姚培學(xué) 郭小旭 賀艷飛 歐陽瑤

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科呼吸一病區(qū)（貴州遵義563000）

近年來，肺部疾病已嚴重危害人類的身體健康，尤其是慢性阻塞性肺疾?。璺危?、肺癌、特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）、支氣管哮喘、肺結(jié)核等慢性肺部疾病，目前已成為全球人類死亡的主要原因之一，給社會和醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)［1］。據(jù)統(tǒng)計，2017年慢阻肺的死亡人數(shù)達320 萬，預(yù)計2040年每年將達到440 萬［2］。研究［3］顯示，我國40 歲以上人群慢阻肺的平均患病率為13.6%，女性為8.1%，男性為19.0%。肺部疾病管理和治療的主要挑戰(zhàn)之一是缺乏可靠、精確及有效的診斷方法。臨床表現(xiàn)、肺功能檢測和影像學(xué)檢查是診斷和評估肺部疾病嚴重程度的主要指標，然而，它們并不能診斷亞臨床疾病狀態(tài)。因此，迫切需要分子生物標志物來檢測肺部疾病的亞臨床和嚴重程度，有助于呼吸系統(tǒng)疾病患者的個體化治療。目前臨床上用于診斷的實驗室指標如C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原、可溶性髓系細胞觸發(fā)受體1 等缺乏特異性，因此不能對肺部疾病進行早期診斷，因而探索新的特異性生物標志物迫在眉睫。外泌體作為細胞外囊泡的主要類型，由于具有完整的雙層膜結(jié)構(gòu)，微環(huán)境對其干擾小，其內(nèi)包含大量的遺傳物質(zhì)，介導(dǎo)細胞間的通訊，使其在疾病診斷方面具有獨特的優(yōu)越性［4］。MiRNAs 是外泌體中主要的遺傳物質(zhì)，外泌體miRNAs 廣泛參與細胞凋亡增殖、免疫調(diào)節(jié)和新生血管形成［5-7］。外泌體miRNAs 可作為各系統(tǒng)疾病的診斷性生物標志物，尤其是肺部疾病，但其發(fā)病機制尚未明確，進一步探討其發(fā)病機制及靶向治療藥物，在臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

1 外泌體miRNAs

外泌體是納米級大小的膜性封閉囊泡，可由多種細胞通過胞吐作用釋放到細胞外形成［8］。HESSVIK 等［9］首次在成熟的羊網(wǎng)狀紅細胞中發(fā)現(xiàn)了這種囊泡，并將其命名為外泌體。外泌體廣泛分布于唾液、血液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和痰液等各種體液中［10］。通過查閱外泌體數(shù)據(jù)庫（http：//www.exocarta.org），不同物種來源的外泌體包含2 838 種miRNAs、3 408種mRNAs、41 860 種蛋白質(zhì)等多種生物活性分子。MiRNAs 是一類在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的短序、內(nèi)源性非編碼RNA，由21 ～25 個核苷酸組成，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達，廣泛參與細胞生長、組織分化、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生理或病理進程［11］，尤其在肺部疾病，如慢阻肺、支氣管哮喘、IPF、肺癌等。MiRNAs 在各種體液中以組織和細胞特異性的方式存在，由于具有特異性表達，與各系統(tǒng)疾病的診斷和預(yù)后密切相關(guān)［12］。特異性miRNAs 在肺部疾病中釋放入各種體液，可用于肺部疾病的監(jiān)測［7］。隨著外泌體研究領(lǐng)域的不斷深入，體液中外泌體miRNAs 擴增度的靈敏性增加，同時miRNAs 擴增出現(xiàn)陰性結(jié)果的可能性減少。成熟miRNAs 占外泌體總RNAs 的41.72%［13］，因此，外泌體可作為miRNAs 研究的可靠載體。外泌體主要通過旁分泌作用將攜帶的遺傳信息釋放到細胞外間隙，從而作用于供體細胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。供體細胞有一種特殊的分選機制來引導(dǎo)特定的miRNAs 進入外泌體，并對其中的目標基因進行“重編程”［14］。外泌體miRNAs 作為各種疾病的診斷性生物標志物，其主要的原因包括：（1）與循環(huán)中miRNAs 相比，外泌體miRNAs 具有高度穩(wěn)定性及富集性［15］；（2）外泌體miRNAs 能準確反映起始細胞的生理狀態(tài)和微環(huán)境，且大多數(shù)細胞能分泌大量特異性的miRNAs［16］；（3）外泌體可將miRNAs釋放到鄰近和遠端細胞中并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［12］；（4）外泌體的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)保護miRNAs 不被血漿核糖核酸酶的降解，使它們能夠在細胞外空間穩(wěn)定表達，有利于標本的采集和儲存［4］。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNAs 已成為細胞間通訊的重要參與者，并作為多系統(tǒng)疾病的生物標志物，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?7］、心血管系統(tǒng)疾病［18］、泌尿系統(tǒng)疾病［19］，尤其是肺部疾病［7］。根據(jù)細胞組織來源不同，外泌體miRNAs 具有不同的生物學(xué)特性，因此，不同肺臟細胞源性外泌體miRNAs 表達水平與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2 外泌體miRNAs 與肺部疾病

