)方加味溫膽湯的抗抑郁作用，并研究其對(duì)TRP-KYN代謝通路的影響，闡明加味溫膽湯的抗抑郁效應(yīng)及對(duì)TRP-KYN通路的影響，探討代謝產(chǎn)物的神經(jīng)保護(hù)/毒性作用在抑郁癥發(fā)病中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

加味溫膽湯(由竹茹6 g、半夏10 g、厚樸10 g、石菖蒲20 g、云苓30 g、陳皮10 g、枳實(shí)10 g、合歡花30 g、桃仁10 g、郁金15 g、姜黃30 g、柏子仁30 g、遠(yuǎn)志6 g、大黃3 g、炒麥芽30 g、生薏苡仁30 g等組成)，上述藥材均由北京同仁堂藥業(yè)有限公司提供，水煎濃縮為1.5 g/mL，放置4℃冰箱內(nèi)備用。鹽酸氟西汀規(guī)格為20 mg/粒(批號(hào)：H20170003)，Patheam France(禮來蘇州制藥有限公司)分裝 。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

TRP試劑盒(貨號(hào)：SBJ-M0728-96T)、KYN試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R0979-96T)、3-HKYN試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R0982-96T)、3-HAA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-R098-96T)、QUIN試劑盒(貨號(hào)：SBJ- R0984-96T)、KYNA試劑盒(貨號(hào)：SBJ-M0328-96T)，均購自南京森貝伽生物科技有限公司。大鼠束縛架(自制)，曠場實(shí)驗(yàn)箱(自制)：長×寬×高=100 cm×100 cm ×40 cm，攝像機(jī)(Panasonic，Japan)，ACS-2EAS型電子秤(北京市菲姆斯科技有限公司)，Etho Vision3.0分析軟件(Noldus)，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf)，37℃恒溫箱(BINDER)，Sunrise Romote 酶標(biāo)儀(天津天美國際貿(mào)易有限公司提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性SD(Sprague Dawley)大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g。由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK-(京)2017-0001。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究中心，動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用符合國際動(dòng)物倫理法，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)室溫度為(22±2)℃，光照時(shí)間為8:00～20:00。 將48只大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為空白組、模型組、西藥組、中藥組。空白組不給予任何刺激。其余3組孤養(yǎng)，并給予多種不同刺激，制備慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)抑郁大鼠模型[4]。

1.4 模型制備

模型制備方法[4]具體如下：除空白組外，其余各組采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)方法進(jìn)行模型制備。空白組群養(yǎng)，自由進(jìn)水食，不接受任何刺激。其余3組單籠飼養(yǎng)，給予21天不同刺激，包括24小時(shí)禁水、24小時(shí)禁食、4℃冷水游泳5分鐘、45℃熱刺激5分鐘、夾尾1分鐘(用塑料夾子夾住距大鼠尾尖1 cm處)、鼠籠傾斜45° 24小時(shí)、潮濕墊料24小時(shí)、噪音15分鐘、明暗顛倒24小時(shí)共9種刺激，每天隨機(jī)安排不同的刺激，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，同一種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，且在21天內(nèi)不超過3次。

造模成功后，給予藥物連續(xù)灌胃4周，西藥組灌胃氟西汀1.8 mg/(kg·d)，中藥組灌胃加味溫膽湯12 g/(kg·d)，空白組自由飲水，模型組每日灌胃等量生理鹽水。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 外觀表征和體重 觀察大鼠皮膚毛發(fā)的色澤、枯榮；活躍狀況；爬行狀態(tài)、飲食情況；大小便狀態(tài)等。在造模前后及給藥干預(yù)后測量大鼠的體質(zhì)量變化。

