肖傳豪

(1.濮陽職業(yè)技術(shù)學院，河南 濮陽 457000;2.河南大學 濮陽工學院，河南 濮陽 457000)

褪黑激素是一種重要的激素，被證明可調(diào)節(jié)大腦的晝夜節(jié)[1]、線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[2]、氧化應(yīng)激[3]和免疫[4]，因此實時監(jiān)測褪黑激素的濃度水平可為炎癥過程中的免疫調(diào)節(jié)機制提供有用信息。目前，褪黑激素的檢測方法主要有高效液相色譜法[5-6]、微透析與高效液相色譜聯(lián)用[7]法、電化學法[8-9]等，但這些方法檢測速度慢，且靈敏度不高。比色法具有簡單、可視化、無需復雜設(shè)備且檢測速度快的特點，深受科研工作者的青睞。

與純元素納米粒子相比，雙金屬納米粒子具有不同的組成和結(jié)構(gòu)，以及明顯的光學和催化性能，近年來受到廣泛關(guān)注[10-12]。由于氯金酸和納米銀之間可發(fā)生氧化還原發(fā)應(yīng)，使納米銀被氧化刻蝕成Ag+，同時Au3+被還原成Au沉積在刻蝕的納米銀表面形成雙金屬Ag-Au納米粒子，導致溶液吸光度減小，同時溶液顏色由黃色變成橘黃色;而當不同濃度的褪黑激素存在時，褪黑激素會作為抗氧化劑抑制氯金酸對納米銀的刻蝕，導致溶液吸光度增大，顏色由橘黃色變?yōu)辄S色。本文基于上述原理，以球形納米銀為比色探針，建立了一種簡單、高專一性和高靈敏度的檢測褪黑激素的比色分析方法，并將其用于人體尿液樣品的測定，結(jié)果滿意。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UV-2550型紫外可見(UV-Vis)吸收光譜儀(日本島津公司)；H-7560型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；掃描透射電子顯微鏡(STEM)(單元具有高角度環(huán)形暗場)(HAADF)探測器(美國FEI公司)。

硝酸銀、氯金酸(美國Sigma公司)；檸檬酸鈉、褪黑激素(阿拉丁試劑(上海)有限公司)；所有試劑均為分析純，無任何純化步驟；實驗用水為美國艾科浦公司生產(chǎn)的實驗室級超純水。

1.2 球形納米Ag的制備[13]

將10 mL甘油和40 mL水在100 mL燒瓶中混勻，置于95 ℃油浴中，以1 200 r/min的速度劇烈攪拌；然后向溶液中添加9 mg AgNO3，反應(yīng)1 min后，向混合物中注入1 mL 3%檸檬酸鈉；再將溶液置于95 ℃下攪拌1 h并冷卻至室溫，于4 ℃冰箱冷藏，備用。在475 nm處測定溶液吸光度值，根據(jù)朗伯-比爾定律確定納米銀溶液的濃度，其消光系數(shù)為2.7×108L/mol·cm。

1.3 實驗方法

將100 μL不同濃度的褪黑激素溶液、HAuCl4(50 μL，5 μmol/L)和50 μL B-R緩沖液(含0.04 mol/L磷酸、硼酸、乙酸和0.2 mol/L NaOH，pH 7.0)混合反應(yīng)60 min。然后加入800 μL納米銀溶液孵化15 min。以水為參比溶液，在室溫下記錄400～800 nm處的納米銀紫外吸收光譜，于475 nm處測定褪黑激素溶液吸光度(A)和不含褪黑激素溶液的吸光度(A0)，計算ΔA=A-A0。以ΔA為縱坐標，褪黑激素濃度的對數(shù)(lgC)為橫坐標繪制標準曲線，計算褪黑激素含量。

圖1 基于褪黑激素抑制納米銀刻蝕比色法檢測褪 黑激素原理示意圖Fig.1 Schematic of colorimetric detection of melatonin based on inhibition of Ag nanoparticles etching induced by melatonin

圖2 球形納米Ag(a)、納米銀-氯金酸(b)以及納米銀- 氯金酸-褪黑激素(c)的紫外吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of spherical Ag nanoparticles(a),Ag nanoparticles-HAuCl4(b) and Ag nanoparticles-HAuCl4-melatonin(c)

圖3 氯金酸氧化刻蝕前(A)后(B)的納米銀透射電鏡圖 及納米Ag加入氯金酸前(C)后(D)的元素映像圖Fig.3 TEM images of Ag nanoparticles before(A) and after(B) being etched by HAuCl4,and elemental mapping of Ag nanoparticles before(C) and after(D) addition

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

氯金酸和納米銀的氧化還原反應(yīng)見圖1，納米Ag表面被HAuCl4氧化刻蝕成Ag+，Au3+被還原為Au沉積在刻蝕的納米Ag表面，形成Ag-Au納米粒子，導致溶液吸光度降低，同時溶液顏色由黃色變?yōu)殚冱S色。當向體系中加入褪黑激素后，褪黑激素與氯金酸發(fā)生反應(yīng)，納米銀的氧化刻蝕被抑制[14-15]，使得溶液的吸光度增加，溶液顏色由橘黃色變?yōu)辄S色。因此可通過納米銀的刻蝕引起吸光度和顏色的變化來測定褪黑激素含量。

