胡文彥，徐道坤，劉 真，楊 軍，李春保，馮超彥

(1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 211198；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

肉類摻假是一個(gè)老生常談的話題，自古以來就有“掛羊頭，賣狗肉”的說法。目前已報(bào)道的摻偽方法包含低價(jià)肉冒充高價(jià)肉、用淀粉或其他材料添加香精后冒充食用肉以及非食用肉冒充食用肉等，這些采用常規(guī)的感官方法無法鑒別，嚴(yán)重?cái)_亂了市場(chǎng)秩序，給廣大群眾身心健康和經(jīng)濟(jì)利益造成了重大的損失。

20世紀(jì)80年代以來，人們開始研制并建立基于蛋白組學(xué)與基因組學(xué)的物種鑒別方法，其中包括電泳技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等[1-2]。然而，這些方法用于復(fù)雜深加工肉制品摻偽的批量檢驗(yàn)則顯得力不從心。ELISA雖然很靈敏，但由于食品加工過程引起的抗原決定簇的易感性和物種間的交叉酶聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致該方法應(yīng)用在肉源性鑒別中易產(chǎn)生假陽(yáng)性。食品加工過程、特別是超過100 ℃的加熱過程會(huì)導(dǎo)致DNA的降解反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生非特異性的片段[3]。基于DNA分析的PCR方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)，且存在被其他生物組織DNA污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)復(fù)雜基質(zhì)中的DNA提取也存在挑戰(zhàn)。與此相比，蛋白質(zhì)在加熱過程中比DNA穩(wěn)定性更好，它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)熱處理后相對(duì)穩(wěn)定，從而使蛋白質(zhì)相關(guān)的肉源性鑒別成為可能。

現(xiàn)有的研究報(bào)道多針對(duì)生肉，對(duì)熟肉及其加工品的穩(wěn)定特征多肽研究較少。本文將胰蛋白酶消化后的蛋白質(zhì)溶液加載到線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(LTQ-Orbitrap)，并根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)和Proteome Discover 1.4軟件搜索原始數(shù)據(jù)，借助高分辨質(zhì)譜(HRMS)和生物信息學(xué)工具從國(guó)內(nèi)消費(fèi)量最大的5種肉類(牛、雞、鴨、豬和羊肉)中分別篩選出特異性多肽標(biāo)記物，采用模擬加工樣品和串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)了14種熱穩(wěn)定性高、響應(yīng)好的多肽標(biāo)記物。這些多肽標(biāo)記物在生肉和熟肉中同時(shí)存在，其中有12種未見報(bào)道。利用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(HPLC-QQQ-MS)開發(fā)了一種無標(biāo)記的定量方法，高效液相色譜分離后使用多肽標(biāo)記物碎片離子的信號(hào)強(qiáng)度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。與現(xiàn)有的研究成果[4-5]相比，本方法無需合成多肽標(biāo)準(zhǔn)品，節(jié)約了檢測(cè)成本，且前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)可在2 d內(nèi)完成，適用于批量測(cè)試，具有較高的實(shí)用價(jià)值。經(jīng)驗(yàn)證，此方法可作為鑒別肉類加工品真?zhèn)巍⒃u(píng)價(jià)摻偽程度的有效工具。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Nano二維液相色譜LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Agilent 1290 UPLC-6495QQQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國(guó)Agilent公司)；XS205型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；0.22 μm微孔濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)；樣品粉碎儀(北京格瑞德曼公司)；均質(zhì)器(德國(guó)IKA公司)；冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Honeywell公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)ACS公司);二硫蘇糖醇(DTT)、胰蛋白酶(德國(guó)Sigma-Aldrich公司);尿素、硫脲、3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)、碘乙酰胺(IAA)和碳酸氫銨(NH4HCO3)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；C18固相萃取小柱(美國(guó)Waters Sep-Pak，500 mg/6 mL)；BCA試劑盒(Thermo Scientific公司)；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)(0.22 μm過濾膜 )過濾的超純水。

從菜場(chǎng)、超市隨機(jī)購(gòu)買5種肉類(牛肉、雞肉、鴨肉、豬肉和羊肉)樣品，含牛肉卷、羊肉卷、肉丸等，采用NY/T 3309-2018[6]進(jìn)行源性成分的確認(rèn)。確認(rèn)后的樣品去除脂肪，用樣品粉碎儀處理后在-20 ℃下保存?zhèn)溆?。通過均質(zhì)器將一種肉與另一種肉分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%和100%混合制備肉類混合物。在熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，分別將10 g肉在沸水中煮15 min以模擬水煮過程；在烤箱中230 ℃烤制5 min以模擬烘烤過程；在鍋中用花生油炸3 min以模擬油炸過程，然后進(jìn)行均質(zhì)，每種樣品平行制作6份。

