張麗娜，謝西月，柴雅琴*

(1.晉城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 晉城 048026；2.西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

癌癥是威脅人類健康的重要疾病之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白(α-Fetoprotein,AFP)在肝癌、大腸癌、胃癌、胰腺癌等癌癥患者血清中的濃度高于正常值(25 ng/mL)[1]，而且患者血清中AFP的濃度變化與病情發(fā)展變化有一定的關(guān)系，因此AFP作為一種廣譜性的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于臨床工作者在診斷病情、監(jiān)測(cè)治療以及預(yù)后效果等方面有一定的輔助作用。由于癌癥患者體內(nèi)AFP濃度較低，因此實(shí)現(xiàn)AFP的超靈敏檢測(cè)是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。迄今為止，常見的AFP檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法[2]、熒光免疫法[3]、化學(xué)發(fā)光免疫法[4]以及電化學(xué)免疫法[5]等。在眾多的檢測(cè)方法中，構(gòu)建具有分析時(shí)間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、可微型化等眾多優(yōu)點(diǎn)的電化學(xué)免疫檢測(cè)法一直是生物分析檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[6]。

生物酶作為一類具有催化活性的蛋白質(zhì)，在催化反應(yīng)過(guò)程中表現(xiàn)出高效、專一的特性。然而傳統(tǒng)生物酶易受溫度、pH值等環(huán)境因素的影響，且存在成本昂貴、易失活變性、生物體內(nèi)含量低等缺點(diǎn)，限制了其實(shí)際應(yīng)用。近年來(lái)，具有生物酶性質(zhì)的人工納米模擬酶受到了廣泛關(guān)注[7]。納米酶具有成本低、穩(wěn)定性高、催化性能相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。此外，納米模擬酶本身作為一種納米材料，賦予其固有的比表面積大，特殊的光、電等物理化學(xué)性能等，因此納米酶在生物傳感、分子檢測(cè)和疾病診斷等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的納米材料模擬酶包括貴金屬納米粒子、金屬氧化物、碳納米管、氧化石墨烯等，其應(yīng)用涉及到抗原、葡萄糖、DNA、細(xì)胞等多種目標(biāo)物的檢測(cè)，并展現(xiàn)出色的分析性能[8-11]。其中貴金屬納米材料因其表面含有豐富的活性位點(diǎn)、較強(qiáng)的催化活性和良好的生物相容性等特性引起了研究人員的興趣[12]。而將具有催化活性的貴金屬納米材料引入生物傳感領(lǐng)域，發(fā)揮其卓越的催化性能對(duì)于構(gòu)建傳感性能優(yōu)異的電化學(xué)傳感器具有重要意義。

本文以具有優(yōu)異電化學(xué)活性的鐵氰化鎳(NiHCFNPs)為電活性物質(zhì)[13]，利用傳統(tǒng)夾心反應(yīng)模式固載二抗，結(jié)合空心納米金(HAuNPs)和鉑鈀納米顆粒(PtPdNPs)的協(xié)同催化在電極上產(chǎn)生不溶性沉淀阻礙電子傳遞[14]，構(gòu)建了一種超靈敏的“signal-off”型電化學(xué)免疫傳感器。如圖1所示，首先，在空心納米金的表面通過(guò)半胱氨酸(L-Cys)作為連接劑固載鉑鈀納米粒子，并將其作為二抗(Ab2)納米載體。同時(shí)該復(fù)合納米材料表現(xiàn)出良好的H2O2催化性能，具有大比表面積的空心納米金既能充當(dāng)載體固載更多的辣根過(guò)氧化物模擬酶鉑鈀納米粒子，也可作為過(guò)氧化物模擬酶展現(xiàn)出極佳協(xié)同催化能力。其次，將NiHCFNPs通過(guò)靜電相互作用修飾到沉積金電極上作為電活性基底，然后在電極上沉積金用于捕獲抗體(Ab1)。基于夾心免疫模式，將具有辣根過(guò)氧化物酶活性的二抗耦合物HAuNPs-PtPdNPs-Ab2固載到修飾電極表面，在H2O2存在下催化4-氯-1-萘酚(4-CN)的氧化，并在鐵氰化鎳修飾的電極上生成大量不溶且不導(dǎo)電沉淀苯并-4-氯己二烯酮(4-CD)，有效地阻礙了電極表面的電子傳遞，得到急劇下降的電信號(hào)。隨著AFP的增加，電極上捕獲的HAuNPs-PtPdNPs-Ab2的量增多，在電極表面產(chǎn)生的4-CD沉淀導(dǎo)致NiHCFNPs修飾的傳感平臺(tái)電化學(xué)響應(yīng)受到抑制，實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建“signal-off”型傳感器對(duì)AFP的靈敏檢測(cè)。制備的傳感器具有良好的協(xié)同催化作用，通過(guò)提供一種多重信號(hào)放大的有效方法，體現(xiàn)出對(duì)AFP的良好靈敏度。

