黃艷婷，莊 玥，邱蘊(yùn)綺

(廣東省藥品檢驗(yàn)所，國家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663)

隨著人們生活水平的提高和思想的開放，市面上出現(xiàn)成人用品的種類也日益繁多?？诜殃柈a(chǎn)品中非法添加現(xiàn)象經(jīng)過多年的稽查打假雖已得到抑制，但部分外用成人用品(潤滑油、延時噴劑)等卻得不到有效監(jiān)管。一些不法商家利用消費(fèi)者追求延長房事時間的心理，向外用產(chǎn)品中添加局麻藥成分以牟取暴利[1]，但長期大量使用有可能引起各種不良反應(yīng)，甚至可能引起癲癇、心律失常等嚴(yán)重后果，嚴(yán)重危及消費(fèi)者或其伴侶健康。局麻藥全稱為局部麻醉藥，是一類通過阻滯鈉離子通道，可逆性地抑制神經(jīng)沖動從而達(dá)到神經(jīng)阻滯作用的藥物，其根據(jù)中間鏈的不同，又可分為以普魯卡因?yàn)榇淼孽ヮ惥致樗?，以利多卡因?yàn)榇淼孽０奉惥致樗?，以及來源于桃金娘科植物丁香的有效活性成分丁香酚及其衍生物丁香酚類?類局麻藥。其中，酯類和酰胺類局麻成分的檢測方法有液相色譜法[2-7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8-9]、紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法等，丁香酚類有液相色譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、氣相色譜法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14]等，但這些方法大都局限于檢測一類局麻藥，未見同時檢測3類局麻藥的分析方法。

隨著液相色譜柱技術(shù)的不斷發(fā)展，利用核殼色譜柱在普通液相色譜上能達(dá)到提高分離效率和分離速度的效果[15-16]，具有成本低、短時間內(nèi)可同時測定多個不同類別成分含量等特點(diǎn)，更適合于基層快檢室和移動實(shí)驗(yàn)室等在現(xiàn)場檢測樣品?；诖?，本文采用核殼色譜柱建立了外用成人用品中16種局麻藥的高效液相色譜快速檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC 20-AT高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器)。甲醇為色譜純;磷酸、磷酸氫二鉀和庚烷磺酸鈉均為分析純。16種局麻藥標(biāo)準(zhǔn)品：普魯卡因(Procaine，CAS：59-46-1)、丁卡因(Tetracaine，CAS：94-24-6)購自Aladdin公司;異丁香酚甲醚(Methyl isoeugenol，CAS：93-16-3)購自天津希恩思生化科技有限公司;鹽酸氯普魯卡因(Chloroprocaine hydrochloride，CAS：3858-89-7)、鹽酸利多卡因(Lidocaine hydrochloride，CAS：73-78-9)、苯佐卡因(Benzocaine，CAS：94-09-7)、甲磺酸羅哌卡因(Ropivacaine mesylate，CAS：854056-07-8)購于中檢院;硫酸丁丙卡因(Butacaine sulphate，CAS：149-15-5)為Toronto Research Chemicals產(chǎn)品;普魯卡因胺(Procainamide，CAS：51-06-9)、丙胺卡因(Prilocaine，CAS：721-50-6)、丁吡卡因(Bupivacaine，CAS：2180-92-9)、鹽酸奧布卡因(Benoxinate hydrochloride，CAS：5987-82-6)、丁香酚(Eugenol，CAS：97-53-0)、鹽酸普莫卡因(Pramoxine hydrochloride，CAS：637-58-1)、地布卡因(Cinchocaine，CAS：85-79-0)為上海源葉生物有限公司產(chǎn)品；丁香酚甲醚(Methyl eugenol,CAS:93-15-2)購自Mackin公司;標(biāo)準(zhǔn)品含量均大于93.4%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取16種局麻藥成分標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用稀釋液(含0.1%鹽酸的甲醇溶液)配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的貯備液。定性鑒別時將各貯備液用稀釋液稀釋至25 mg/L;定量分析時將陽性成分貯備液用稀釋液稀釋成100、50、25、10、5 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