1.2 蛋白質(zhì)提取

分別稱取上述制備后的樣品約1 g，加入5 mL含有2 mol/L硫脲、7 mol/L尿素和4%CHAPS的蛋白質(zhì)提取溶液，在冰浴條件下均質(zhì)5 min，保持4 ℃，12 000 g條件下離心15 min，收集上清液。使用BCA試劑盒，根據(jù)Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。

1.3 胰蛋白酶消化

參照測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度，取約100 μg當(dāng)量的蛋白質(zhì)提取溶液，用50 μL含有100 mmol/L DTT和100 mmol/L NH4HCO3的混合溶液在60 ℃下還原30 min，然后將混合物冷卻至室溫。在暗處用50 μL含55 mmol/L IAA和100 mmol/L NH4HCO3的混合溶液烷基化20 min。將胰蛋白酶(0.1 mg/mL，溶于25 mmol/L NH4HCO3溶液中)以1 μg胰蛋白酶∶100 μg蛋白質(zhì)的比例添加到溶液中，混勻后將混合物在37 ℃下孵育過夜。將酶解消化后的溶液通過C18固相萃取柱脫鹽，洗脫液經(jīng)氮?dú)飧稍铮瑥?fù)溶于含有3%乙腈和1%甲酸的1 mL水中，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4 特征多肽標(biāo)記物篩選

通過與Nano二維液相色譜結(jié)合的LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀分離得到各種肉類的特征多肽標(biāo)記物，將采集的數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)軟件分析獲得每種肉類的肽段信息，再經(jīng)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行確認(rèn)，在雞、鴨、牛、豬、羊肉中分別鑒定出92、142、207、184和126個(gè)特異性肽段，選擇每種肉類相對(duì)響應(yīng)值最好的20個(gè)肽段進(jìn)行下一步的適用性分析。

1.5 HPLC-QQQ-MS分析

1.5.1 色譜條件色譜柱為安捷倫Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈(含0.1%甲酸)，流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?～15 min，90%～60%A；15.1～18 min，60%～0%A；18.1～20 min，0%～90%A。單針總運(yùn)行時(shí)間為20 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓:3 500 V；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：16 L/min；霧化氣壓力：172.4 kPa(25 psi)；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；碎裂電壓：380 V；高壓離子漏斗電壓：150 V；低壓離子漏斗電壓：60 V。使用安捷倫Skyline軟件包預(yù)測(cè)所有肽生物標(biāo)記物的MS分析參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 多肽標(biāo)記物的提取

蛋白質(zhì)在加工過程中會(huì)產(chǎn)生降解，且水溶性差，提取難度較大，一般選擇混合比例的緩沖鹽溶液進(jìn)行提取。高濃度的尿素與硫脲的混合溶液可有效提高深加工肉制品中蛋白質(zhì)的提取效率[7]，結(jié)合已有方法[8]，本實(shí)驗(yàn)選擇硫脲、尿素和CHAPS為混合提取溶劑。蛋白質(zhì)分析時(shí)，酶的選擇也很重要，為保證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，應(yīng)確保所選目標(biāo)多肽在酶切時(shí)無漏切位點(diǎn)。胰蛋白酶通過在賴氨酸和精氨酸殘基的C—末端來切割肽,這兩種氨基酸也是美拉德反應(yīng)和蛋白質(zhì)交聯(lián)的主要參與者[9]，因此胰蛋白酶是獲得肉蛋白特征多肽的首選酶?？紤]到常規(guī)超濾法去鹽成本較高，嘗試使用反相硅膠C18固相萃取柱凈化的方式去除多余的鹽，不僅節(jié)約成本，還可避免未參與反應(yīng)的鹽對(duì)質(zhì)譜分析造成影響。需要說明的是，采用試劑盒法測(cè)量蛋白質(zhì)僅需在測(cè)定同一類產(chǎn)品的首次進(jìn)行，因同類別樣品的蛋白質(zhì)含量基本在同一水平，在同類型產(chǎn)品的批量測(cè)試中均可采用首次測(cè)試的預(yù)估量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這可在一定程度上增加本方法的適用性。

2.2 多肽標(biāo)記物的適用性驗(yàn)證

蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶水解后會(huì)產(chǎn)生很多肽段，但并非每條肽段均適用于MRM檢測(cè)。通常在肽段選擇時(shí)，肽段長(zhǎng)度應(yīng)控制在 8～25個(gè)氨基酸，同時(shí)避免肽段修飾。除了這些理論判據(jù)，還應(yīng)考慮肽段是否容易離子化及碎裂后碎片離子的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)可否滿足分析要求[10]。此外，盡管牛、雞、鴨、豬、羊物種不同，但所有物種可能存在同源蛋白，特定的氨基酸序列可在肌肉組織的各種蛋白質(zhì)中找到，加上NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中某些物種(如鴨和羊)的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)并不完整，導(dǎo)致通過計(jì)算機(jī)擬合篩選的特異性肽段在實(shí)際樣品特別是深加工肉制品中可能不存在，因此非常有必要對(duì)上述特征多肽開展適用性驗(yàn)證。

