陳冰婷，伊麗則熱·艾拜杜拉，李德龍，馬曉麗

(新疆醫(yī)科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830011)

目前，2 型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等代謝性疾病正在全世界范圍內(nèi)爆發(fā)[1-2]。作為一種慢性疾病，其呈現(xiàn)逐年激增及低齡化發(fā)病趨勢，嚴重危害公眾健康。糖尿病的具體發(fā)病機制尚未完全闡明，除高血糖外，脂質(zhì)代謝紊亂，炎癥、氧化應激等亦是重要因素[3]。所以對其有效防治具有重要意義。

作為流行且復雜的內(nèi)分泌和代謝性疾病[4-6]，T2DM的有效篩查、診斷、預后和干預具有挑戰(zhàn)性[7]。膽汁酸(BAs)作為一種內(nèi)源性信號分子在T2DM環(huán)境下發(fā)生改變，可影響相關(guān)代謝途徑，進一步影響糖代謝和胰島素分泌，可能與T2DM的發(fā)生、恢復有關(guān)[8-10]。多個研究已證明，在2型糖尿病患者中，BAs的特征表現(xiàn)出顯著變化[11-14]。由于BAs具有化學均一性、濃度范圍寬和殘留高的特性，使得開發(fā)一種高準確度和精密度的可靠快速的分析方法具有挑戰(zhàn)性[15]。在過去的10年中，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對BAs進行量化的方法有所增加[16-19]。目前運用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)針對膽汁酸代謝譜進行疾病診斷與治療屬于較為先進的技術(shù)手段。本實驗所采用的平行反應監(jiān)測(PRM)技術(shù)是一種基于高分辨、高精度質(zhì)譜的離子監(jiān)視技術(shù),相比于傳統(tǒng)的單/多反應監(jiān)測(SRM/MRM)技術(shù)，PRM技術(shù)將采集二級質(zhì)譜信息所用的四極桿質(zhì)量分析器替換為更高分辨和質(zhì)量精度的分析器，實現(xiàn)了從對目標離子檢測到全部目標離子碎片檢測的轉(zhuǎn)化,具有更高的再現(xiàn)性和定量準確度[20]。

本研究首次從膽汁酸代謝譜分析角度出發(fā)，基于UPLC-MS/MS 定量代謝檢測平臺，建立了血清中41種膽汁酸的定量檢測方法。將其應用于糖尿病患者及正常志愿者血清膽汁酸譜的檢測，并采用多元統(tǒng)計分析研究糖尿病患者與正常志愿者體內(nèi)的膽汁酸代謝差異，尋找糖尿病患者和健康對照者的潛在生物標志物，從而為糖尿病發(fā)病及機理研究提供新的思路。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈、乙酸(LC-MS級，CNW Technologies)；41種膽汁酸標準品(上海甄準生物科技有限公司)：脫氫石膽酸(DHLCA)、別石膽酸(alloLCA)、異石膽酸(isoLCA)、石膽酸(LCA)、23-脫甲脫氧膽酸(23norDCA)、7-酮基石膽酸(7-ketoLCA)、12-酮基石膽酸(12-ketoLCA)、原膽酸(apoCA)、熊去氧膽酸(UDCA)、豬脫氧膽酸(HDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、脫氧膽酸(DCA)、異脫氧膽酸(isoDCA)、脫氫膽酸(DHCA)、7,12-二酮石膽酸(7,12-diketoLCA)、6,7-二酮石膽酸(6,7-diketoLCA)、7-酮脫氧膽酸(7-DHCA)、12-脫氫膽酸(12-DHCA)、3-脫氫膽酸(3-DHCA)、熊果膽酸(UCA)、α-鼠膽酸(α-MCA)、β-鼠膽酸(β-MCA)、λ-鼠膽酸(λ-MCA)、別膽酸(ACA)、膽酸(CA)、甘氨石膽酸(GLCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)、甘氨豬脫氧膽酸(GHDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)、甘氨脫氫膽酸(GDHCA)、甘氨-λ-鼠膽酸(GλMCA)、甘氨膽酸(GCA)、?；鞘懰?TLCA)、?；切苊撗跄懰?TUDCA)、?；秦i脫氧膽酸(THDCA)、?；蛆Z脫氧膽酸(TCDCA)、?；敲撗跄懰?TDCA)、?；?α-鼠膽酸(T-α-MCA)、牛磺-β-鼠膽酸(T-β-MCA)、?；悄懰?TCA)；牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA-[D4]，內(nèi)標物)。

超高效液相色譜儀(1290 Infinity series UHPLC System，美國Agilent公司)；Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜、Heraeus Fresco17離心機(美國Thermo Fisher Scientific)；BSA124S-CW天平(德國Sartorius公司)；JXFSTPRP-24研磨儀(上海凈信科技有限公司)；純水儀(明澈 D24 UV，美國Merck Millipore公司)；PS-60AL超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)。

