張春香，王慧平，劉夢琴，申有名，谷 標(biāo)*

(1.湖南文理學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，湖南 常德 415000;2.衡陽師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 功能金屬有機(jī)化合物湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421008)

過氧亞硝酸鹽(ONOO-)是生命體中一種典型的活性氮物質(zhì)(RNS)，內(nèi)源性O(shè)NOO-由一氧化氮和超氧自由基在體內(nèi)偶聯(lián)反應(yīng)生成[1]。ONOO-在信號傳導(dǎo)中扮演著十分重要的角色，并表現(xiàn)消炎和殺菌作用。研究表明，體內(nèi)異常濃度的ONOO-與各種臨床疾病有關(guān)，如炎癥、心血管疾病、阿爾茨海默病和癌癥[2]。另外，由于具有強(qiáng)的氧化性，ONOO-會引起生物分子(包括細(xì)胞、蛋白質(zhì)、脂類和核酸)受損，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[3]。因此，開發(fā)高效的生物系統(tǒng)中ONOO-的檢測方法對于更好地了解其生理及病理學(xué)功能具有重要意義。

在眾多方法中，熒光探針因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、無損檢測和實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種很有前途的活體檢測方法[4]。迄今為止，已報(bào)道了許多以硼酸酯[5-6]、硒或碲[7-8]、肼[9]、N-(4-羥基苯基)氨基[10-11]、二苯基膦[12-13]、碳氮雙鍵[14]作為ONOO-識別基團(tuán)的熒光探針。雖然目前已在ONOO-檢測與成像方面取得了一些進(jìn)展，但仍存在一些值得關(guān)注的問題。其一，體內(nèi)ONOO-生命周期短(<10 ms)[15]，設(shè)計(jì)的探針應(yīng)能在溫和的條件下快速響應(yīng)ONOO-。然而，大多數(shù)ONOO-探針在檢測時(shí)表現(xiàn)出延遲響應(yīng)(≥5 min)[16-18]，難以捕獲瞬態(tài)的ONOO-，不利于生物系統(tǒng)中ONOO-的實(shí)時(shí)、原位檢測。其二，細(xì)胞內(nèi)ONOO-的穩(wěn)態(tài)濃度估計(jì)在nmol范圍內(nèi)，而化學(xué)活性相近的其他活性氧物種(ROS，如ClO-和H2O2)的穩(wěn)態(tài)濃度在μmol范圍內(nèi)，構(gòu)建的探針應(yīng)對ONOO-具有足夠高的選擇性和靈敏性。遺憾地是，已報(bào)道的一些ONOO-探針表現(xiàn)出對其它RNS/ROS的選擇性不足[19]，極大地限制了其實(shí)際應(yīng)用[20]。另外，一些探針合成復(fù)雜、純化困難、成本高昂，不利于推廣使用。因此，開發(fā)一種能解決上述問題的ONOO-熒光探針尤為必要。

2-(2′-羥基苯基)苯并噻唑及衍生物(HBT)作為熒光信號基團(tuán)具有許多顯著的光物理和化學(xué)性質(zhì)，如Stokes位移大、熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、結(jié)構(gòu)易修飾等[21]。鑒于目前ONOO-熒光探針存在的不足及苯并噻唑衍生物優(yōu)異的熒光性能，本文制備了一種2-(2′-羥基-3′-(1,1-二甲基腙)-5′-甲基苯基)苯并噻唑(BD)探針，該探針以HBT為熒光基團(tuán)，1,1-二甲基腙為識別基團(tuán)。探針BD由于識別基團(tuán)上的N—N單鍵旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生非輻射能量損失，導(dǎo)致熒光較弱。但在ONOO-氧化下，BD上的腙被水解成醛基，N—N單鍵脫落，熒光恢復(fù)。且探針BD對ONOO-的識別具有響應(yīng)快、靈敏度高和選擇性好的特點(diǎn)。此外，該探針具有良好細(xì)胞滲透性，適用于肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性O(shè)NOO-的熒光成像。本研究為生物體內(nèi)ONOO-的識別與成像提供了一種可靠、有效的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

核磁共振氫譜和碳譜由Bruker AVANCE-500M型核磁共振儀測得。高分辨質(zhì)譜通過Brucker APEX IV(7.0 T)FTMS型高分辨質(zhì)譜儀測得。紫外光譜和熒光光譜分別在UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)(Shimazu Co,Japan)和RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(Shimazu Co,Japan)上測定。細(xì)胞成像在共聚焦熒光顯微鏡(Leica TCS SP8,Germany)下拍攝。

