劉 靜，何洪源*，倪春芳，曹芳琦，趙海波,4，徐 琳

(1.中國人民公安大學(xué) 偵查與刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100038；2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場(chǎng)物 證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；3.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200083；4.太原市公安局迎澤分局，山西 太原 030045)

當(dāng)前，新精神活性物質(zhì)(NPS)在全世界范圍內(nèi)迅速蔓延[1]。合成卡西酮類新精神活性物質(zhì)是苯丙胺類興奮劑的β-酮類衍生物[2]。近年來，該類物質(zhì)作為傳統(tǒng)藥物和濫用藥物的“合法”替代品被越來越多地引入毒品市場(chǎng)[3]，已成為全球公共健康和生命安全的主要威脅之一[4]。病例報(bào)告和臨床研究表明，該類藥物會(huì)對(duì)人體的中樞神經(jīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激作用，長期使用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重精神疾病，甚至死亡。此外，為了獲得與管制毒品相同或更強(qiáng)的興奮、致幻等效果，其制劑通?；旌隙喾N結(jié)構(gòu)類似藥物，導(dǎo)致檢材成分復(fù)雜，實(shí)際檢驗(yàn)工作難度大。

本研究選取3,4-亞甲二氧基甲卡西酮(Methylone)、3,4-亞甲二氧基乙卡西酮(Ethylone)、4-氯甲卡西酮(4-CMC)和4-氯乙卡西酮(4-CEC)(見圖1)4種新興的卡西酮類新精神活性物質(zhì)進(jìn)行分析。其中，Methylone在其1號(hào)位的甲氨基末端增加1個(gè)—CH3可以形成Ethylone[5]，4-CMC在其1號(hào)位的甲氨基末端增加1個(gè)—CH3可以形成4-CEC，4種物質(zhì)兩兩之間的分子結(jié)構(gòu)差異小，相似度高，具有多個(gè)相同或相似的特征碎片離子，不易區(qū)分。在臨床上，Methylone作為抗抑郁和抗帕金森藥物使用，目前采用離子遷移譜(IMS)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)[6]、超高效液相色譜法(UHPLC)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10-11]、傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)和高分辨質(zhì)譜法(HRMS)進(jìn)行分析[12]；Ethylone已在國外濫用該類藥物致死的案件中檢出[13]，有報(bào)道用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(LC-QTOF MS)鑒定Methylone和Ethylone在陽性死亡病例尸體中的含量分布[14]，用摻硼金剛石電極分析法[13]、GC-MS法[15-16]對(duì)繳獲的Ethylone進(jìn)行分析；4-CMC是一種氯代卡西酮衍生物，報(bào)道中采用GC-MS[17-18]、HPLC-QTOF MS和UPLC-MS/MS進(jìn)行分析[19-20]；4-CEC是近年新興的娛樂產(chǎn)品，報(bào)道中采用氣相色譜-電子電離質(zhì)譜儀(GC-EI-MS)、液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(LC-DAD)、氣相色譜-化學(xué)電離質(zhì)譜儀(GC-CI-MS)和FTIR對(duì)繳獲的樣品進(jìn)行分析[21]，通過液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS/MS)和GC-MS進(jìn)行定性分析[22]。

目前同時(shí)對(duì)Methylone、Ethylone、4-CMC和4-CEC進(jìn)行定性定量分析的檢測(cè)方法尚未見報(bào)道，因此建立快速、準(zhǔn)確、同時(shí)檢測(cè)這4種藥物的方法具有重要的實(shí)際意義。本研究建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF MS/MS)同時(shí)檢測(cè)血樣中上述藥物的方法，可為卡西酮類新精神活性物質(zhì)的檢測(cè)鑒定提供重要依據(jù)。

圖1 4種目標(biāo)藥物的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure diagrams of four target drugs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Vion?IMS QTof超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國Waters公司);Vortex Genie-2渦旋振蕩器、Eppendorf Centrifuge 5810 R離心機(jī)(美國科學(xué)產(chǎn)業(yè)公司)。