圖1 免疫傳感器的制備流程Fig.1 Schematic diagram of the immunosensor preparation process

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4，Au含量 40%～44% )、四氯鈀酸鉀(K2PdCl4，≥ 99%)、氯鉑酸(H2PtCl6，Pt含量≥ 37.5%)、牛血清白蛋白(BSA)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，≥ 99%)、抗壞血酸(AA，≥ 99%)、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O，≥ 98%)、過(guò)氧化氫(H2O2，≥ 30%)、4-氯-1-萘酚(4-CN，≥ 99%)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6，≥ 99%)、氯化鎳(NiCl2·6H2O，≥ 99%)、氯化鈷(CoCl2·6H2O，≥ 98%)、氯化鉀(KCl，分析純)購(gòu)于成都科隆化學(xué)公司；甲胎蛋白(AFP)購(gòu)于鄭州博賽生物試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

CHI 660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，H600透射電子顯微鏡(日本日立有限公司)。電化學(xué)工作站采用傳統(tǒng)的三電極體系：玻碳電極(GCE)及其修飾電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極。

1.2 鐵氰化鎳納米粒子(NiHCFNPs)的制備

根據(jù)文獻(xiàn)合成NiHCFNPs納米粒子[15-16]：首先配制含有0.05 mol/L KCl和0.05 mol/L K3Fe(CN)6的混合溶液；取70 mL混合溶液劇烈攪拌，逐滴滴加70 mL 0.01 mol/L NiCl2溶液后，劇烈攪拌5 min。然后高速離心分離并將固體洗滌3次，轉(zhuǎn)到真空干燥箱中干燥10 h。最后將得到的黃色粉末NiHCFNPs分散在PBS溶液中，置于4 ℃冰箱中留存待用。

1.3 二抗耦合物HAuNPs-PtPdNPs-Ab2的制備

空心納米金HAuNPs的制備參考文獻(xiàn)[17]：在N2氛圍下持續(xù)攪拌,以1 min的時(shí)間間隔將200 μL Na3C6H5O7·2H2O溶液(0.1 mol/L)、200 μL新制的NaBH4溶液(1.0 mol/L)、50 μL CoCl2·6H2O(0.5 mol/L)依次加入到50 mL水中。1 h后逐滴緩慢加入150 μL HAuCl4(0.1 mol/L)攪拌15 min，隨后在空氣中反應(yīng)30 min直至溶液呈深藍(lán)色后，離心并洗滌得到沉淀，然后用2 mL水分散保存?zhèn)溆谩?/p>

PtPdNPs的制備參考文獻(xiàn)方法[18]：將200 μL 2 mmol/L K2PdCl4溶液和40 μL 10 mmol/L H2PtCl6溶液加至2 mL 0.25 mmol/L CTAB溶液中。在攪拌下將1 mL 0.1 mol/L AA溶液滴加到上述溶液中，快速將所得混合溶液轉(zhuǎn)移至30 ℃水浴中加熱5 h。最后將制備的PtPdNPs離心分離并將所得固體洗滌。得到的沉淀重新分散在2 mL PBS溶液中，4 ℃冰箱留存待用。

二抗耦合物的制備過(guò)程如圖1所示：將上述合成的1 mL HAuNPs與1 mLL-Cys溶液(0.2 mol/L)混合，攪拌8 h獲得HAuNPs@L-Cys，然后在HAuNPs@L-Cys中加入1 mL PtPdNPs制得復(fù)合納米顆粒HAuNPs-PtPdNPs。將500 μL AFP抗體(Ab2)加入HAuNPs-PtPdNPs中，在4 ℃下輕微震蕩12 h，復(fù)合納米顆粒中的Pt和抗體中的氨基作用形成化學(xué)鍵，再用BSA封閉非特異性位點(diǎn)，從而制得二抗耦合物HAuNPs-PtPdNPs-Ab2。最后高速離心分離并將固體用PBS洗滌、分散，在4 ℃下儲(chǔ)存待用。