1.2 探針BD的合成與表征

取一潔凈的圓底燒瓶(50 mL)，向其中依次加入BA(269 mg,1.0 mmol)、1,1-二甲基肼(83 μL,1.1 mmol)、哌啶(100 μL)和乙醇(15 mL)，然后將混合物回流反應(yīng)12 h。待反應(yīng)結(jié)束后，有固體析出，靜置1 h 后，用布什漏斗過濾。濾渣用乙醇沖洗3次后，得到純凈的淡黃色化合物BD(283 mg,91%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ13.10(s,1H),8.14(d,J=7.6 Hz,1H),8.07～8.05(m,2H),7.70(s,1H),7.55(t,J=8.0 Hz,2H),7.45(t,J=8.0 Hz,1H),7.39(d,J=7.6 Hz,1H),2.98(s,6H),2.53(s,3H)。13C NMR(126 MHz，CDCl3)：δ163.6、153.3、151.9、136.0、135.5、132.0、128.6、127.8、126.8、125.4、122.7、122.4、121.5、119.5、43.0、20.6?；衔顱D(C17H18N3OS+)的理論相對分子質(zhì)量為312.116 5，實(shí)測值為312.117 4。

1.3 光譜測試

樣品溶液的配制：向2 mL測試管中加入20 μLBD母液和適量體積的分析物母液(1 mmol/L)，再用PBS溶液(DMSO∶H2O=2∶8，體積比，pH 7.4)稀釋至刻度。然后轉(zhuǎn)移至比色皿(1 cm)中進(jìn)行光譜測試。在測試熒光發(fā)射光譜時(shí)，激發(fā)波長設(shè)定為425 nm。

1.4 細(xì)胞成像

將HepG2(肝癌細(xì)胞)細(xì)胞放置在培養(yǎng)液中(含100 g/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素以及10%小牛胚胎血清)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37 ℃，CO2含量設(shè)定為5%。在進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)之前，將HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中生長24 h。取一部分HepG2細(xì)胞與BD(10 μmol/L)共孵育30 min，作為空白組;另取一部分HepG2細(xì)胞與BD(10 μmol/L)共孵育30 min后，再與SIN-1(200 μmol/L，一種誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ONOO-的刺激物)共孵育30 min，作為實(shí)驗(yàn)組。用溫?zé)岬腜BS溶液(37 ℃，pH 7.4)沖洗細(xì)胞外殘留的探針。最后，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍攝兩組細(xì)胞的明場圖和熒光圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜表征

為了考察探針BD對ONOO-的響應(yīng)情況，測定了BD與ONOO-反應(yīng)前后的紫外光譜和熒光光譜。結(jié)果如圖1所示，探針在358 nm處有1個(gè)明顯的紫外吸收峰(εmax=0.59 ×104L·mol-1·cm-1)。然而，在加入ONOO-后，此處的吸收峰消失，與此同時(shí)，在425 nm處產(chǎn)生新的吸收峰(εmax=1.48×104L·mol-1·cm-1)，說明探針BD與ONOO-發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。探針BD自身熒光較弱(Φ=0.011，硫酸喹啉(Φs=0.58)作為標(biāo)準(zhǔn)物)，可能是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上的N—N單鍵旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生了非輻射能量損失。然而，在探針BD溶液中加入ONOO-后，于528 nm處出現(xiàn)1個(gè)明顯的熒光發(fā)射峰(Φ=0.316，硫酸喹啉(Φs=0.58)作為標(biāo)準(zhǔn)物)，這可能是由于探針BD在ONOO-氧化下，識別基團(tuán)脫落，有效地抑制了N—N單鍵旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的輻射能量損失。此外，探針BD與ONOO-反應(yīng)后，Stokes位移高達(dá)103 nm，在熒光測試中可有效避免自身熒光吸收和內(nèi)濾效應(yīng)。如圖1插圖所示，探針BD與ONOO-混合后產(chǎn)生明顯的顏色變化，進(jìn)而證明探針BD與ONOO-反應(yīng)產(chǎn)生了新的熒光物質(zhì)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針BD可以用來檢測ONOO-。