大多數(shù)肉類加工方法包含熱處理，不可避免地導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和降解，這在以往研究中得以證實(shí)[11]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)先考察各種加熱處理對(duì)所選多肽標(biāo)記物的影響。HPLC-QQQ-MS的MRM模式具有高靈敏度和穩(wěn)定性，常用于化合物的準(zhǔn)確定性與定量，已被用于肽段的分析[12]。首先借助Skyline軟件預(yù)測(cè)這些多肽的碎片離子與裂解能量，優(yōu)化液相色譜分離方法，通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，對(duì)其離子化效率和色譜行為進(jìn)行評(píng)估。按照本文的前處理步驟制作了1批模擬加工肉制品，提取多肽后進(jìn)行質(zhì)譜分析。每種肉類選擇1種典型的多肽標(biāo)記物進(jìn)行分析，生肉、水煮、烘烤和油炸處理后的色譜圖如圖1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各種加熱處理下，指定標(biāo)記物的信號(hào)只有雞、豬和羊肉在油炸時(shí)有所降低，特征離子響應(yīng)始終很強(qiáng)烈，無雜峰干擾，容易與其他峰加以區(qū)分。通過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其專屬性及熱穩(wěn)定性，將重復(fù)分析中不能重現(xiàn)或強(qiáng)度較弱的峰信號(hào)剔除。最終篩選出具有相對(duì)高響應(yīng)的14種特異性多肽標(biāo)記物(見表1)，其中每種肉類至少有2種不同的代表性肽段，可用于相互佐證。除了豬的DQGSYEDFVEGLR及牛的FLEELLTTQC已有文獻(xiàn)報(bào)道外[13]，其余12種肽段均為新的多肽標(biāo)記物。這些多肽標(biāo)記物是在生肉和熟肉中共有的穩(wěn)定物質(zhì)，可用于肉源性的定性鑒別與定量測(cè)試。

圖1 不同前處理下5種肉類多肽標(biāo)記物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of five meat peptide markers with different pretreatments A:chicken,B:duck,C:pork,D:sheep,E:beef;from top to bottom:raw meat,boiled,roasted and fried

SpeciesPeptide sequencePrecursor ion(m/z)Product ion(m/z)Retention time(min)Collison energy(eV)ChickenLVSWYDNEFGYSNR875.41 264.5*,1 101.514.07228.1,28.1ChickenIGDEFVADLDQLQR809.91 057.6*,958.512.47226.1,26.1ChickenLDVPISGEPAPTVTWK855.51 382.7,731.4*11.56627.5,27.5ChickenECQTLVSDVDYR742.8966.5*,853.49.52924.0,24.0DuckVVFDDSFDR550.2901.4,754.3*8.38018.1,18.1DuckIVESLQSSLDAEIR780.41 018.5*,890.59.64525.2,25.2DuckLAILENANVLAR648.9757.4*,886.510.53521.1,21.1PorkVNVDEVGGEALGR657.8887.5*,659.37.12421.4,21.4PorkDQGSYEDFVEGLR757.8835.4*,964.510.34624.5,24.5SheepSPPNPENIAPGYSGPLK869.41 342.7,1 243.7*7.95428.0,25.0SheepNLVHIITHGEEKD752.91 041.5,928.4*6.18824.3,24.3BeefTLEDQVNELK594.8845.4*,730.47.14219.4,19.4BeefGLSDSVSIGPVTVK679.9899.6*,800.59.46522.1,22.1BeefFLEELLTTQC762.9780.3*,893.410.54931.2,24.6