外泌體miRNAs 作為肺結(jié)核、慢阻肺、IPF、支氣管哮喘和腺病毒性肺炎等肺部疾病新的診斷性生物標志物具有潛在的研究前景。近年來，MiRNAs 包裹入外泌體、凋亡體和細胞微泡等細胞外囊泡的研究不斷引起研究者的興趣。研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNAs 通過影響受體細胞內(nèi)的信號通路，從而導(dǎo)致受體細胞功能的改變和病理狀態(tài)的發(fā)展［20］。因此，外泌體miRNAs 可作為肺部疾病潛在的診斷性生物標志物。

2.1 外泌體miRNAs 與慢性阻塞性肺疾病慢阻肺是一種慢性炎癥性肺部疾病，研究發(fā)現(xiàn)各種體液（包括血清、血漿和BALF）中的外泌體miRNAs可作為慢阻肺早期診斷、判斷病情嚴重程度和預(yù)后的特異性生物標志物。SUNDAR 等［21］研究發(fā)現(xiàn)吸煙的慢阻肺患者血漿中miR-22-3p、miR-151a-5p、miR-151b、miR-22-3p、miR-320b、miR-99a-5p、miR-320d 表達水平明顯升高，進一步研究發(fā)現(xiàn)外泌體中的miRNAs 通過調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）過程而參與慢阻肺的發(fā)生發(fā)展過程。XU 等［22］研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）可以誘導(dǎo)支氣管上皮細胞來源的外泌體成分發(fā)生改變，支氣管上皮細胞來源的外泌體miRNA-21通過靶向腫瘤抑制蛋白/缺氧誘導(dǎo)因子1α信號通路促進肌成纖維細胞的分化，從而導(dǎo)致氣道重塑，進一步證實吸煙者和慢阻肺患者血清中miRNA-21 的表達增加，且與第1 秒用力呼氣容積比用力肺活量（FEV1/FVC）呈負相關(guān)，說明外泌體miRNA-21可作為診斷和評估慢阻肺肺功能嚴重程度的生物標志物。HE 等［23］研究發(fā)現(xiàn)CSE 刺激支氣管上皮細胞分泌miRNA-21，可通過抑制M2 巨噬細胞的極化，從而間接調(diào)節(jié)EMT 過程而參與慢阻肺的發(fā)病過程。SERBAN等［24］發(fā)現(xiàn)CSE 可導(dǎo)致小鼠血漿和原代肺微血管內(nèi)皮細胞上清液中外泌體miR-191、miR-126、miR-125a 和let-7d 的表達增加，這些外泌體miRNAs 可通過調(diào)控巨噬細胞功能而影響慢阻肺的進展。綜上所述，慢阻肺患者及實驗動物體液中外泌體miRNAs 的表達水平均有升高，這說明可作為慢阻肺的診斷性生物標志物，但是外泌體miRNAs 參與慢阻肺氣道重塑的機制尚未明確，這些研究機制在慢阻肺的靶向治療中具有深遠的研究意義。