2.2 檢測機(jī)理

探針BD以苯并噻唑?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)，1,1-二甲基腙為識別基團(tuán)，基于BD與ONOO-反應(yīng)前后的光學(xué)變化，推測BD上的腙被ONOO-氧化水解成醛基，最終生成化合物BA。為了證實(shí)這一推斷，考察了BD與ONOO-反應(yīng)前后的高分辨質(zhì)譜，結(jié)果如圖2所示。BD在m/z=312.117 4處有1個(gè)強(qiáng)的分子離子峰。然而，與ONOO-反應(yīng)后，在m/z=270.059 0處出現(xiàn)1個(gè)新的、強(qiáng)的分子離子峰，該數(shù)值與化合物BA的理論相對分子質(zhì)量(m/z=270.058 3)一致，表明探針確實(shí)被ONOO-氧化水解成化合物BA。因此，提出如下檢測機(jī)理(圖3)：探針BD由于存在N—N單鍵旋轉(zhuǎn)，熒光較弱;然而在ONOO-存在下，BD上的腙被氧化水解化成醛，N—N單鍵脫落，熒光恢復(fù)。根據(jù)檢測體系熒光強(qiáng)度與ONOO-濃度的相關(guān)性，可實(shí)現(xiàn)對ONOO-的定量檢測。

圖3 探針BD檢測過氧亞硝酸鹽的機(jī)理示意圖Fig.3 The detection mechanism of ONOO- by probe BD

2.3 條件優(yōu)化

為了獲得最佳的靈敏度，對反應(yīng)時(shí)間和溶液pH值進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4A所示，探針BD與ONOO-在25 s內(nèi)反應(yīng)完全，如此快的響應(yīng)為機(jī)體內(nèi)ONOO-的實(shí)時(shí)、原位檢測提供了保障。pH值的影響如圖4B所示，在整個(gè)pH值范圍內(nèi)，探針BD對ONOO-具有較穩(wěn)定的熒光響應(yīng)，表明BD適用于生理pH值范圍。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇25 s作為探針與ONOO-的反應(yīng)時(shí)間，pH 7.4 的PBS 緩沖溶液作為檢測介質(zhì)。

2.4 靈敏性

在最佳檢測條件下，測試了探針BD(10 μmol/L)與不同濃度的ONOO-(0～14 μmol/L)反應(yīng)后的熒光光譜。隨著ONOO-濃度的增加，熒光發(fā)射光譜不斷上升。當(dāng)ONOO-的濃度超過10 μmol/L后，熒光達(dá)到飽和。更重要的是，檢測體系在528 nm處的熒光強(qiáng)度(Y)與ONOO-的濃度(X，0～10 μmol/L)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.090 42X+0.092 27，線性系數(shù)為0.999 87。根據(jù)檢出限計(jì)算公式[24]，得到方法檢出限為7 nmol/L。與文獻(xiàn)報(bào)道的其他ONOO-探針相比(表1)，探針BD具有較低的檢出限和較快的反應(yīng)速度。

表1 檢測ONOO-熒光探針的比較Table 1 Comparison of ONOO-fluorescent probes

2.5 選擇性

2.6 細(xì)胞成像

為了探究探針BD的生物應(yīng)用，進(jìn)行了活細(xì)胞熒光成像實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)HepG2細(xì)胞與BD(10 μmol/L)共孵育30 min后，細(xì)胞內(nèi)部熒光較弱(圖6A下圖)。然而，將負(fù)載BD的HepG2細(xì)胞與SIN-1(200 μmol/L)繼續(xù)孵育30 min后，可以觀察到明顯的綠色熒光(圖6B下圖)。通過明場成像圖(圖6B上圖)可知，細(xì)胞形態(tài)正常，說明BD具有優(yōu)異的生物相容性，可用于活細(xì)胞中內(nèi)源性O(shè)NOO-的熒光成像。

3 結(jié) 論

本研究以苯并噻唑?yàn)闊晒饣鶊F(tuán)，1,1-二甲基腙為識別基團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成了一種新型ONOO-熒光探針BD。該探針簡單易得，產(chǎn)率較高(91%)，對ONOO-的熒光分析具有響應(yīng)快速(25 s)，檢出限低(7 nmol/L)和選擇性高的優(yōu)勢。熒光成像結(jié)果證實(shí)探針BD可用于活細(xì)胞中ONOO-的實(shí)時(shí)、原位檢測。本工作為深入研究機(jī)體內(nèi)與ONOO-相關(guān)的生理與病理功能提供了一種強(qiáng)有力的方法。