1.5.2 行為學(xué)檢測 (1)曠場實(shí)驗(yàn)：曠場實(shí)驗(yàn)箱由不透明的黑色硬紙板制造，底面為100 cm ×100 cm的正方形，被平均分為25個(gè)10cm ×10 cm的等邊小方格，周圍是高40 cm的黑色硬紙板。模型建立前后及給藥干預(yù)結(jié)束后1天的14:00～18:00在安靜的環(huán)境下進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。將大鼠放入曠場地面中央，同時(shí)攝像機(jī)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，計(jì)時(shí)4分鐘，每只大鼠進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)，完畢后徹底清潔實(shí)驗(yàn)箱再進(jìn)行下一只大鼠的實(shí)驗(yàn)。觀察大鼠在后3分鐘內(nèi)穿越格數(shù)，大鼠4爪均進(jìn)入方格，記數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)得分1分，兩后肢直立次數(shù)，兩前肢騰空或攀附側(cè)壁，記數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)得分1分，兩者分?jǐn)?shù)之和記為總得分。(2)糖水偏好實(shí)驗(yàn)：各組大鼠在造模前后及給藥干預(yù)后給予糖水消耗實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行糖水適應(yīng)，給予兩瓶1%的蔗糖水24小時(shí)后，再給予一瓶1%的蔗糖水、一瓶純水24小時(shí)，12小時(shí)時(shí)交換兩瓶的位置，禁食禁水24小時(shí)，予一瓶1%的蔗糖水、一瓶純水，兩瓶位置隨機(jī)放置，觀察其在1小時(shí)內(nèi)的糖水和純水的消耗量，并排除飲水瓶滴漏所致的液體消耗量。糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%。(3)分子生物學(xué)檢測：在大鼠藥物干預(yù)結(jié)束后，斷頭取血1.5 mL靜置30分鐘，3000 r/min離心10分鐘，取上清液于干凈的EP管中，置于-80℃冰箱保存待測。用ELISA法測定大鼠血清TRP-KYN代謝通路相關(guān)分子TRP、KYN、3-HKYN、3-HAA、QUIN、KYNA的含量。主要試劑：TRP、KYN、3-HKYN、3-HAA、QUIN、KYNA ELISA試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供，測定按照試劑盒說明嚴(yán)格進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外觀表征和體重變化

藥物干預(yù)后，觀察各組大鼠的外觀表征，模型組大鼠皮毛粗糙，色澤暗淡，爬行活躍程度明顯低于空白組，大便稀溏、小便頻數(shù)色黃。中藥組和西藥組皮毛色澤明亮、細(xì)膩光滑；活動(dòng)度明顯高于模型組、飲食情況良好；大便、小便情況尚可。

造模前各組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。21天慢性應(yīng)激后，與空白組比較，模型組、中藥組、西藥組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；藥物干預(yù)后，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)，與模型組比較，中藥組和西藥組體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，中藥組和西藥組大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較

2.2 各組大鼠行為評(píng)價(jià)結(jié)果比較

造模前各組大鼠的活動(dòng)度和糖水偏愛差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。21天慢性應(yīng)激后，與空白組比較，其余三組糖水偏愛率顯著降低(P<0.05)，藥物干預(yù)4周后，與模型組比較，中藥組和西藥組顯著增加抑郁大鼠糖水偏愛度(P<0.05)，中藥組和西藥組無明顯差異(P>0.05)。藥物干預(yù)4周后，與模型組比較，中、西藥組大鼠的自主、探索活動(dòng)明顯增加，曠場實(shí)驗(yàn)得分顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠糖水偏好與曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 各組大鼠TRP-KYN代謝通路分子含量變化比較

與空白組相比，模型組TRP、KYNA顯著降低(P<0.05)，與模型組相比，中藥組、西藥組明顯升高(P<0.05)；與空白組比較，模型組KYN顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，中藥組、西藥組明顯降低(P<0.05)，中、西藥組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

表3 各組大鼠血清TRP、KYN、KYNA的含量比較

與空白組相比，模型組3-HKYN、QUIN、3-HAA顯著升高(P<0.05)，與模型組相比，中藥組、西藥組3-HKYN、QUIN、3-HAA顯著降低(P<0.05)，中、西藥組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表4。

表4 各組大鼠血清3-HKYN、3-HAA、 QUIN的含量比較

與模型組比較，中藥組和西藥組KYN/TRP比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥組和西藥組較之模型組，KYN/QUIN比值增大(P<0.05)，KYN/KYNA比值減小(P<0.05)，中藥組和西藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

表5 各組大鼠TRP-KYN代謝通路KYN/TRP、 KYN/QUIN、KYN/KYNA比較

3 討論

中藥復(fù)方多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)抗抑郁，具有獨(dú)特的優(yōu)勢。中醫(yī)學(xué)通過辨證論治，認(rèn)為抑郁癥主要有肝郁氣滯、痰氣郁結(jié)、氣郁化火、心脾兩虛、肝腎不足等證型。臨床上相應(yīng)的治法為舒肝理氣、化痰解郁、補(bǔ)益心脾、滋養(yǎng)肝腎[5]。近年來研究表明，抑郁癥亦存在臟腑氣機(jī)失調(diào)，通過調(diào)理中焦脾胃，使氣機(jī)升降出入通暢，則諸郁得舒。本實(shí)驗(yàn)以此遣方，選用南北朝《集驗(yàn)方》溫膽湯化裁成加味溫膽湯，由半夏、竹茹、枳實(shí)、陳皮、茯苓、合歡花、石菖蒲等組成，全方理氣化痰和胃，健脾祛濕，調(diào)中行氣，驅(qū)化痰濁，則郁證自解[6]。本實(shí)驗(yàn)以此為理論基礎(chǔ)，研究加味溫膽湯的抗抑郁作用及對(duì)TRP-KYN代謝通路的影響。