精密稱取1 g(精確至0.001 g)樣品，置于10 mL具塞比色管中，加入稀釋液(含0.1%鹽酸的甲醇溶液)適量，超聲處理15 min，冷卻至室溫，再用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，必要時離心。取上清液過0.45 μm濾膜，待測。若樣品中待測成分的濃度超出線性范圍，再用稀釋液適當(dāng)稀釋處理。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm×4.6 mm×2.7 μm);流動相：A為磷酸氫二鉀溶液(稱取2.28 g磷酸氫二鉀和0.41 g庚烷磺酸鈉，用水稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)至pH 3.0);B為甲醇-乙腈(體積比1∶1);梯度洗脫程序：0～8 min，95%～14%A;8～10 min，14%A;流速：1.5 mL/min;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL;檢測波長為210 nm(利多卡因、丙胺卡因、羅哌卡因、丁吡卡因和普莫卡因)和280 nm(其余成分)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm×4.6 mm×2.7 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm×2.7 μm)、Acchrom Alphasil VC-C18(100 mm ×3.0 mm×2.5 μm)和Acchrom Alphasil VC-C18(100 mm×4.6 mm×2.5 μm) 4種亞3微米色譜柱對16種局麻藥的分離情況。結(jié)果顯示：16種局麻藥在上述4種不同類型色譜柱的保留能力不同，通過優(yōu)化調(diào)節(jié)流速和梯度比例等色譜條件后，Poroshell 50 mm色譜柱中各成分能達(dá)到基線分離，Acchrom色譜柱中普魯卡因胺和丁卡因峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，其余色譜柱分析時間較長且丁吡卡因與鹽酸奧布卡因不能達(dá)到基線分離。因此，選擇Poroshell C18色譜柱(50 mm×4.6 mm×2.7 μm)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

由于16種局麻藥的DAD光譜不盡相同，其中利多卡因等5種成分在200 nm以上無特征吸收波峰，均在210 nm處紫外吸收較強(qiáng)，但210 nm處色譜基線波動較大。其余11種成分均在280 nm處有較強(qiáng)吸收，色譜峰面積更適合定量分析，且280 nm處色譜基線相對平穩(wěn)。綜合光譜及基線波動選擇210 nm(利多卡因、丙胺卡因、羅哌卡因、丁吡卡因和普莫卡因)和280 nm(其余成分)作為檢測波長。優(yōu)化條件下的16種局麻藥色譜圖見圖1。

2.2 流動相及稀釋液的選擇

由于16種局麻藥結(jié)構(gòu)差異較大，以磷酸氫二鉀為流動相時，丁吡卡因與鹽酸奧布卡因等色譜峰分離度較差，普魯卡因胺保留時間短而受基質(zhì)干擾，且普魯卡因類成分可能存在離子化分叉現(xiàn)象。因此，考慮向流動相中添加一定量庚烷磺酸鈉以增加保留，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值(2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH 3.0時各成分保留和分離效果最好。另外，實(shí)驗(yàn)還考察了甲醇、乙腈、水及其酸化溶液為稀釋液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響，發(fā)現(xiàn)以甲醇(含0.1%鹽酸)為稀釋液時能顯著抑制離子化現(xiàn)象，此時普魯卡因胺和氯普魯卡因峰形最好，所有成分的峰面積良好，適合定量分析，因此選擇含1%鹽酸的甲醇為稀釋液。

2.3 樣品提取

由于外用成人用品主要為潤滑液(油)、男用噴劑、男用濕巾等，樣品基質(zhì)較為簡單，實(shí)驗(yàn)通過考察甲醇、乙腈、水及其酸化溶液等[17]提取試劑，以及超聲、離心等操作，發(fā)現(xiàn)加入0.1%鹽酸的甲醇溶液后經(jīng)過簡單超聲即可完全提取目標(biāo)成分，同時滿足本方法在設(shè)備簡單的現(xiàn)場操作需求。