2.2 外泌體miRNAs 與支氣管哮喘支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)、可逆性氣流受限為特點的異質(zhì)性疾病。外泌體miRNAs 作為細胞間信息傳遞的重要中介，在支氣管哮喘的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。PUA 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘模型BALF 中外泌體miR-223 和miR-142a 表達顯著增加，同時證實支氣管哮喘小鼠模型BALF 中部分外泌體miRNAs 可能影響肺部炎癥而促進支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展，提示這些外泌體miRNAs 可作為支氣管哮喘的特異性診斷性生物標志物。另有研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)塵螨誘導(dǎo)的支氣管哮喘小鼠模型BALF 中外泌體miRNAs 的表達量增高8.9 倍，其中54 種外泌體miRNAs 在氣道和肺組織中呈負相關(guān)，且部分外泌體miRNAs 靶向作用于IL-13 基因，引起表達水平上調(diào)，從而促進支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展［26］。外泌體miRNAs 與炎性細胞相關(guān)哮喘及過敏原誘發(fā)的哮喘有關(guān)，主要通過氣道上皮細胞和支氣管平滑肌細胞的凋亡及增殖導(dǎo)致氣道重塑，但能否靶向作用于炎性細胞發(fā)揮作用有待進一步研究及探索。

2.3 外泌體miRNAs 與特發(fā)性肺纖維化IPF 是一種病因未明的彌漫性肺纖維化疾病，且致殘率、病死率高，極具侵襲性。NJOCK 等［10］研究發(fā)現(xiàn)IPF 患者痰液中外泌體miR-33a-5p、miR-142-3p、miR-145-5p 和miR-374a-5p 的表達水平顯著升高，而miR-92b-3p、miR-24-3p 、miR-26a-5p 和miR-30a-5p 的表達水平顯著降低，表明特異性外泌體miRNAs 對IPF 的診斷具有重要參考價值。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p 與一氧化碳彌散量與肺泡通氣量之比呈負相關(guān)，而let-7d-5p 水平呈正相關(guān)。MAKIGUCHI 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，IPF 患者血清中的外泌體miR-21-5p 顯著上調(diào)。這使得外泌體miRNAs可作為IPF 非侵入性的診斷性生物標志物，間接說明外泌體miRNA 具體促進纖維化的作用，但其具體機制不明，有待進一步研究，以指導(dǎo)相關(guān)靶向抗纖維化藥物應(yīng)用于臨床。

2.4 外泌體miRNAs 與肺結(jié)核肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性消耗性疾病，由于漏診及誤診率較高，不能早期有效規(guī)律的抗結(jié)核治療，從而嚴重的危害人類的身體健康。然而，目前診斷肺結(jié)核的方法由于缺乏其敏感性和特異性。因此，迫切需要新的生物標志物來幫助肺結(jié)核的早期診斷和治療。研究已證實外泌體miRNAs 可作為肺結(jié)核的診斷性生物標志物。ALIPOOR 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者血清外泌體miR-484、miR-425和miR-96 表達水平顯著升高，然而根據(jù)痰涂片陽性程度分析發(fā)現(xiàn)，隨著痰菌量增多，這3 種血清外泌體miRNAs 表達水平均有差異性，證實這3 種血清外泌體miRNAs 與結(jié)核分枝桿菌感染的嚴重程度密切相關(guān)。LYU 等［29］通過對60 例健康對照組、60 例潛伏期結(jié)核分枝桿菌感染患者（LTBI）和60 例活動性肺結(jié)核患者（ATB）血清外泌體miRNAs 的表達譜分析發(fā)現(xiàn)，LTBI 血清外泌體miR-let-7e-5p、miR-let-7d-5p、miR-450a-5p 和miR-140-5p 表達水平明顯升高，而ATB 血清外泌體miR-1246、miR-2110、miR-370-3P 和miR-28-3p、miR-193b-5p 表達水平顯著升高。另有研究發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體miRNAs 與電子健康記錄（EHR）相結(jié)合對結(jié)核病的診斷具有顯著的臨床意義，與對照組相比，結(jié)核病患者血漿中外泌體miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191 和miR-486 具有差異性表達，血漿外泌體miRNAs 的表達水平和HER 結(jié)合具有潛在的臨床診斷價值，且對肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異度分別為100%、84%［30］。綜上所述，外泌體miRNAs可作為肺結(jié)核的早期診斷性生物標志物及評估病情的嚴重程度，便于指導(dǎo)臨床早期治療，減少復(fù)發(fā)，改善患者的遠期預(yù)后及提高生存質(zhì)量。