現(xiàn)代研究表明TRP-KYN代謝途徑和抑郁癥之間有密切的聯(lián)系[7]。TRP 是人體內(nèi)的必需氨基酸，其分解途徑有5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)途徑和KYN途徑，約 95%的 TRP 在降解酶IDO或色氨酸 2，3-雙加氧酶(TDO)的作用下生成 KYN。Sch?fer A等[8]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)機(jī)體在應(yīng)激的情況下，體內(nèi)TRP減少而KYN生成增加。當(dāng)炎癥誘導(dǎo)IDO激活時(shí)，KYN更多的代謝為KYNA，大量耗竭TRP，使得可代謝生成5-HT的色氨酸減少，導(dǎo)致5-HT的生成不足[9]，進(jìn)而影響杏仁核功能，導(dǎo)致大腦皮層過度興奮，出現(xiàn)情緒焦慮、煩躁、失眠等抑郁樣癥狀。

KYN可在不同催化酶作用下形成TRP-KYN-3-HKYN和TRP-KYN-KYNA兩條代謝途徑。TRP-KYN-3-HKYN代謝途徑：是KYN在犬尿氨酸羥化酶的作用下生成3-HKYN，繼而由犬尿氨酸酶(KYNU)催化水解生成3-HAA，最后經(jīng)過多級(jí)酶促反應(yīng)生成QUIN、吡啶羧酸類及尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)等活性分子參與體內(nèi)各種生理過程。TRP-KYN-KYNA代謝途徑：是KYN在犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(KAT )的作用下，生成KYNA。QUIN是NMDA受體的內(nèi)源性激動(dòng)劑，機(jī)體QUIN增多會(huì)產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性作用，其水平升高可損傷神經(jīng)元的軸突，引起神經(jīng)的退行性病變，而TRP-KYN通路上的KYNA是NMDA受體的內(nèi)源性拮抗劑，能夠?qū)灌岬纳窠?jīng)毒性作用，具有神經(jīng)保護(hù)作用[10]。當(dāng)生理狀態(tài)時(shí)，兩代謝產(chǎn)物相對(duì)平衡；但當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激或者抑郁狀態(tài)時(shí)，KYN代謝傾向于TRP-KYN-3-HKYN途徑，神經(jīng)毒性作用增強(qiáng)，可致神經(jīng)退化甚至凋亡。本研究中CUMS抑郁大鼠TRP含量降低，KYN升高，具有神經(jīng)保護(hù)作用的KYNA含量降低、神經(jīng)毒性代謝產(chǎn)物3-HKYN、3-HAA、QUIN含量增高，加味溫膽湯組結(jié)果與模型組相反，但和西藥氟西汀組藥效相似。

IDO作為TRP-KYN代謝通路的限速酶，能降低色胺氨酸、升高犬尿氨酸含量，KYN和TRP的比值可作為判斷IDO活性的指標(biāo)[11]，比值越大，IDO活性越大，反之活性越小。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠KYN/TRP升高，中藥復(fù)方加味溫膽湯可以降低KYN/TRP比值，即可抑制IDO的活性。臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激等狀態(tài)下，免疫激活，IDO、犬尿氨酸酶、3-羥基氨基苯甲酸加氧酶的活性增加，導(dǎo)致KYN神經(jīng)毒性代謝產(chǎn)物增加，而神經(jīng)保護(hù)產(chǎn)物減少，促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的損傷退變，因此，可以通過KYN/KYNA、KYN/QUIN比值間接的判斷TRP-KYN通路中神經(jīng)保護(hù)/毒性的比例關(guān)系[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中，抑郁模型組大鼠血清KYN/KYNA比值升高，KYN/QUIN比值降低，加味溫膽湯組結(jié)果與模型組相反，但和西藥氟西汀組藥效相似。

本研究采用國內(nèi)外公認(rèn)且常用的CUMS抑郁模型[14]，通過觀測宏觀表征、檢測和抑郁癥密切相關(guān)的TRP-KYN代謝通路分子含量的變化，探究加味溫膽湯抗抑郁作用機(jī)制。結(jié)果顯示，加味溫膽湯能增加抑郁模型大鼠的糖水偏好值、提高曠場實(shí)驗(yàn)得分，具有確切的抗抑郁作用；血清分子檢測提示加味溫膽湯能促進(jìn)具有神經(jīng)保護(hù)作用代謝產(chǎn)物KYNA的生成，抑制具有神經(jīng)毒性作用代謝產(chǎn)物3-HKYN、3-HAA和QUIN的生成，升高KYN/QUIN比值，降低KYN/KYNA比值。

綜上所述，加味溫膽湯可能是通過調(diào)控TRP-KYN代謝通路，抑制神經(jīng)毒性代謝途徑，使代謝向神經(jīng)保護(hù)途徑傾斜，從而發(fā)揮抗抑郁作用。