2.4 線性方程、檢出限及定量下限

取16種局麻藥的系列(質(zhì)量濃度為100、50、25、10、5 μg/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下測定，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。以3倍信噪比(S/N=3)計算方法檢出限(LOD)，以S/N=10計算定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，16種局麻藥在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均不低于0.999 7;其中，甲磺酸羅哌卡因響應(yīng)較小，LOD為3.1 μg/g，LOQ為10.2 μg/g;其余15種局麻藥的LOD均為1.0 μg/g，LOQ均為3.3 μg/g(表1)。

表1 16種成分的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、檢出限及定量下限Table 1 Linear range,correlation equation(r),recovery,detetion limit and quantitation limit of 16 compounds

2.5 回收率、精密度與穩(wěn)定性

取一個陰性樣品(延時噴劑)，分別向其中添加50、100、500 μg/g 3個濃度水平的16種局麻藥，在優(yōu)化條件下處理并測定，每個濃度水平平行實(shí)驗(yàn)6次，計算各化合物的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，16種局麻藥的平均回收率為93.3%～103%，RSD(n=6)為0.08%～ 1.2%，滿足非法添加化學(xué)成分檢測的技術(shù)要求。

另取一份500 μg/g回收溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果16種局麻藥峰面積的RSD均不大于1.2%，保留時間的RSD均不大于0.40%(相差不大于0.05 min)，表明方法重復(fù)性良好。將上述溶液室溫下放置2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣測定，計算得各成分峰面積的RSD均不大于1.4%，保留時間的RSD均不大于0.40%(相差不大于0.06 min)，表明各成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖2 代表性樣品譜圖(210 nm)Fig.2 Chromatogram(210 nm) of representative sample

2.6 實(shí)際樣品測定

從某網(wǎng)上商城收集44批樣品，在優(yōu)化條件下測定，結(jié)果顯示：久本時光寶盒男士噴劑、印度神油加強(qiáng)版男用噴劑、LDILD 男士噴劑和強(qiáng)獅男用抑菌噴劑檢出丁卡因(含量為0.2～14.9 mg/g);微愛男士抑菌噴劑和印度神油(女士試用裝)檢出丁香酚(含量分別為18.4 mg/g和1.9 mg/g);杜伊特358倍液(第三代)、Ivirgo男士外用噴劑和HOT噴劑檢出利多卡因(按鹽酸利多卡因計含量為2.5～14.5 mg/g);印度神油(男士試用裝)檢出利多卡因和丁香酚，按鹽酸利多卡因計含量為1.7 mg/g，丁香酚含量為7.1 mg/g。陽性樣品10批，檢出率22.7%。當(dāng)檢出陽性樣品時，可采用加標(biāo)回收驗(yàn)證，或采用液相色譜-質(zhì)譜等方法確證。

3 結(jié) 論

本研究以稽查關(guān)注較少的外用成人用品為研究對象，建立了同時測定16種非法添加局麻成分的液相色譜快速檢測方法。結(jié)果顯示，16種局麻藥成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不低于0.999 7，甲磺酸羅哌卡因的檢出限為3.1 μg/g，定量下限為10.2 μg/g，其余化合物的LOD均為1.0 μg/g，LOQ為3.3 μg/g；用其檢測市售44批外用成人用品，陽性檢出率達(dá)22.7%，均為延時噴劑和潤滑液，且大部分標(biāo)識為純天然、純中藥產(chǎn)品，存在嚴(yán)重的安全隱患。本方法操作簡單、準(zhǔn)確性高、分析時間短，可為此類產(chǎn)品現(xiàn)場監(jiān)督提供技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。