Methylone、Ethylone、4-CMC和4-CEC均為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(上海市公安局物證鑒定中心)，保存于4 ℃冰箱中；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(HPLC級(jí)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；純水(ELGA純水制作儀制備)。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取Methylone、Ethylone、4-CMC和4-CEC(均為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液)各100 μL于同一容量瓶中，加入600 μL乙腈定容配成100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液，保存于4 ℃冰箱中，根據(jù)需要用甲醇逐級(jí)稀釋。

1.3 樣品前處理

移取不同質(zhì)量濃度的4種待測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL于10 mL離心管中，依次加入0.5 mL空白全血、0.2 mL純水和1.3 mL乙腈，渦旋振蕩1 min充分混勻后，于5 ℃以12 000 r/min離心15 min。用1 mL移液槍吸取上層液體置于進(jìn)樣瓶中，待檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件：Acquity UPLC?BEH C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，柱溫為40 ℃。流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水(5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈；進(jìn)樣量：1 μL，流速：0.4 mL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～5 min，5%～90%B；5～6 min，90% B；6～7 min，90%～5% B；7～8 min，5% B?？傔\(yùn)行時(shí)間為8 min。

質(zhì)譜條件：使用電噴霧電離(ESI)源，電噴霧電壓為3 000 V，正離子[M+H]+掃描檢測(cè)，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下，設(shè)置錐孔電壓為40 V，毛細(xì)管電壓為0.5 kV，離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，脫溶劑氣溫度為550 ℃，錐孔氣流速為50 L/h。每天對(duì)QTOF MS/MS進(jìn)行校準(zhǔn)。最佳質(zhì)譜檢測(cè)條件見表1。

表1 4種目標(biāo)藥物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 4 target drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

血樣中含有紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等，雜質(zhì)較多，基質(zhì)較為復(fù)雜，所以進(jìn)行前處理時(shí)要考慮如何提高所提取目標(biāo)物的純凈度，從而降低基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)保護(hù)儀器設(shè)備的使用壽命。有機(jī)溶劑沉淀蛋白法具有操作簡便、分辨能力高、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用沉淀蛋白法，為縮短前處理時(shí)間且保證處理效果，分別考察了不同離心時(shí)間(10、15、20 min)和不同轉(zhuǎn)速(10 000、12 000、14 000 r/min)下的前處理效果。結(jié)果表明，離心時(shí)間太短、轉(zhuǎn)速太慢，上清液均會(huì)略微渾濁，雜質(zhì)太多；離心時(shí)間太長、轉(zhuǎn)速太快，會(huì)導(dǎo)致血樣中細(xì)胞過度碎裂，上清液略呈紅色且渾濁。實(shí)驗(yàn)選擇離心時(shí)間為15 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，此時(shí)前處理效果最為理想。

圖2 4種目標(biāo)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of 4 target drugs mixed standard solution 1：methylone；2：ethylone；3：4-CMC；4：4-CEC

圖3 4種目標(biāo)藥物的MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of four target drugs A：methylone;B：ethylone;C：4-CMC;D：4-CEC

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究采用梯度洗脫程序，首先比較了流動(dòng)相B的初始比例分別為5%和10%的情況(0～1 min，5% B；1～9 min，5%～90% B；9～10 min，90% B；10～11 min，90%～5% B；11～12 min，5% B和0～1 min，10% B；1～9 min，10%～90% B；9～10 min，90% B；10～11 min，90%～10% B；11～12 min，10% B)，總運(yùn)行時(shí)間為12 min。結(jié)果表明，流動(dòng)相B的初始比例為5%時(shí)峰形更好。由于4種目標(biāo)物的出峰時(shí)間均較短，為節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，將洗脫總運(yùn)行時(shí)間從12 min調(diào)至8 min，即流動(dòng)相B的比例從5%升至90%的時(shí)間減少4 min，加快變化速度后，4種目標(biāo)藥物的出峰時(shí)間變短，且峰形拖尾情況有所改善。在“1.4”的最優(yōu)梯度洗脫程序下，得到4種目標(biāo)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子色譜圖(見圖2)及MRM色譜圖(見圖3)。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取4種目標(biāo)藥物100 ng/mL的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用電噴霧電離，MRM模式進(jìn)樣分析，分別考察了正離子[M+H]+掃描模式和負(fù)離子掃描模式。結(jié)果表明，4種目標(biāo)藥物在正離子[M+H]+掃描模式下的響應(yīng)強(qiáng)度均高于負(fù)離子掃描模式，所以選用正離子[M+H]+掃描檢測(cè)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察了不同錐孔電壓(30、40、50、60 V)的影響，結(jié)果表明錐孔電壓為40 V時(shí)效果最好。為減少基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)完全的基線分離和定性定量，考察了不同分辨率下的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖，結(jié)果顯示當(dāng)分辨率≥30 000可以滿足要求。優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.4”所示。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取9支離心管，3份為1組，共3組，依次加入0.5 mL空白全血、0.2 mL純水和1.3 mL乙腈，得到洗脫液1.5 mL(處理方法參照“1.3”)，再每組分別加入7.5 μL高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(甲醇配制)，測(cè)得其色譜峰面積S1；另取9支離心管，3份為1組，共3組，分別加入1.5 mL乙腈，每組分別加入7.5 μL高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(甲醇配制)，測(cè)得其色譜峰面積S2。計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME)：ME=S1/S2×100%。