1.4 電化學(xué)夾心免疫傳感器的制備

首先，依次用0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁粉末拋光處理玻碳電極(GCE)，在超聲浴中用乙醇和水洗滌多次除去電極表面雜質(zhì)。接著將處理后的GCE在-0.2 V下浸入1% HAuCl4溶液中電沉積30 s，得到納米金粒子修飾的GCE(GCE-depAu)；利用鐵氰化鎳(NiHCFNPs)和沉積金之間的靜電吸附作用，將電活性物質(zhì)NiHCFNPs直接滴加至電極表面，干燥后形成一層NiHCFNPs膜(GCE-depAu-NiHCFNPs)；隨后將所得的GCE-depAu-NiHCFNPs電極再次在1% HAuCl4溶液中電沉積30 s，修飾上另一層納米金粒子層；將此修飾電極浸入200 ng/mL的抗體(Ab1)溶液中，在4 ℃下孵育12 h，Ab1通過(guò)Au-N鍵結(jié)合作用被固定在電極表面；用1% BSA封閉非特異性吸附位點(diǎn)，得到GCE-depAu-NiHCFNPs-depAu-Ab1-BSA修飾電極?；诳乖贵w之間的特異性識(shí)別作用，在修飾電極上滴加20 μL不同濃度的AFP抗原，在4 ℃下孵育1 h；之后在電極表面滴加20 μL二抗復(fù)合物HAuNPs-PtPdNPs-Ab2，4 ℃下孵育1 h，制備好的夾心式免疫傳感器儲(chǔ)存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

測(cè)試前將制備的夾心免疫傳感器浸入含1.0 mmol/L 4-CN和0.15 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中15 min，二抗中的HAuNPs和固載的PtPdNPs充當(dāng)辣根過(guò)氧化物模擬酶協(xié)同催化4-CN，在電極上產(chǎn)生不溶性沉淀物4-CD，阻礙電子傳遞，降低電流信號(hào)。電化學(xué)傳感器制備過(guò)程及電信號(hào)變化示意圖見圖1。

1.5 夾心免疫傳感器的測(cè)試方法

本實(shí)驗(yàn)采用三電極測(cè)定系統(tǒng)，選擇自制夾心免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，采用微分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行定量測(cè)定，電位掃描范圍為0～0.8 V；振幅0.05 V；脈沖寬度0.06 s；采樣寬度0.02 s。

圖2 空心納米金的TEM圖Fig.2 TEM image of HAuNPs

2 結(jié)果與討論

2.1 空心納米金(HAuNPs)的形貌表征

透射電鏡(TEM)是表征HAuNPs形貌的有力工具。從圖2中可以看出，HAuNPs呈球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部清亮但邊緣較暗，說(shuō)明合成的HAuNPs應(yīng)為空心球體結(jié)構(gòu)。

圖3 免疫傳感器制備過(guò)程的CV表征Fig.3 CV responses for each immobilized step a:bare GCE;b:depAu-GCE;c：NiHCFNPs-depAu-GCE; d：depAu-NiHCFNPs-depAu-GCE;e：Ab1-depAu-NiHCFNPs- depAu-GCE;f：BSA-Ab1-depAu-NiHCFNPs-depAu-GCE; g：AFP-BSA-Ab1-depAu-NiHCFNPs-depAu-GCE;h:Ab2 conjugate-AFP-BSA-Ab1-depAu-NiHCFNPs-depAu-GCE; i：h electrode treated by catalytic precipitation reaction in PBS solution (pH 7.4)

2.2 免疫傳感器修飾制備過(guò)程的界面表征

本文采用循環(huán)伏安法(CV)在PBS溶液中測(cè)定不同修飾電極的界面特性。如圖3所示，裸電極GCE和第一層納米金電沉積到電極上(depAu-GCE)，由于無(wú)電活性物質(zhì)，曲線(a～b)未產(chǎn)生峰值電流；當(dāng)Au-GCE上滴加電活性物質(zhì)NiHCFNPs后，曲線c可以觀察到1對(duì)良好的氧化還原峰；將第二層納米金電沉積到電極上，由于沉積金的優(yōu)良導(dǎo)電性，使得曲線d的峰電流增加；電極上依次修飾Ab1、BSA、AFP抗原后，電極氧化還原峰電流連續(xù)下降(曲線e-g)，這是由于蛋白質(zhì)層對(duì)電子傳輸?shù)淖璧K作用；當(dāng)二抗復(fù)合物HAuNPs-PtPdNPs-Ab2固定于電極表面，電子傳輸進(jìn)一步受到阻礙，曲線h可以觀察到1個(gè)明顯的電流降低響應(yīng)；組裝后的電極浸入含有1.0 mmol/L 4-氯-1-萘酚和0.15 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)溶液中15 min，電極表面產(chǎn)生不溶性沉淀物阻礙了電子傳遞，曲線i顯示峰電流值明顯下降。綜上所述，圖3中曲線a-i顯示該免疫傳感器已成功制備。