2.2 納米銀表征

相比于加入前(圖2曲線a)，將納米銀顆粒加入氯金酸中后，納米銀在475 nm處的溶液吸收峰顯著降低，并伴隨著紅移(圖2曲線b)，溶液顏色由黃色變?yōu)殚冱S色；繼續(xù)加入氯金酸和褪黑激素，相對于氯金酸-納米銀溶液的吸收峰，吸光度明顯增加，溶液顏色由橘黃色變?yōu)闇\黃色(圖2曲線c)，表明褪黑激素能有效抑制納米銀被氯金酸氧化刻蝕。從球形納米銀和氯金酸反應(yīng)前后的透射電鏡照片(圖3A、B)可見，反應(yīng)后的納米銀表面出現(xiàn)介孔，表明氯金酸能很好地刻蝕納米銀。另外，納米銀和氯金酸反應(yīng)前后的元素映像也證明納米銀被氯金酸刻蝕，同時生成的納米金沉積在納米銀表面形成了Ag-Au納米粒子(圖3C、D)。

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

褪黑激素的孵化時間和緩沖溶液pH值對方法靈敏度影響顯著，因此實驗考察了不同反應(yīng)時間(5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min)和不同pH值(2.90、3.05、3.43、4.47、5.27、6.34、7.00、7.50、8.04)的影響。結(jié)果顯示，475 nm處的吸光度值隨著反應(yīng)時間的延長呈先增加后降低的趨勢，在35 min時達最大值，表明此時褪黑激素和氯金酸反應(yīng)完全，因此，選擇褪黑激素的最佳反應(yīng)時間為35 min；另外,H3PO4-HAc-H3BO3緩沖溶液的pH值在2.90～8.04范圍內(nèi)變化時，475 nm處的吸光度隨著pH值增加逐漸增大，pH 7.00時接近最大值并趨于穩(wěn)定，表明納米銀被刻蝕的程度逐漸減小，抗氧化劑的作用逐漸增大。通過顏色變化也可證明此結(jié)果，所以選擇緩沖溶液的pH值為7.00。

圖4 褪黑激素溶液的紫外吸收光譜曲線Fig.4 UV-Vis absorption spectra of the solution containing different concentrations of melatonin

圖5 該比色傳感器對褪黑激素的選擇性Fig.5 Selectivity of the colorimetric sensor toward melatonin

2.4 靈敏度與線性范圍研究

在最優(yōu)條件下檢測不同濃度(0～1 mmol/L)的褪黑激素，其UV-Vis光譜見圖4。由圖可見，Ag-Au溶液在475 nm處的吸收峰隨著褪黑激素濃度的增加發(fā)生藍移且吸收峰值增加，同時溶液的顏色也從橘黃色變?yōu)辄S色，表明褪黑激素對氯金酸和納米銀之間的氧化刻蝕反應(yīng)有明顯的抑制作用。褪黑激素濃度(0.1 nmol/L～1 mmol/L)的對數(shù)值(lgC)與對應(yīng)吸光度變化值(ΔA)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔA=0.049 8+0.516lgC，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.996 4。以3σ(σ為標準偏差)計算得檢出限為0.09 nmol/L。相比于其它褪黑激素的檢測方法(如比色[16-18]、熒光[19]、表面增強拉曼[20]、電化學[21]和高效液相色譜法[5]),本法顯示出更寬的線性范圍和更低的檢出限。

2.5 選擇性實驗

實驗選擇尿液中常見物質(zhì)(如葡萄糖、抗壞血酸、尿素、多巴胺)為干擾物，驗證方法對褪黑激素檢測的選擇性。結(jié)果顯示，球形納米銀比色探針對1 μmol/L褪黑激素顯示出強烈的響應(yīng)，而對100倍濃度的葡萄糖、抗壞血酸、尿素、多巴胺的響應(yīng)很低，可以忽略(圖5)，表明該比色方法對褪黑激素具有很好的專一性。

圖6 尿液中含不同濃度褪黑激素的紫外吸收光譜曲線Fig.6 UV-Vis absorption spectra of the solution containing different concentrations of melatonin in urine

2.6 尿液中褪黑激素的測定

向空白人尿中添加一定量褪黑激素，在優(yōu)化條件下測定，考察該方法的實際應(yīng)用能力，結(jié)果見圖6。由圖可見，納米Ag-Au溶液的吸光度變化值(ΔA)與褪黑激素濃度的對數(shù)(lgC)在1～100 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔA=0.219+0.021 7lgC，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.975 3。另外，取葡萄樣品，過濾后稀釋，并分別添加不同濃度(0、1.0、10、100、1 000、10 000、100 000 μmol/L)的褪黑激素進行加標回收實驗，計算得樣品的平均回收率為97.0%～99.3%，相對標準偏差(RSD)不大于5.6%，表明本方法可用于實際樣品中褪黑激素的檢測。

3 結(jié) 論

本研究基于氯金酸和納米銀之間發(fā)生氧化反應(yīng)使溶液顏色發(fā)生變化，而褪黑激素可抑制上述氧化的原理，建立了一種檢測褪黑激素的簡單、高度靈敏和選擇性的比色法，并優(yōu)化了褪黑激素的反應(yīng)時間和緩沖溶液的pH值。在最優(yōu)條件下，褪黑激素的線性范圍為0.1 nmol/L～1 mmol/L，檢出限為0.09 nmol/L，可用于人尿液和葡萄中褪黑激素的測定。