按上述方法再取9支離心管，3份為1組，共3組，分別添加10 μL高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(甲醇配制)，并依次加入0.5 mL空白全血、0.2 mL純水和1.3 mL乙腈，按照“1.3”進(jìn)行樣品處理，測(cè)得峰面積S3，計(jì)算回收率：回收率=S3/S1×100%。再取高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行樣本各3份，按照“1.3”進(jìn)行樣品處理和“1.4”條件進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度在第1 d重復(fù)進(jìn)樣5次，后連續(xù)4 d每天進(jìn)樣1次，得到峰面積，并計(jì)算日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。在3種加標(biāo)濃度下，4種目標(biāo)藥物的基質(zhì)效應(yīng)為86.9%～117%，處于正常范圍內(nèi)(±20%)，說明建立的校正曲線能夠有效消除基質(zhì)干擾；回收率為87.3%～111%，日內(nèi)和日間RSD分別不大于8.1%和8.6%，準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好(見表2)。

表2 4種目標(biāo)藥物在血樣中的基質(zhì)效應(yīng)、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Matrix effects,recoveries and relative standard deviations of 4 target drugs in blood samples

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

在1 mL空白血液中依次添加4種目標(biāo)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配得各目標(biāo)藥物質(zhì)量濃度分別為5、10、50、100、200、500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“1.3”進(jìn)行樣品處理和“1.4”條件進(jìn)樣分析。選取權(quán)重為1/x2，以4種目標(biāo)藥物的峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x，ng/mL)分別進(jìn)行線性擬合。計(jì)算得到線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限(LOD，以S/N≥3計(jì))和定量下限(LOQ，以S/N≥10計(jì))(見表3)。由表3可知，4種目標(biāo)藥物在5～500 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 5，LOD和LOQ分別為2 ng/mL和5 ng/mL。

表3 血樣中4種目標(biāo)藥物的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 3 Linear relationships,LODs and LOQs of 4 target drugs in blood samples

2.6 方法應(yīng)用

為驗(yàn)證本方法的實(shí)用性，選取兩只雄性小鼠a(體重103 g)和b(體重106 g)。向小鼠a投喂含50 mg/g 4種目標(biāo)藥物的食物，小鼠b作為空白對(duì)照。2 h后，取兩只小鼠血液各0.5 mL，按“1.3”和“1.4”步驟進(jìn)行分析，小鼠a的血液中檢出Methylone、Ethylone、4-CMC和4-CEC的質(zhì)量濃度分別為13.3、32.6、10.2、19.8 ng/mL；小鼠b的血液中未檢測(cè)到4種目標(biāo)藥物。結(jié)果表明，本方法可以滿足含有4種目標(biāo)藥物的血液檢材的同時(shí)檢測(cè)要求。

3 結(jié) 論

本研究建立了血樣中Methylone、Ethylone、4-CMC和4-CEC 4種卡西酮類新精神活性物質(zhì)的UHPLC-QTOF MS/MS檢測(cè)方法。該方法能夠篩查血樣中的混合目標(biāo)物，并同時(shí)進(jìn)行定性、定量分析，可為法庭科學(xué)血液樣本中多種此類新精神活性物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)提供重要依據(jù)。