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

為了使免疫傳感器對(duì)AFP檢測(cè)表現(xiàn)出良好的性能，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在0.01 ng/mL AFP條件下，測(cè)試電活性物質(zhì)NiHCFNPs的不同修飾時(shí)間(20、40、60、80、100 min)對(duì)電化學(xué)響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，峰電流隨著時(shí)間的增加而逐漸增加。當(dāng)修飾時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)修飾時(shí)間，傳感器的電流響應(yīng)值基本不變，說(shuō)明NiHCFNPs在電極表面的修飾已達(dá)到飽和。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最優(yōu)的NiHCFNPs修飾時(shí)間為60 min。

圖4 免疫傳感器對(duì)不同濃度AFP的DPV響應(yīng)Fig.4 DPV responses of the immunosensor for different concentrations of AFP concentrations of AFP:0.000 1,0.001,0.01,0.1,1, 10,50,100,200 ng/mL;insert：calibration of the immunosensor for detection of AFP

圖5 免疫傳感器的選擇性Fig.5 The selectivity of the immunosensor

2.4 免疫傳感器對(duì)AFP抗原的響應(yīng)性能

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將制備的免疫傳感器在含有不同濃度AFP抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育1 h，再在PBS溶液中采用DPV進(jìn)行AFP檢測(cè)。如圖4所示，該傳感器的響應(yīng)電流隨目標(biāo)物AFP抗原濃度的增加而不斷減小，這是因?yàn)殡S著AFP濃度的增大，通過(guò)夾心免疫模式在電極上結(jié)合的二抗耦合物的量越多，從而導(dǎo)致HAuNPs和PtPdNPs協(xié)同催化4-CN在電極表面形成更多的不溶性沉淀物，阻礙了電子傳遞，導(dǎo)致電化學(xué)響應(yīng)降低。研究顯示，AFP在0.1 pg/mL～200 ng/mL范圍內(nèi)，該免疫傳感器的電化學(xué)響應(yīng)電流(I)對(duì)其質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)(lgc)具有較好的線性響應(yīng)，線性方程為：I=-16.78 lgc+46.94(r=0.995 1)，檢出限(S/N=3)為33 fg/mL。將該免疫傳感器的分析性能與之前報(bào)道的分析方法進(jìn)行比較(表1)，該傳感器顯示了更高的靈敏度，能實(shí)現(xiàn)AFP的痕量檢測(cè)。

2.5 免疫傳感器的選擇性與穩(wěn)定性

為了測(cè)試傳感器對(duì)AFP的選擇性，選用1 ng/mL的粘蛋白(MUC1)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特異抗原(PSA)作為干擾物，將孵育上述干擾物的傳感器DPV響應(yīng)信號(hào)與孵育0.01 ng/mL AFP的信號(hào)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示干擾物未對(duì)該免疫傳感器的響應(yīng)信號(hào)造成明顯影響(見圖5)，表明該傳感器對(duì)AFP具有良好的選擇性。

為研究傳感器的穩(wěn)定性，隨機(jī)選擇一支孵育了1 ng/mL AFP的電極連續(xù)循環(huán)掃描10圈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DPV響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.4%，說(shuō)明該修飾電極具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，將人體血清用pH 7.4 的PBS溶液稀釋50倍，配制4個(gè)不同質(zhì)量濃度的AFP溶液考察電化學(xué)免疫傳感器的性能，結(jié)果如表2所示。測(cè)得不同質(zhì)量濃度AFP的加標(biāo)回收率為98.0%～105%，RSD為1.9%～3.8%。表明該電極可應(yīng)用于實(shí)際樣品的初步測(cè)定。

表1 本方法和其他AFP檢測(cè)方法的性能對(duì)比Table 1 Performance of this work as compared to some reported AFP analytical methods

表2 免疫傳感器在人體血清中的回收結(jié)果Table 2 Recovery results of the proposed immunosensor in human serum sample

3 結(jié) 論

本文基于金屬模擬酶HAuNPs和PtPdNPs的協(xié)同催化作用，以NiHCFNPs為電化學(xué)信號(hào)物質(zhì)，構(gòu)建了一種用于超靈敏檢測(cè)AFP的電化學(xué)免疫傳感器。該實(shí)驗(yàn)成功制備HAuNPs-PtPdNPs復(fù)合材料并實(shí)現(xiàn)協(xié)同催化4-CN在電極表面形成沉淀物，實(shí)現(xiàn)對(duì)AFP的定量檢測(cè)。該電化學(xué)方法在測(cè)定AFP時(shí)表現(xiàn)出良好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性，在癌癥臨床診斷中具有廣泛的應(yīng)用前景。