李賽賽，楊陽，李家立，戴方圓，李芳赫，李平

連夏寧心方對心肌梗死大鼠左室重構及JAK1/STAT3信號通路的影響

李賽賽1，楊陽1，李家立2，戴方圓1，李芳赫1，李平1

1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 濟寧 272029

觀察連夏寧心方對心肌梗死大鼠左室重構及JAK1/STAT3信號通路的影響，探討其相關作用機制。采用結扎左冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型，將造模成功的18只SD大鼠隨機分為模型組、連夏寧心方組、塞來昔布組，另設假手術組，每組6只。連續(xù)給藥28 d，超聲心動圖測量大鼠心臟結構和功能，Masson染色檢測心肌膠原容積分數(shù)（CVF），HE染色觀察心肌細胞形態(tài)學變化，Western blot檢測JAK1、STAT3、核因子-κB（NF-κB）蛋白的表達。與假手術組比較，模型組大鼠左室射血分數(shù)（EF）和縮短分數(shù)（FS）顯著下降，左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）顯著增加，心肌纖維增生明顯，膠原過度沉積，心肌細胞排列紊亂，心肌間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，JAK1、STAT3、NF-κB蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，連夏寧心方組EF和FS升高，LVIDd降低，CVF明顯下降，心肌細胞排列較為整齊，炎性細胞浸潤程度明顯減輕，JAK1、STAT3、NF-κB蛋白表達顯著降低（＜0.05，＜0.01）。連夏寧心方可改善心肌梗死大鼠左室重構，其機制可能與下調(diào)JAK1/STAT3信號通路的表達有關。

連夏寧心方；心肌梗死；左室重構；JAK1/STAT3信號通路；大鼠

急性心肌梗死是心血管疾病極危重的表現(xiàn)類型，發(fā)病率和致死率逐年上升[1]。心肌梗死后左室重構可引起心力衰竭、心臟破裂等嚴重后果，是造成患者死亡的主要原因。盡管早期血運重建能明顯提高心肌梗死患者的生存率，但仍有大量患者發(fā)展為心衰[2]，因此，延緩或阻止左室重構是預防心梗后心衰的重要環(huán)節(jié)。JAK1/STAT3信號通路是細胞因子信號傳導的重要途徑，廣泛參與心肌細胞增殖、免疫、炎癥等過程，JAK1/STAT3信號通路介導炎癥反應與心肌梗死后左室重構關系密切[3-4]。連夏寧心方是北京中醫(yī)藥大學李平教授融合國醫(yī)大師路志正“調(diào)脾護心”學術思想和王永炎院士“毒損脈絡”理論并結合臨床經(jīng)驗總結而來，由黃連溫膽湯加減化裁，專為冠心病痰熱證而立。我們前期研究表明，連夏寧心方能明顯改善痰熱型冠心病患者的心絞痛癥狀，提高生存質(zhì)量，增加運動耐量[5]。本研究通過觀察連夏寧心方對心肌梗死大鼠左室重構的作用，探討其與JAK1/STAT3信號通路的關系，闡明其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于室溫22～24 ℃、相對濕度45%～65%環(huán)境，光照周期12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物

連夏寧心方由黃連6 g、姜半夏6 g、陳皮10 g、竹茹12 g等9味藥組成，北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。根據(jù)人與實驗動物臨床劑量的轉換系數(shù)，大鼠實驗用連夏寧心方劑量為140 mg/100 g。塞來昔布膠囊，輝瑞制藥有限公司，批號CJ6722。

1.3 主要試劑與儀器

注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，批號F6032104；兔單克隆JAK1抗體，美國Cell Signal公司，批號6G4-3344；兔多克隆STAT3抗體，美國Proteintech公司，批號10253-2-AP；兔多克隆核因子（NF）-κB抗體，美國Proteintech公司，批號10745-1-AP。小動物呼吸機（上海奧爾科特生物有限公司，型號ALC-V8S），Vevo770高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（Visual Sonics，Toronto，ONT Canada）。

1.4 造模

參照文獻[6]方法采用結扎左冠狀動脈前降支制備心肌梗死大鼠模型。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，備皮后插入氣管插管，連接小動物呼吸機，在第3～4肋骨之間，剪開皮膚，撕開肌肉，用開胸器撐開肋骨，分離心包膜，暴露心臟，提起左心耳，在左心耳下2 mm處用5/0手術線穿線并結扎左冠狀動脈前降支，結扎點以下心肌搏動減弱、心肌組織變蒼白、心電圖ST段弓背向上抬高并持續(xù)15 min以上作為評判心肌梗死造模成功的標志[7]。假手術組平行手術操作，但只穿線不結扎。術后腹腔注射青霉素4萬U，每日1次，連續(xù)3 d。

1.5 分組與給藥

術后24 h，將成模大鼠隨機分為模型組、連夏寧心方組、塞來昔布組，另設假手術組，每組6只。連夏寧心方組每日給予連夏寧心顆粒140 mg/100 g灌胃，塞來昔布組每日給予塞來昔布2.4 mg/100 g灌胃，假手術組和模型組給予生理鹽水灌胃，灌胃體積均為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)28 d。