*quantitative ion

圖2 牛肉中添加鴨肉的校正曲線Fig.2 Calibration curve of duck added to beef matrix

2.3 定量方法

市售的肉糜類產(chǎn)品是非常容易摻假的品種，例如商販在牛肉丸中摻入少量的雞肉或鴨肉，經(jīng)過香料增味，消費(fèi)者在口感上很難分辨。因此建立一種定量評(píng)估肉類摻假程度的方法對(duì)于市場(chǎng)監(jiān)管具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在蛋白組學(xué)研究中，肽段定量的常規(guī)方法是使用同位素標(biāo)記的合成肽段進(jìn)行基于質(zhì)譜(MS)的絕對(duì)定量(AQUA)[14-15]，但該法成本高和費(fèi)時(shí)，本文嘗試開發(fā)一種適用于肉類摻假的更為簡(jiǎn)便和實(shí)用的無標(biāo)記蛋白質(zhì)定量方法。將兩種指定的肉類分別按0%、20%、40%、60%、80%、100%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))比例混合，經(jīng)過蛋白質(zhì)提取和胰蛋白酶消化后，用HPLC-QQQ-MS分析獲得響應(yīng)強(qiáng)度。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，混合肉類的比例為橫坐標(biāo)(x)擬合得到校準(zhǔn)曲線。圖2展示了鴨肉與牛肉按相應(yīng)比例混勻后，鴨肉目標(biāo)肽段VVFDDSFDR的校正曲線，線性方程為y=2 516.583 0x-26 250.514 4，相關(guān)系數(shù)r2=0.99，展示了良好的線性關(guān)系。更多常見摻假混合肉的校正曲線見表2，結(jié)果可見各種肉類兩兩混合后的相關(guān)系數(shù)(r2)均不低于0.95，可用于肉類摻假的定量測(cè)試。

2.4 靈敏度與回收率

在色譜分析中，一般采用計(jì)算各目標(biāo)物在空白基質(zhì)中信噪比(S/N)為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度獲得檢出限(LOD)，10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度獲得定量下限(LOQ)。參考現(xiàn)有的PCR標(biāo)準(zhǔn)方法[6]和文獻(xiàn)[16]中規(guī)定的最低檢測(cè)含量，選擇幾種代表性的摻假情形兩兩配對(duì)，按1%的檢出量(如將1 g鴨肉與99 g牛肉混合)，提取多肽標(biāo)記物后進(jìn)行分析，計(jì)算目標(biāo)多肽標(biāo)記物在另一種基質(zhì)肉中的信噪比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1%的添加水平下，所有目標(biāo)肽段的信噪比均超過100。在現(xiàn)實(shí)中添加低于1%的廉價(jià)肉不能帶來經(jīng)濟(jì)效益，制定過低的檢出限缺乏實(shí)際意義，因此本方法最終選擇1%作為測(cè)定低限，可保證方法靈敏度不低于現(xiàn)有的PCR標(biāo)準(zhǔn)方法，有效打擊欺詐行為。

在一種純?nèi)鈽悠分蟹謩e添加1%、5%和10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的目標(biāo)肉，混勻后按照本方法平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，選定的幾種典型混合肉在3個(gè)加標(biāo)水平下回收率為87.6%～105%，RSD均小于15%，可滿足日常批量定量檢測(cè)要求。

表2 幾種典型混合肉的方法學(xué)考察結(jié)果Table 2 Investigation results of several typical mixed meat

2.5 實(shí)際樣品測(cè)試

為驗(yàn)證方法的應(yīng)用性，從本地超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買36批典型的肉類產(chǎn)品，分別為14批牛肉卷、12批羊肉卷及10批標(biāo)示為牛肉丸的各種火鍋產(chǎn)品，重點(diǎn)檢查用豬肉、雞肉或鴨肉冒充的情況。樣品經(jīng)過預(yù)處理后，用HPLC-QQQ-MS檢測(cè)5種肉類的典型多肽標(biāo)記物。結(jié)果顯示，1批羊肉卷中未檢出羊的多肽標(biāo)記物，檢出鴨的特征信號(hào)，這批產(chǎn)品可能是用鴨肉冒充羊肉；1批牛肉丸中檢出明顯的雞的肽段信號(hào)，經(jīng)過定量分析，雞肉含量約占總重量的42%；另有1批牛肉丸中雞、鴨、牛、豬、羊5種肉類的信號(hào)均未檢測(cè)到，可能為其他不明肉類。以上結(jié)果均通過PCR標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行確認(rèn)，定性結(jié)果與本方法完全一致。

3 結(jié) 論

本文通過高分辨質(zhì)譜和數(shù)據(jù)信息化手段鑒定出雞、鴨、牛、豬、羊5種肉類的14種熱穩(wěn)定多肽標(biāo)記物，并建立了一種基于物種特異性多肽標(biāo)記物的無標(biāo)記定量方法。該方法可對(duì)生肉及加工肉制品的源性進(jìn)行鑒別和相對(duì)含量檢測(cè)，測(cè)定低限低至1%，檢測(cè)可在2 d內(nèi)完成，具有良好的穩(wěn)定性和應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)將開發(fā)其他食用肉類物種的特征性多肽標(biāo)記物，如鵝、狗、狐貍、貂等，進(jìn)一步拓展方法的應(yīng)用范圍，為打擊肉類產(chǎn)品摻假、維護(hù)市場(chǎng)公平競(jìng)爭(zhēng)提供技術(shù)支撐。