1.2 樣品采集與預處理

本研究所用80例血清樣本來自新疆醫(yī)科大學藥學院藥理教研室2007～2010年在和田地區(qū)、庫車縣、塔城地區(qū)的流行病學調(diào)查。隨機抽取30名2型糖尿病志愿者，50名正常志愿者作為對照組，其中糖尿病組30例，年齡(54±5)歲;對照組50例，年齡(49±5)歲。根據(jù)2006年WHO公布的糖尿病診斷標準診斷,并注意年齡、性別、種族、并發(fā)癥、病程的匹配和排除藥物的影響。

采集早餐前空腹靜脈血并離心(3 000 r/min，10 min)，分離血清，保存于-80 ℃冰箱中待測。樣本采集經(jīng)新疆醫(yī)科大學倫理委員會通過，研究對象均填寫知情同意書。

1.3 UPLC-MS/MS測定條件

色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國Waters公司)；柱溫：45 ℃，樣品盤：4 ℃；流動相：0.05%乙酸水溶液(A)-乙腈(B)。洗脫梯度：0～10 min，75%～71%A；10～26 min，71%～32.5%A；26～26.2 min,32.5%～1%A;26.2～28.4 min,1%～75%A。流速：0.40 mL/min；進樣體積：3 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，以PRM模式進行質(zhì)譜分析。離子源參數(shù)如下：噴霧電壓：-3 100 V,鞘氣(氮氣)壓力:40 V,輔助氣體(氮氣)壓力：15 V,輔助氣體(氮氣)溫度：350 ℃,毛細管加熱溫度：320 ℃。

1.4 血清中膽汁酸的UPLC-MS/MS分析

采用標準曲線定量時加入內(nèi)標的方法對整個處理步驟進行校正。

1.4.1 標準溶液的UPLC-MS/MS分析準確稱取相應量的膽汁酸標準品于10 mL容量瓶中，加入?；蛆Z脫氧膽酸(內(nèi)標物) 62.5 nmol/L，分別配制成10 mmol/L的標準品儲備液。取相應量的標準品儲備液于10 mL容量瓶中，配制成混合標準溶液。依次稀釋該混合標準溶液得到一系列校準溶液。

1.4.2 血清樣品的UPLC-MS/MS分析吸取100 μL血清樣品于EP管中，加入400 μL提取溶劑甲醇-乙腈(體積比1∶1，含1%甲酸和62.5 nmol/L內(nèi)標物)，渦旋混勻30 s，于冰水浴下超聲5 min，在20 ℃下靜置1 h，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取75 μL上清液至進樣小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。根據(jù)各標準品和內(nèi)標色譜峰面積的比值，通過標準曲線的線性回歸方程計算各膽汁酸的濃度。

1.5 方法學研究

1.5.1 標準曲線對“1.4.1”制備的一系列校準溶液進行UPLC-MS/MS分析。以目標化合物與內(nèi)標的峰面積比為Y，目標化合物的濃度為C(nmol/L)，采用最小二乘法進行回歸分析，權(quán)重設為1/C時，校準溶液的回收率和相關(guān)系數(shù)(r2)最好。若某一校準濃度的信噪比(S/N)接近或小于20，或回收率超出80%～120%范圍，則將該校準濃度排除。

1.5.2 檢出限及定量下限將校準溶液依次稀釋2倍后進行UPLC-MS/MS分析，通過信噪比計算方法的檢出限和定量下限。方法檢出限(LOD)定義為信噪比為3時所對應的化合物濃度，方法定量下限(LOQ)定義為信噪比為10時所對應的化合物濃度。

1.5.3 精密度由41種膽汁酸標準品混合制成質(zhì)量控制(QC)樣品，取QC樣品重復進樣分析8次，計算目標化合物的相對標準偏差(RSD)。

1.5.4 準確度將QC樣品所得峰面積分別代入標準品的標準曲線計算其實際濃度,以QC樣品實測濃度與理論加標濃度的比值計算方法回收率。

1.6 血清膽汁酸代謝譜分析與數(shù)據(jù)處理

取30例糖尿病患者和50例正常人血清樣本，應用所建立的方法對樣品中41種膽汁酸進行檢測，共檢出29種膽汁酸。

對原始數(shù)據(jù)進行處理,保留12個膽汁酸代謝物峰，利用R語言進行多元變量模式識別分析。采用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)進行統(tǒng)計分析，鑒別引起差異的主要變量，獲得糖尿病組與正常人之間血清膽汁酸代謝譜的差異。在驗證原模型適合后續(xù)分析后對差異代謝物進行識別，并進行受試者工作特征(ROC)分析以尋找潛在的生物標志物。

2 結(jié)果與討論

2.1 血清中膽汁酸的UPLC-MS/MS分析

進行UPLC-MS/MS分析之前，將目標化合物標準溶液引入質(zhì)譜中。針對每個目標化合物，對其PRM參數(shù)進行優(yōu)化；由于大多數(shù)膽汁酸類化合物的子離子譜中未出現(xiàn)強度足夠用于定量的子離子，因此選擇高分辨條件下的母離子Q1進行定量。41種膽汁酸標準品與內(nèi)標物的保留時間及質(zhì)譜條件見表1，在30 min內(nèi)可完成定量檢測。圖1為血清樣品的提取離子色譜圖。