2.5 外泌體miRNAs 與肺癌肺癌是呼吸系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率均居高不下，且年發(fā)病率明顯升高。外泌體miRNAs 可作為肺癌細胞與其他細胞之間信息交換的重要媒介，在腫瘤的病理過程中發(fā)揮著重要作用。LIU 等［31］通過10 例非小細胞肺癌（NSCLC）患者和10 例健康對照組研究發(fā)現(xiàn)，兩組之間存在30 個差異性表達的miRNAs，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體miR-23b-3p、miR-10b-5p 和miR-21-5p 與NSCLC 患者的總體生存率相關(guān)，可作為評估NSCLC 患者預(yù)后的生物標志物。ZHANG 等［32］發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者血清外泌體miR-17-5P 表達水平明顯高于健康對照組；同時，外泌體miRNAs 也可作為鑒別不同類型NSCLC 的生物標志物。進一步研究證實血漿中外泌體miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p 和miR-361-5p 是腺癌的特異性診斷性生物標志物，而血漿中外泌體miR-10b-5p、miR-15b-5p 和miR-320b可作為鱗癌的特異性診斷性生物標志物［33］。XUE等［34］研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肺腺癌患者血漿外泌體miR-484 表達水平明顯升高；與肺腺癌患者術(shù)前相比，肺腺癌患者術(shù)后血漿外泌體miR-484 表達水平顯著降低，提示血漿外泌體miR-484 有望成為肺腺癌診斷和預(yù)后的生物標志物。外泌體miRNAs 可作為肺癌的生物標志物，可應(yīng)用于肺癌的診斷和分型，但介導(dǎo)肺癌發(fā)病的機制尚未明確，若能探索清楚肺癌的發(fā)病機制，可進一步開發(fā)阻斷這些機制的藥物，從而降低肺癌的發(fā)病率。

2.6 外泌體miRNAs 與腺病毒性肺炎腺病毒性肺炎是由人腺病毒感染引起的間質(zhì)性肺炎，其發(fā)病率及病死率較高，然而腺病毒性肺炎在臨床的診療工作仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。因此早期診斷及早期治療能改善其預(yù)后，故探索其早期診斷的生物標志物具有深遠的研究意義。HUANG 等［35］研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒性肺炎患者全血中miR-629-3p、miR-223-3p 和miR-142-3p 表達水平明顯升高，這說明血源性miRNAs在腺病毒性肺炎中具有潛在的研究背景。HUANG等［36］通過實時熒光定量PCR 分析5 例腺病毒性肺炎患者和4 例健康對照組血清外泌體miRNAs 表達情況發(fā)現(xiàn)，腺病毒性肺炎患者血清中外泌體miR-450a-5p、miR-103a-3p、miR-103b-5p 和miR-98-5p 具有差異性表達，這說明外泌體miRNAs 可作為診斷腺病毒性肺炎的候選生物標志物。

3 總結(jié)與展望

隨著各種體液（血液、痰液、BALF 等）中外泌體miRNAs 的發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNAs 也成為慢阻肺、支氣管哮喘、IPF、肺結(jié)核、肺癌和腺病毒性肺炎等慢性肺部疾病早期診斷的研究熱點。經(jīng)過不懈的努力，目前國內(nèi)外對外泌體miRNAs 作為慢性肺部疾病的診斷性生物標志物取得新的進展，但仍處于初級階段，仍有問題急需解決：（1）外泌體miRNAs 與肺部疾病的發(fā)病機制研究尚淺，尚未系統(tǒng)、深入闡述。（2）缺乏簡單、有效的早期診斷手段和靶向治療藥物。（3）肺部疾病存在病因多樣、發(fā)病機制復(fù)雜等特點，目前尚未發(fā)現(xiàn)特異的外泌體miRNAs 作用靶點。（4）盡管體液中的外泌體miRNAs 可作為疾病早期診斷的潛在標志物，但大多處于基礎(chǔ)研究階段，且規(guī)模較小，缺乏大樣本和多中心的驗證。（5）現(xiàn)今分離和富集體液外泌體的技術(shù)和方法較多，但存在程序復(fù)雜、設(shè)備昂貴等問題，難以在臨床推廣應(yīng)用，使得外泌體miRNAs 的應(yīng)用也受到限制。為此，需要進一步系統(tǒng)研究各種體液中外泌體miRNAs 與肺部疾病的發(fā)病機制，為將來研究出帶有保護性物質(zhì)（抗炎/抗纖維化miRNAs）的外泌體用于治療肺部疾病。