1.6 指標檢測

1.6.1 心臟超聲檢測

給藥28 d后，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，運用Vevo770高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)對大鼠進行超聲心動圖檢測，選取左室短軸切面，由二維超聲引導M型曲線進行參數(shù)測量。記錄大鼠左室射血分數(shù)（EF）、左室縮短分數(shù)（FS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）。所有參數(shù)均在3個連續(xù)的心動周期中進行測量并取平均值。

1.6.2 心肌組織病理觀察

完成上述實驗后，將大鼠麻醉處死，快速取出心臟，用生理鹽水沖洗，大鼠均于心肌梗死邊緣區(qū)獲取心肌組織，4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，切片（厚度為4 μm）。①Masson染色觀察膠原纖維及肌纖維形態(tài)和分布。使用Image-Pro Plus軟件對獲得的圖片進行分析，心肌膠原容積分數(shù)（CVF，%）＝心肌膠原纖維面積÷所測視野組織總面積×100%。②HE染色觀察心肌梗死后心肌細胞形態(tài)，鏡下顯示細胞核被染成紫藍色，細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)被染成紅色。

1.6.3 Western blot檢測

取心肌梗死邊緣區(qū)心肌組織，加入RIPA裂解液，13 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA法測蛋白液濃度，各組蛋白液均上樣10 μL，經(jīng)SDS-PAGE分離至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋的JAK1抗體（1∶1000）、STAT3抗體（1∶2000）和NF-κB抗體（1∶2000），4 ℃孵育過夜，用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影檢測蛋白條帶，運用Fluorchem軟件對條帶進行光密度分析，目的蛋白相對表達量以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH比值表示。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 連夏寧心方對模型大鼠心臟超聲的影響

與假手術組比較，模型組大鼠EF和FS顯著下降（＜0.01），LVIDd和LVIDs顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，連夏寧心方組大鼠EF和FS明顯升高（＜0.05，＜0.01），LVIDd明顯降低（＜0.05），LVIDs有降低的趨勢，差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠心臟超聲比較（±s）

注：與假手術組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.2 Masson染色結果

心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色。假手術組心肌細胞排列整齊，組織致密，僅有少量膠原纖維；模型組心肌梗死邊緣區(qū)可見大量膠原纖維增生，呈條索狀，分割包繞心肌束，部分膠原纖維融合，與假手術組比較，模型組大鼠CVF顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）；與模型組比較，連夏寧心方組和塞來昔布組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)心肌間質(zhì)纖維化程度明顯減輕，CVF顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。結果見圖1、圖2。

2.3 HE染色結果

假手術組大鼠心肌肌束形態(tài)完整，纖維結構清楚，細胞質(zhì)染色均勻，細胞核邊界清晰；模型組心肌梗死邊緣區(qū)心肌細胞肥大、排列紊亂，心肌纖維斷裂，炎性細胞浸潤明顯；與模型組比較，連夏寧心方組和塞來昔布組大鼠心肌細胞排列較為規(guī)則，壞死心肌細胞和炎性細胞浸潤程度明顯減輕。見圖3。

2.4 Western blot檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織JAK1、STAT3、NF-κB蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，連夏寧心方組和塞來昔布組大鼠心肌組織JAK1、STAT3、NF-κB蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。結果見圖4、表2。

注：A.假手術組；B.模型組；C.連夏寧心方組；D.塞來昔布組

注：A.假手術組；B.模型組；C.連夏寧心方組；D.塞來昔布組；與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

注：A.假手術組；B.模型組；C.連夏寧心方組；D.塞來昔布組

注：A.假手術組；B.模型組；C.連夏寧心方組；D.塞來昔布組

表2 各組大鼠心肌組織JAK1、STAT3、NF-κB蛋白表達比較（±s）

注：與假手術組比較，**＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

3 討論

左室重構是指心肌梗死后左室大小、形態(tài)、結構和功能的變化過程，梗死區(qū)心肌壞死膨出，非梗死區(qū)心肌肥大、間質(zhì)纖維化、心室壁增厚，致使心室進行性擴張、變形和收縮功能障礙[8]。左室重構是心肌梗死發(fā)展為心力衰竭的重要病理生理過程，并貫穿整個病程的始終，是影響心肌梗死預后的重要因素。

心肌梗死屬中醫(yī)學“胸痹”“真心痛”等范疇。隨著生活節(jié)奏加快、飲食結構改變，致使痰濁內(nèi)生、郁久化熱，痰熱證型的發(fā)生逐漸增多[9]，臨床應重視痰熱型心肌梗死的存在。連夏寧心方由黃連、姜半夏、陳皮、竹茹等組成，具有清熱化痰、寧心安神功效，用于治療痰熱互結所致胸痹心痛，臨床療效確切[10-11]。本研究結果顯示，與模型組比較，連夏寧心方組可明顯提高心肌梗死大鼠EF和FS，抑制LVIDd，并且改善心肌膠原沉積，減輕心肌炎癥反應。提示連夏寧心方具有心臟保護和改善左室重構的作用。