表1 41種膽汁酸標準品的保留時間和質(zhì)譜條件Table 1 The retention times and mass spectrometric conditions of 41 bile acid standard solutions

圖1 血清樣品的提取離子色譜圖Fig.1 The extracted ion chromatogram(EIC) of serum samples

2.2 方法學考察

按照“1.5”進行方法學考察，結(jié)果見表2。由表2可知，41種膽汁酸在一定濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，檢出限(LOD)為0.24～7.81 nmol/L，定量下限(LOQ)為0.49～15.63 nmol/L，相關(guān)系數(shù)(r2)為 0.986 7～0.999 7。QC樣品重復進樣8次，所有目標化合物的RSD均不大于14%，平均回收率為87.5%～106%，表明該方法精密度和準確度良好。

表2 41種膽汁酸的線性范圍、回歸方程、r2、LOD、LOQ、RSD及回收率Table 2 The linear ranges,regression equations,r2,LOD,LOQ,RSDs and recoveries of 41 bile acids

2.3 代謝物的多元分析

使用SIMCA軟件(V15.0.2,Sartorius Stedim Data Analytics AB,Umea,Sweden)對數(shù)據(jù)進行OPLS-DA統(tǒng)計分析。由OPLS-DA模型的得分圖(見圖2A)可知，該組樣本區(qū)分顯著，樣本基本處于95%置信區(qū)間。隨后通過置換檢驗，隨機改變分類變量Y的排列順序，多次(次數(shù)n=200)建立對應的OPLS-DA模型以獲取隨機模型的模型解釋率(R2)和模型預測能力(Q2值)，糖尿病vs.正常組R2=0.04,Q2=-0.22(見圖2B)。Q2的回歸線與縱軸的截距小于0，隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機模型的Q2逐漸下降，說明原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過擬合，適合于后續(xù)分析的優(yōu)化。

2.4 差異代謝物識別及生物標志物預測能力評估

本實驗使用的卡值標準為t檢驗的P值(P-value)小于1，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(VIP)大于0。差異代謝物篩選的結(jié)果見表3，結(jié)果表明，糖尿病組(DH)與正常組(NH)間的膽汁酸代謝物有顯著差異,12個膽汁酸承載了分組的重要信息。

表3 差異代謝物篩選結(jié)果及ROC曲線下的面積(AUC)值Table 3 Significantly changed metabolites screening results and AUC values of ROC curve

為確定潛在生物標志物，對12個差異代謝物進行ROC分析，當該差異代謝物或差異代謝物的組合在上述判別中真陽性率足夠高，同時假陽性率足夠低時，認為該差異代謝物是潛在的生物標志物。ROC曲線下的面積(AUC)值越接近1，其臨床診斷效能越大，而當AUC<0.50時，基于該物質(zhì)的預測為反向預測。結(jié)果表明，?；蛆Z脫氧膽酸(AUC=0.68)、甘氨鵝脫氧膽酸(AUC=0.66)、甘氨熊脫氧膽酸(AUC=0.63)、膽酸(AUC=0.63)、脫氧膽酸(AUC=0.63)、甘氨脫氧膽酸(AUC=0.58)的臨床診斷效能較大，其中?；蛆Z脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、膽酸顯著下調(diào)，脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸顯著上調(diào)。

Liu等[21]的研究表明CDCA、DCA、LCA在調(diào)節(jié)BA動態(tài)平衡方面起著重要作用。Sonne等[22]發(fā)現(xiàn)餐后DCA的非結(jié)合形式和甘氨酸結(jié)合形式在T2DM患者的血清中有顯著差異。Choucair等[15]在血漿樣本的BA分析中發(fā)現(xiàn)DCA、GDCA在T2DM患者中顯著上升，與本研究中DCA、GDCA顯著上調(diào)的結(jié)果一致。有研究[23]認為?；撬峤Y(jié)合的膽汁酸在T2DM患者中含量較高，然而在本研究中TCDCA表現(xiàn)出下調(diào)趨勢。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、膽酸可作為潛在生物標志物。

結(jié)合上述分析，認為膽汁酸代謝譜與糖尿病存在相關(guān)性，其中?；蛆Z脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、膽酸、脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸的臨床預測能力更大，闡明這些膽汁酸的代謝異常與血糖間的關(guān)系，可為糖尿病的進一步研究提供更多信息。

3 結(jié) 論

本文利用UPLC-MS/MS 技術(shù)建立了膽汁酸代謝譜的快速分離檢測技術(shù)，在證實方法可行性后，利用其研究2型糖尿病患者血清的膽汁酸代謝水平。通過多元統(tǒng)計分析闡明膽汁酸的代謝物變化，最終尋找到6種膽汁酸(?；蛆Z脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、膽酸、脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸)可作為糖尿病的潛在診斷生物標志物，能為糖尿病發(fā)病及機理研究提供新的思路。