炎癥在心肌梗死后左室重構中起著重要作用，JAK1/STAT3信號通路介導炎癥反應參與心肌梗死后左室重構。心肌梗死后，在機械拉伸和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)影響下，心肌細胞產(chǎn)生白細胞介素-6細胞因子家族，包括白細胞介素-6、心肌營養(yǎng)素1和白血病抑制因子等，細胞因子與其受體結合，刺激共同受體亞基gp130，激活JAK1激酶，導致其下游STAT3磷酸化，活化的STAT3形成同源或異源二聚體轉移到細胞核內(nèi)，進而啟動下游目的基因轉錄和表達[12]。NF-κB是STAT3的下游靶基因之一，是炎癥反應中的關鍵環(huán)節(jié)，NF-κB持續(xù)過度激活引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，促進左室重構的發(fā)生發(fā)展。應用JAK1/STAT3抑制劑AG490，可以降低NF-κB等炎癥因子的表達，減少心肌梗死后心肌重構[13]。本研究中，連夏寧心方組JAK1、STAT3、NF-κB蛋白表達較模型組顯著降低（＜0.01），表明連夏寧心方可降低心肌梗死邊緣區(qū)JAK1/STAT3信號通路的蛋白表達。該結果提示連夏寧心方可能通過抑制JAK1/STAT3信號通路發(fā)揮改善左室重構的作用。

塞來昔布作為環(huán)氧化酶-2（COX-2）的特異性抑制劑，可改善冠狀動脈疾病血管內(nèi)皮功能[14]，增強心肌梗死后抗氧化損傷能力，降低心肌細胞凋亡率[15]，研究表明，心臟重構的初始階段給予塞來昔布有助于維持壓力超負荷大鼠模型的心臟結構和功能[16]，延緩左室重構的發(fā)展[17]。本團隊通過網(wǎng)絡藥理學預測COX-2是連夏寧心方的主要作用靶點[18-19]，因此，本研究選用塞來昔布作為西藥對照組。有文獻報道，STAT3和COX-2信號通路存在相互促進的關系[20]，Xiong等[21]發(fā)現(xiàn)STAT3和COX-2之間存在正反饋環(huán)。中藥復方具有多成分、多靶點、多通路的特點，因此我們推測，連夏寧心方改善左室重構的作用機制可能與調(diào)控COX-2和JAK1/STAT3信號通路的綜合效應有關。信號通路之間有復雜的生物學關系，JAK1/STAT3與COX-2之間的具體調(diào)控機制尚需深入研究，進一步探索連夏寧心方改善心肌梗死后左室重構的潛在機制。

綜上，連夏寧心方能有效改善心肌梗死大鼠心臟功能，減輕心肌組織病理損傷，其作用機制可能與抑制JAK1/STAT3信號通路有關，為連夏寧心方的臨床運用提供了客觀依據(jù)。

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Effects ofPrescription on Left Ventricular Remodeling and JAK1/STAT3 Signal Pathway in Rats with Myocardial Infarction

LI Saisai1, YANG Yang1, LI Jiali2, DAI Fangyuan1, LI Fanghe1, LI Ping1

To observe the effects ofPrescription on left ventricular remodeling and JAK1/STAT3 signal pathway in rats with myocardial infarction; To explore its related mechanism of action.The model of myocardial infarction was established by ligating the anterior descending coronary artery. Totally 18 SD rats with successful modeling were randomly divided into model group,Prescription group, celecoxib group, and another 6 rats in sham-operation group, with 6 rats in each group. After 28 days of continuous treatment, echocardiography was used to measure cardiac structure and function in rats. Masson staining was used to detect myocardial collagen volume fraction (CVF). HE staining was used to observe the morphological changes of cardiomyocytes. Western blot was used to detect the expressions of JAK1, STAT3 and NF-κB proteins.Compared with the sham-operation group, the left ventricular ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS) of the model group significantly decreased, and the left ventricular end-diastolic inner diameter (LVIDd) and left ventricular end-systolic inner diameter (LVIDs) significantly increased, myocardial fiber hyperplasia, excessive collagen deposition, myocardial cell arrangement disorder, and myocardial interstitial inflammatory cell infiltration appeared. Expressions of JAK1, STAT3, NF-κB protein significantly increased (<0.01). Compared with the model group, the EF and FS significantly increased inPrescription group, while LVIDd and CVF were reduced. Myocardial cells were arranged neatly. The degree of inflammatory cell infiltration was significantly reduced, and expressions of JAK1, STAT3, and NF-κB protein were significantly reduced (<0.05,<0.01).Prescription can improve left ventricular remodeling in rats with myocardial infarction, and its mechanism may be related to the down-regulation of expression of JAK1/STAT3 signal pathway.

Prescription; myocardial infarction; left ventricular remodeling; JAK1/STAT3 signal pathway; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)12-0048-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005358

國家自然科學基金（81960852）；山東省自然科學基金（ZR2017BH063）

李平，E-mail：pearll2008@126.com

（2020-05-20）

（2020-06-22；編輯：華強）